Articolo metodologico

Saggio di migrazione in vitro in tempo reale per cellule T CD8+ murine primarie

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DOI:

10.3791/66580

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24 maggio 2024

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1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce un metodo di isolamento primario delle cellule T murine e la microscopia time-lapse della migrazione delle cellule T in specifiche condizioni ambientali con analisi quantitativa.

Abstract

La risposta immunitaria adattativa dipende dalla capacità di una cellula T di migrare attraverso il sangue, la linfa e i tessuti in risposta a agenti patogeni e corpi estranei. La migrazione delle cellule T è un processo complesso che richiede il coordinamento di molti input di segnale provenienti dall'ambiente e dalle cellule immunitarie locali, tra cui chemochine, recettori per chemochine e molecole di adesione. Inoltre, la motilità delle cellule T è influenzata da segnali ambientali dinamici circostanti, che possono alterare lo stato di attivazione, il paesaggio trascrizionale, l'espressione delle molecole di adesione e altro ancora. In vivo, la complessità di questi fattori apparentemente intrecciati rende difficile distinguere i singoli segnali che contribuiscono alla migrazione delle cellule T. Questo protocollo fornisce una serie di metodi, dall'isolamento delle cellule T all'analisi assistita da computer, per valutare la migrazione delle cellule T in tempo reale in condizioni ambientali altamente specifiche. Queste condizioni possono aiutare a chiarire i meccanismi che regolano la migrazione, migliorando la nostra comprensione della cinetica delle cellule T e fornendo forti prove meccanicistiche difficili da ottenere attraverso esperimenti sugli animali. Una comprensione più profonda delle interazioni molecolari che influenzano la migrazione cellulare è importante per sviluppare terapie migliorate.

Introduzione

Le cellule T sono i principali effettori della risposta immunitaria adattativa antigene-specifica. A livello di popolazione, le cellule T sono eterogenee, composte da sottogruppi cellulari con funzioni specializzate distinte. È importante sottolineare che le cellule T CD8+ sono i principali effettori citolitici del sistema immunitario, che eliminano direttamente le cellule infette o disfunzionali1.

Le cellule T CD8+ mature risiedono nei tessuti e circolano nel sangue e nei linfatici alla ricerca di antigeni. Durante l'infezione, le cellule T vengono presentate con antigeni nel sangue o nei tessuti e drenano rapidamente nella milza o nel linfonodo drenante più vicino per iniziare una risposta immunitaria produttiva. In entrambi i casi, le cellule T si attivano, subiscono un'espansione clonale e lasciano il sistema linfatico per entrare nel sangue, se non già presente. Durante questo processo, la segnalazione intracellulare conferisce la sottoregolazione dei recettori di homing linfatico e la sovraregolazione di numerosi recettori delle integrine e delle chemochine essenziali per la migrazione tessuto-specifica2. In definitiva, la migrazione diretta delle cellule T verso i siti di infezione è guidata da segnali ambientali convergenti che includono la segnalazione di integrine e chemochine.

Le chemochine possono essere classificate in due classi principali: (1) segnali omeostatici, che sono essenziali per la differenziazione, la sopravvivenza e la funzione basale, e (2) segnali infiammatori, come CXCL9, CXCL10 e CCL3, che sono necessari per la chemiotassi. Generalmente, le chemochine creano un gradiente di segnale che guida la migrazione direzionale, nota come chemiotassi, oltre ad attivare l'espressione dell'integrina1. La chemiotassi è finemente regolata e altamente sensibile, con le cellule T in grado di rispondere a piccoli cambiamenti di gradiente che possono portarle verso una direzione o una posizione specifica.

Oltre a questi fattori correlati alle cellule T, la migrazione è influenzata anche dalla composizione e dalla densità della matrice extracellulare (ECM). La ECM è costituita da una fitta rete di proteine, tra cui collagene e proteoglicani, che forniscono l'impalcatura per i recettori delle integrine adesive sulle cellule T. Le integrine sono una famiglia diversificata di proteine transmembrana, ciascuna con domini di legame altamente specializzati ed effetti di segnalazione a valle. L'espressione dinamica dei recettori delle integrine sulla superficie di una cellula T consente un rapido adattamento ai loro ambienti mutevoli3. È importante sottolineare che le integrine collegano la MEC e le reti di actina citoscheletrica intracellulare che lavorano insieme per generare la forza propulsiva necessaria per il movimento delle cellule T.

In sintesi, i modelli di migrazione variano in base al fenotipo delle cellule immunitarie o ai segnali ambientali. Questi complessi processi biologici sono strettamente regolati dall'espressione di citochine, chemochine e integrine sulla superficie della cellula T, delle cellule circostanti e del tessuto locale infetto. In vivo, questi meccanismi migratori possono essere complessi e possono derivare da diversi segnali additivi4. A causa di questa complessità, può essere impossibile stabilire una relazione causale tra variabili apparentemente interconnesse. Per ovviare a ciò, esistono diversi approcci in vitro per studiare aspetti specifici della migrazione delle cellule T, come la risposta a specifici segnali di chemochine e l'interazione tra le integrine delle cellule T e le proteine leganti la ECM. Questo protocollo affronta metodi per isolare e attivare le cellule T CD8+ murine, con saggi di migrazione in vitro nello spazio bidimensionale e strumenti di analisi computazionale per l'analisi della migrazione delle cellule T specificate. Questi metodi sono vantaggiosi per l'utente perché non richiedono materiali o dispositivi sofisticati, come con alcuni altri saggi di migrazione cellulare descritti in letteratura. I dati sulla migrazione cellulare generati con questi metodi possono fornire prove di risposte immunitarie in modo semplicistico che consente ulteriori indagini informate in vivo.

Protocollo

I protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato universitario per le risorse animali dell'Università di Rochester. I topi in questo studio sono stati mantenuti nello spazio privo di agenti patogeni della struttura per animali dell'Università di Rochester. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi/femmine C57BL/6, di età compresa tra 6 e 12 settimane (15-30 g). L'isolamento del tessuto del topo può essere eseguito su un banco di lavoro con guanti per coprire le mani e una maschera facciale per coprire naso e bocca, o all'interno di una cabina di biosicurezza. Tutte le colture cellulari e la preparazione delle piastre devono essere eseguite in una cappa di biosicurezza. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Purificazione e attivazione delle cellule T CD8+

  1. Preparazione dei materiali
    1. Per la selezione negativa delle cellule T CD8+ : preparare un terreno di selezione negativo dal surnatante delle linee cellulari di ibridoma GK1.5 e anticorpi M5/114, che producono rispettivamente anti-CD4 e anti-MHCII. Miscelare il surnatante in rapporto 1:1, filtrarlo e conservarlo a 4 °C per un uso futuro (>0,5 μg di ciascun anticorpo/milione di cellule totali). In alternativa, sono disponibili kit commerciali per l'isolamento delle cellule T CD8+ .
    2. Per l'attivazione delle cellule T: aggiungere 500 μL di anticorpi CD3 (10 μg/mL) e CD28 (16 μg/mL) in 1x DPBS (senza calcio e magnesio) a una piastra a 24 pozzetti trattata con coltura non tissutale (TC) e conservare per una notte a 4 °C per garantire il legame della piastra.
      NOTA: Gli anticorpi e le proteine rivestono le piastre/piastre di coltura non trattate con TC meglio di quelle normali trattate con TC, quindi le piastre di coltura non trattate con TC vengono utilizzate per la generazione di cellule T.
  2. Preparare una piastra di coltura da 10 cm (o equivalente) inserendo un colino cellulare da 70 μm nella piastra ed erogare 2 mL di terreno R9 nel filtro (terreno R9: RPMI 1640x integrato con il 10% di FBS, l'1% di antibiotico-antimicotico, 20 mM di tampone HEPES, l'1% di MEM di aminoacidi non essenziali, 50 μM di β-mercaptoetanolo).
  3. Ottenere un topo con background genetico, sesso, età e peso appropriati come determinato dal disegno sperimentale.
  4. Eutanasia del topo utilizzando CO2 seguita da lussazione cervicale o strategie di eutanasia appropriate come definito dai protocolli locali di cura e utilizzo degli animali e approvati dall'istituto.
  5. Posiziona il mouse in posizione supina, allunga tutti e quattro gli arti perpendicolarmente al corpo e fissa i piedini a una tavola di dissezione utilizzando i perni a T di dissezione del mouse o equivalenti. Praticare un'incisione superficiale centrale attraverso lo strato cutaneo sul basso ventre ventrale con le forbici da dissezione chirurgica del topo e tagliare fino al mento (~8 cm). Separare la pelle dal rivestimento peritoneale per esporre i linfonodi. Allungare la pelle perpendicolarmente lontano dal tronco e fissarla5.
    1. Asportare delicatamente i linfonodi cervicale, assiale, brachiale e inguinale bilateralmente utilizzando una pinza smussata (o il tipo preferito da un kit di dissezione chirurgica standard per topi). Trasferire nel colino preparato al punto 1.2.
    2. Aprire il peritoneo e rimuovere la milza. Trasferire nel colino preparato al punto 1.2.
    3. Smaltire la carcassa del topo nell'apposito contenitore per il rischio biologico.
  6. Preparare una sospensione unicellulare dei tessuti linfoidi secondari mediante disgregazione meccanica sul filtro cellulare da 70 μm con 2 mL di terreno R9 dal passaggio 1.2 ruotando ripetutamente lo strumento di disgregazione tissutale di mezzo giro in senso orario e antiorario.
    NOTA: L'estremità dello stantuffo di una siringa luer-lock, da 3 ml o 10 ml, funziona bene per frantumare e omogeneizzare il tessuto. Materiali alternativi possono essere utilizzati a discrezione dell'utente.
  7. Lavare le cellule, l'estremità della siringa, il colino e la piastra di coltura con 7 mL di terreno, assicurandosi che il filtro rimanga in posizione verticale per evitare il trasferimento di pezzi più grandi di tessuto o aggregati cellulari che potrebbero essere presenti nella sospensione a cellula singola.
  8. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
  9. Pellettare le celle a 270 x g a temperatura ambiente (20 °C) per 5 minuti e decantare il surnatante.
  10. Aggiungere 500 μl di tampone di lisi per 1 minuto per rimuovere i globuli rossi. Diluire con 9,5 mL di terreno R9 e centrifugare a 270 x g (20 °C) per 5 min. Decantare il surnatante.
  11. Risospendere il pellet in 10 mL del terreno di selezione negativo precedentemente preparato contenente anti-MHCII e anti-CD4 (passaggio 1.1.1). Agitare a temperatura ambiente (20 °C) per 30 min.
  12. Pellettare le celle a 270 x g per 5 minuti e decantare il surnatante. Lavare 3 volte con 10 ml di terreno R9.
  13. Contemporaneamente, in una provetta conica da 15 mL, lavare 200 μL di perle di IgG anti-ratto di pecora in 7 mL di terreno. Posizionare il tubo su un magnete, rimuovere il mezzo e ripetere la fase di lavaggio due volte. Risospendere le perle in 7 mL di terreno R9.
  14. Pellettare le celle a 270 x g (20 °C) per 5 minuti, decantare il surnatante e quindi risospendere il pellet in 7 mL di sospensione a perle dal passaggio 1.13. Agitare a temperatura ambiente (20 °C) per 45 min.
  15. Arricchire le cellule T CD8+ mediante deplezione delle biglie magnetiche. Posizionare il tubo conico direttamente sul magnete senza coperchio per 3 minuti per rimuovere le cellule legate all'anticorpo/perline. Le cellule CD8+ devono essere mantenute. Con la provetta ancora inserita nel magnete, raccogliere la sospensione cellulare utilizzando una pipetta sierologica o equivalente e trasferirla in una nuova provetta da 15 mL. Centrifugare a 270 x g (20 °C) per 5 minuti e lavare 3 volte in ambiente medio.
  16. Lavare due volte la piastra di attivazione pre-rivestita (passaggio 1.1.2) con 1x DPBS senza pipettare direttamente sulla superficie inferiore della piastra.
  17. Facoltativo: eseguire una separazione dei linfociti vivi/morti per rimuovere le cellule morte.
    1. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL. Aggiungere delicatamente 2 mL di terreno di separazione linfocitaria sul fondo della sospensione cellulare. Centrifugare a 900 x g per 10 min (a temperatura ambiente) a bassa accelerazione e decelerazione.
      NOTA: Le cellule vive si separeranno all'interfaccia tra il terreno e il mezzo di separazione (strato bianco centrale). Le cellule morte si accumulano sul fondo del tubo e possono essere scartate alla fine.
    2. Trasferire lo strato intermedio contenente i linfociti vivi in una nuova provetta e centrifugare a 270 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Decantare il surnatante.
  18. Risospendere il pellet in 12 mL di terreno con 10 U/mL di IL-2 ricombinante di topo. Piastra 1 mL per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti non trattata con TC e trasferimento a 37 °C durante la notte.

2. Sollevamento delle cellule T CD8+ attivate

  1. Visualizzazione delle cellule con un microscopio ottico da banco standard, con obiettivo 4x o 10x.
    NOTA: Le cellule T attivate appariranno più grandi e rotonde o allungate rispetto alle cellule T inattivate e dovrebbero avere densi gruppi di cellule in tutto il pozzetto.
  2. Per sollevare le cellule attivate, disgregare le cellule con una pipetta da 1 mL, assicurandosi di mescolare bene ai bordi della piastra. Trasferire le cellule in una nuova provetta conica da 15 mL.
    NOTA: Le cellule attivate sono più appiccicose e richiedono un pipettaggio più vigoroso.
  3. Lavare i pozzetti con 1 mL di terreno R9 per rimuovere eventuali cellule rimanenti. Ripetere ancora una volta se necessario. Centrifugare le celle a 270 x g (20 °C) per 5 minuti. Scartare il surnatante.
  4. Eseguire una separazione dei linfociti vivi/morti per rimuovere le cellule morte come nei passaggi 1.17-1.18.
  5. Mantenere le cellule T mediante rimozione di cellule vive/morte ogni 3-4 giorni in terreno R9 con IL-2 in una piastra a 6 pozzetti non TC.
    NOTA: Le cellule T proliferano meglio in pozzetti di piccole dimensioni durante l'attivazione precoce, probabilmente a causa dei contatti cellula T-cellula T o di fattori solubili derivati dalle cellule T che ne aiutano l'attivazione. La rapida proliferazione delle cellule T provoca l'ingiallimento del terreno di coltura entro 24-48 ore dalla fase di coltura. A questo punto, sollevare le cellule e trasferirle in un pozzetto più grande (piastra a 6 pozzetti non rivestita, non TC) con terreno di coltura fresco sufficiente per alimentare le cellule (in genere 5 ml per pozzetto). Sostituire il terreno impoverito con quello fresco ogni volta che il giallo cambia colore o ogni 3-4 giorni.

3. Preparazione del piatto di vetro

  1. Preparare le camere o le piastre di migrazione delle celle vetrose rivestendole con 300 μL/cm2 di proteina A (0,1 mg/mL) per una notte a 4 °C, lavare due volte con 1x DPBS erogando sul piatto e travasando prima di passare alla fase successiva.
  2. Rivestire la camera di migrazione o la piastra con 300 μL/cm2 di chimera ricombinante ICAM-1 o VCAM-1 Fc di topo (0,1-2,75 mg/mL) insieme a una chemochina di topo ricombinante (0,1-10 μg/mL) per 2-3 ore a temperatura ambiente. Altri ligandi di integrine come la fibronectina, il collagene IV di topo e l'E-caderina di topo sono resi per rivestire direttamente la camera a 2,5-10 μg/mL durante la notte a 4 °C.
    1. Lavare le camere due volte con 1x DPBS erogando sulla piastra e decantando subito dopo prima di aggiungere le celle.
      NOTA: Le cellule T possono migrare in modo diverso in diverse concentrazioni di ligandi integrinici e chemochine a seconda dello stato di attivazione, differenziazione, sensibilizzazione e priming. Si consiglia vivamente di analizzare la migrazione cellulare in più concentrazioni diverse.
  3. Piastra le cellule aderenti su piastre rivestite di vetro 24 ore prima dell'inizio dell'imaging se si co-coltivano cellule T con altre cellule, come le cellule tumorali, per misurare l'uccisione delle cellule T delle cellule tumorali in tempo reale.

4. Preparazione delle cellule

  1. Opzionale: colorare le cellule T e le cellule aderenti con colorante tracker cellulare a scelta a 1 μg/mL per 1 x 107 cellule in 1x DPBS per 15 minuti a 37 °C, o secondo il protocollo del produttore.
  2. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o equivalente.
  3. Piastra 1 x 105 cellule T CD8+ (o la quantità desiderata) nel terreno L-15 di Leibovitz integrato con 1-5 g/L di glucosio in una camera a 37 °C.
    NOTA: Il terreno L-15 è formulato per l'uso senza un sistema di bicarbonato di CO 2-sodio. Viene tamponato utilizzando aminoacidi basici liberi, tamponi fosfato e galattosio per mantenere i livelli di pH.
  4. Opzionale: eseguire il blocco delle integrine.
    1. Preincubare le cellule T con un anticorpo bloccante contro un'integrina (1-10 μg/mL), anti-topo CD11a (M17/4), anti-topo CD18 (M18/2), anti-topo VLA-4 (9C10) per 10 minuti e lasciare strisciare in presenza dello stesso anticorpo.

5. Microscopia time-lapse

  1. Eseguire la microscopia video.
  2. Per le cellule T, acquisire immagini in campo chiaro e fluorescenti ogni 10-60 s per 10-60 minuti o con le impostazioni di acquisizione desiderate.
    NOTA: La migrazione delle cellule T è sensibile alla temperatura e la temperatura ottimale per la migrazione delle cellule T di topo è di 37 °C. Il sistema di controllo della temperatura utilizzato da questo protocollo è costituito da un ponte di microscopio chiuso e isolato con un sistema di riscaldamento collegato. La camera di imaging si trova sul ponte di imaging. Il perimetro di questa camera ha un pozzo riempito con acqua distillata che consente calore e umidità costanti durante l'imaging. Il micropozzetto è posizionato al centro della camera di imaging.

6. Analisi assistita da software della migrazione delle cellule T

  1. Utilizza il software Volocity per valutare la migrazione delle cellule T.
    1. Apri Volocity e crea una nuova sequenza di immagini.
    2. Seleziona e sposta tutti i filmati di microscopia video time-lapse nell'area blu di Volocity.
    3. Regola la luminosità e il contrasto utilizzando lo strumento di miglioramento del contrasto in base alle impostazioni desiderate dal ricercatore.
    4. Controlla le dimensioni dell'immagine: 0,325 μm per 20x, 0,65 μm per 10x.
    5. Sequenza: imposta i punti temporali (es: 81 immagini se si scatta un'immagine ogni 15 s per 20 minuti, 4 al minuto).
    6. Deseleziona tutti i punti temporali nella scheda di misurazione.
    7. Trova gli oggetti usando l'intensità: fai scorrere la barra in modo che sia appena a destra del picco.
    8. Escludi oggetti in base alle dimensioni: tutte le celle di diametro inferiore a 10 μm e superiore a 100 μm per escludere detriti cellulari o particelle non cellulari. Escludere le cellule T che migrano per meno del 20% del tempo di registrazione (che può variare a seconda della definizione di ciascun ricercatore).
    9. Ignora oggetti statici (casella di controllo).
    10. Unisci automaticamente i tratti interrotti (casella di controllo).
    11. Impostare il percorso più breve su non più di 20 μm.
    12. La traccia di una migrazione cellulare è la linea che collega la posizione della stessa cella nel tempo. Assicurati che l'algoritmo di tracciamento stia tracciando rilevando dove i singoli oggetti vengono rilevati dalla segmentazione in ogni fotogramma e gli oggetti vengono abbinati tra i fotogrammi.
    13. Salva un nuovo protocollo scegliendo Misurazioni > Salva protocollo > Nome nuovo protocollo.
    14. Fare clic su Misura tutti i punti temporali nella scheda di misurazione.
    15. Ordina le tracce per intervallo di tempo, dal più alto al più basso.
    16. Registrare i numeri ID delle tracce per tutte le celle con tracce valide, come definito dall'investigatore. Dopo il tracciamento automatico delle celle, è necessaria la valutazione manuale di ciascuna traccia di celle per escludere tracce erroneamente identificate o interrotte. Escludi le celle con tracce non valide.
    17. Esporta il file come testo separato da virgole e trasferisci i dati al software di analisi desiderato.
      NOTA: Parametri di base: velocità (μm/min), spostamento (movimento netto, μm), lunghezza del binario (lunghezza totale del percorso, μm) e indice di curvatura (MI; spostamento netto/lunghezza del binario. MI = 1 indica un binario lineare completamente rettilineo).
  2. Eseguite l'inseguimento manuale utilizzando l'immagine J.
    1. Apri i plug-in e seleziona il tracciamento e il tracciamento manuale. Impostare i parametri: intervalli di tempo, calibrazione x/y (dimensione dei pixel) e calibrazione z (in modalità di inseguimento manuale). Avvia il tracciamento delle singole celle facendo clic su aggiungi traccia, selezionando una cella al primo punto temporale e continuando attraverso tutti i punti temporali. Quindi, fai clic su Termina traccia. Ripeti l'operazione per tutte le celle di interesse.
      NOTA: Trackmate, un altro strumento per il tracciamento delle celle, è un software di tracciamento automatico disponibile tramite il plug-in ImageJ.

Risultati

La conferma dell'attivazione delle cellule T può essere ottenuta mediante citometria a flusso, alla ricerca di un aumento dell'espressione di CD69 e CD44, che sono marcatori canonici di attivazione nelle cellule T murine6. Inoltre, la purezza della popolazione di cellule T può essere determinata mediante citometria a flusso per le cellule T CD3+ CD8+ . Questo metodo produce il >90 % della popolazione di cellule T CD8+ .

La migrazione delle cellule T può essere valutata con programmi di tracciamento cellulare assistiti da software che sono sia riproducibili che sintonizzabili per soddisfare le esigenze dello sperimentatore. Alcuni parametri di base utilizzati per determinare gli effetti sperimentali includono la velocità cellulare (lunghezza della migrazione per un dato tempo per determinare la velocità con cui una cellula si muove), lo spostamento (distanza di migrazione, una linea retta dal punto di partenza al punto finale, per determinare la distanza di migrazione di una cellula), la lunghezza della traccia (distanza di migrazione, la lunghezza totale del percorso di migrazione, per determinare la distanza di migrazione di una cellula), e indice di meandri (MI è compreso tra 0 e 1 per determinare la rettilineità della migrazione, 1 = rettilineo). Questi parametri sono impiegati per valutare le differenze migratorie nelle cellule T CD8+ naive e attivate che strisciano lungo il vetro rivestito ICAM-1 con CXCL12 (Figura 1). L'aumento della velocità media, dello spostamento e dell'indice di meandri è stato osservato nelle cellule T CD8+ attivate rispetto alle cellule Naive, indicando che le cellule T attivate hanno una maggiore capacità di migrazione. Allo stesso modo, l'impatto di diverse chemochine sui modelli di migrazione cellulare può essere chiarito con questi metodi. Ad esempio, le cellule T CD8+ attivate mostrano una maggiore migrazione in presenza di CXCL12, ma non di CCL2 o CCL22, e la migrazione aumenta in modo dose-dipendente fino a una concentrazione saturante (Figura 2). Inoltre, il tracciamento cellulare assistito da software consente la caratterizzazione della migrazione delle singole cellule, che consente una comprensione degli effetti dei singoli ligandi sul comportamento delle cellule T. Le tracce cellulari rappresentative possono essere viste nella Figura 3.

Nel loro insieme, questi dati supportano l'efficacia dei metodi attuali, confermando che possiamo (1) tracciare la migrazione cellulare su base individuale e (2) distinguere le differenze nella migrazione delle cellule T CD8+ in base allo stato di attivazione e alla presenza di diverse chemochine e molecole di adesione. Questo test è un passo fondamentale per sezionare complessi meccanismi di segnalazione e informare esperimenti in vivo mirati che possono affrontare ulteriormente i contributi biologici di segnali specifici in modo specifico per tipo di cellula.

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Figura 1: Saggi in vitro per la migrazione di cellule T CD8+ naive e attivate. Le cellule T CD8+ di topo naive o attivate da CD3/CD28 sono state autorizzate a migrare su ICAM-1 più CXCL12 per 10 minuti. La velocità, lo spostamento e l'indice di curvatura della migrazione cellulare sono stati analizzati utilizzando la microscopia time-lapse e Volocity. Ogni gruppo ha 36 cellule T individuali (media ± SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Saggi in vitro per la migrazione chemochina-dipendente di cellule T CD8+ attivate. Le cellule T CD8+ di topo attivate da CD3/CD28 sono state autorizzate a migrare su ICAM-1 più una chemochina indicata. I rapporti tra il numero di cellule che strisciano più di 50 μm per 20 minuti (percentuale del totale) sono stati determinati in un campo visivo. Un singolo test analizzato >10 cellule (n = 3 test per gruppo media ± SEM). T-test non appaiato, *p< 0,05 rispetto al controllo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Tracce migratorie delle cellule T CD8+ attivate su ICAM-1 più CXCL12 per 20 minuti. Ogni linea colorata indica la traccia migratoria di ciascuna cellula T in una direzione dal punto della cellula al contrario. In questo particolare test, 24 cellule su 38 sono migrate in una lunghezza significativa (almeno la distanza della loro larghezza cellulare secondo la nostra definizione). Le cellule T sono migrate in diverse lunghezze di distanza, indicando che ogni cellula era in un diverso stato di attivazione o priming. Tutte le cellule migratorie si muovevano in direzioni diverse a condizione che la superficie fosse uniformemente rivestita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Comprendere l'impatto biologico dei segnali convergenti in vivo è impegnativo e non facile da interpretare. I protocolli qui presentati forniscono un metodo ragionevole per comprendere la migrazione delle cellule T in condizioni altamente definite e biologicamente rilevanti. Queste condizioni possono essere specificate a discrezione dello sperimentatore e i protocolli possono essere modificati per adattarsi alle esigenze delle varie popolazioni di cellule T, allo stato di attivazione e al fenotipo cellulare. Inoltre, molti ligandi e recettori possono essere interrogati attraverso queste procedure definite di blocco degli anticorpi 7,8 e di vetro rivestito di ligando 8,9,10. Questa tecnica è stata anche una piattaforma fondamentale per lo sviluppo di cellule immunitarie ingegnerizzate11,12.

Le fasi importanti del protocollo includono l'isolamento del tessuto linfoide secondario, l'attivazione delle cellule T, il rivestimento delle piastre di imaging in vetro e l'analisi dei dati. Per l'occhio inesperto, i linfonodi incorporati nel tessuto possono essere difficili da identificare ed estrarre. Questo può essere superato con la pratica. Una volta che le cellule T sono state isolate e purificate, la fase di attivazione si traduce in cellule appiccicose che, se non sollevate correttamente, possono portare a una bassa resa. Questo può essere evitato con un lavaggio generoso e accurato dei pozzi. Le piastre di vetro devono essere adeguatamente rivestite con il legante di interesse e lavate prima dell'aggiunta delle celle. Ciò garantirà che sia disponibile un robusto strato di proteine a cui le cellule possono aderire, assicurando al contempo che l'eccesso di reagente non interrompa la biologia. Il legame superficiale della proteina A e il legame della proteina A nel pH fisiologico e nella concentrazione di sale sono abbastanza forti da resistere al dilavamento durante il versamento e la decantazione delicata del tampone. Le proteine residue, se presenti, nel terreno non causano alcuna tossicità, anche se potrebbero disturbare l'interazione cellulare con i ligandi legati se quelli non legati sono in alte concentrazioni. Escludiamo questa possibilità risciacquando il vetro rivestito un paio di volte. Infine, esistono molti software commerciali e non commerciali di facile utilizzo che consentono ai ricercatori di rilevare anche sottili differenze nei comportamenti e nelle morfologie cellulari. L'importanza di rassicurare manualmente i risultati analizzati per escludere gli errori che il software potrebbe commettere non può essere sopravvalutata.

I metodi per la purificazione e l'attivazione delle cellule T possono essere modificati per soddisfare le esigenze del ricercatore per ottenere lo stato e il fenotipo cellulare corretti per ricapitolare le osservazioni in vivo. Vari tipi e stati cellulari possono essere utilizzati per affrontare diversi meccanismi di infezione e risposta immunitaria 7,8,9,10,11,13, incluso l'affrontare il comportamento delle cellule T naive e di memoria e vari aspetti della risposta della memoria, come l'innesco e il reclutamento, in condizioni tessuto-specifiche14. Questo metodo può essere utilizzato per la co-coltura con diversi tipi di cellule per comprendere ulteriormente le interazioni cellulari, inclusi i tempi di contatto cellula-cellula e la durata 7,9, la presentazione dell'antigene 9,13 e l'uccisione delle cellule bersaglio6. Ulteriori reporter ed etichette possono essere utilizzati per valutare le strutture subcellulari7, i granuli15, l'apoptosi6 e altro ancora.

Il protocollo è uno strumento eccellente per guidare ulteriori esperimenti in vivo basati su osservazioni in condizioni semplificate e altamente definite. Sebbene la valutazione in vitro della motilità cellulare possa essere altamente riduttiva, è un passo importante nella scomposizione di attività biologiche complesse. Con i risultati di questi esperimenti, i ricercatori possono affrontare il lavoro in vivo in modo più fisiologicamente rilevante e mirato.

La semplicità di questo metodo rappresenta anche il suo principale limite; Sebbene rappresentativi delle attività in vivo, tutti i risultati possono essere ulteriormente confermati utilizzando, ad esempio, la microscopia multifotone intravitale. Il metodo qui descritto è uno dei più semplici a disposizione dei laboratori di ricerca con un microscopio a campo chiaro e/o un microscopio a epifluorescenza con una fotocamera digitale integrata nel sistema di microscopio o posizionato separatamente sull'obiettivo del cannocchiale. D'altra parte, ci sono più opzioni per l'analisi avanzata della migrazione delle cellule immunitarie in vitro. In primo luogo, le cellule immunitarie sono spesso guidate da gradienti di chemochine nel sistema biologico. L'analisi dei comportamenti delle cellule immunitarie sotto gradienti di chemochine può essere ottenuta in diversi modi. Un metodo semplice consiste nell'utilizzare una slitta appositamente progettata (vedi Tabella dei materiali). Questo sistema a pozzetti canalizzati, quando il suo fondo è rivestito di ligandi integrinici, consente l'analisi della migrazione delle cellule immunitarie sotto gradiente statico di chemochine. Altri semplici saggi per la chemiotassi delle cellule immunitarie includono la microscopia time-lapse della migrazione cellulare verso una punta di micropipetta che rilascia le chemochine16, il test dell'agarosio17 e la camera di Zigmond18. Per saggi di migrazione più sofisticati sotto gradienti di chemochine controllati, sono necessari vetrini personalizzati con generatori di gradienti microfluidici19,20. In secondo luogo, le cellule immunitarie possono migrare in condizioni fisiche uniche utilizzando meccanismi diversi, a volte senza utilizzare l'adesione integrina-dipendente ai ligandi. Il saggio di migrazione in vitro in monodimensione può essere eseguito con o senza rivestimento di ligandi integrinici e riproduce la motilità delle cellule immunitarie nei vasi capillari21,22. Un'altra opzione è il saggio di migrazione cellulare nello spazio tridimensionale23,24 per studiare i meccanismi alla base della migrazione interstiziale delle cellule25,26. Nel complesso, abbiamo delineato metodi semplici, riproducibili e affidabili per studiare gli eventi dinamici di migrazione cellulare.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che tutte le ricerche e la preparazione del manoscritto sono state condotte in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri precedenti e attuali del Kim Lab che hanno contribuito allo sviluppo di questi protocolli nel tempo. Dati rappresentativi sono stati resi possibili da P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/Stati Uniti e P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/Stati Uniti. Questa pubblicazione è stata resa possibile in parte dalla sovvenzione numero T32 GM135134 dall'Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piatto da 10 cmCorning353003o equivalente
Provetta conica da 15 mLThermoFisher339650o equivalente
1x DPBSGibco14190144senza calcio e senza magnesio
Piastra a 6 pozzetti non trattataTC Corning3736o equivalente
70 &; filtro cellulare mFisherScientific352350o tampone di
lisi ACKThermoFisherA1049201o centrifuga
Allegra 6KRThermoScientificsorvall 16R con rotore tx400 3655 e secchioo equivalente
Beta mercaptoetanoloSigmaM3148o equivalente
CellTrace VioletThermoFisherC34571O equivalente
CentrifugaThermoScientificSorvall ST 16Ro equivalente
Collagene (IV)Corning354233o
equivalente Piatto di coltura DeltaT .17 mm di spessore vetro trasparenteBioptechs04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgGInvitrogen11035
DynaMag 15 MagnetThermoFisher Scientific12301Do equivalente
Kit di isolamento delle cellule T del topo Easy sepStem Cell19851
FBSSigmaAldrichF2442-500MLo
equivalente FibronectinaSigmaAldrich10838039001o equivalente
Fijihttp://fiji.sc/weblink
Cubi filtrantiNikon o Olympus
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080o
equivalente Telecamera CCD HQCoolSNAPo equivalente
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/h weblink
ImageJ inseguimento automatico plug-inhttp://imagej.net/TrackMate
weblink ImageJ tracciamento manuale https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmlweblink
L-15VariVedi MaterialiMedia Ricetta: Leibovitz' s Terreno L-15 senza rosso fenolo (Gibco) integrato con 1-5 g/L
di glucosio Terreno L-15 di Liebovitz, senza rosso fenoloSiringa monouso ThermoFisher21083027
Luer LokFisher Scientific14-955-459o equivalente
Terreno di separazione dei linfocitiCorning25-072-CIo equivalente
M5/114ATCCTIB-120
Aminoacidi non essenziali MEMThermoFisher11140050o equivalente
Sistema di riscaldamento per microscopioOkolabokolab.comDisegni personalizzati disponibili
Vetrino Millicell EZMilliporeC86024
Mouse Mojosort CD8+ Naï Kit di isolamento delle cellule T Biolegend480043
Mouse E-caderinaR& Sistemi D8875-EC-050o equivalente
Kit di dissezione chirurgica del topoFisherScientific 13-820-096
elementi NISSoftware Nikon
non TC 24wpCorning353047o equivalente
Penicillina-streptomicinaThermoFisher15140122o
equivalente Proteina AThermoFisher Scientifico equivalente
R9VariVedere MaterialiMedium Ricetta: RPMI 1640x integrato con il 10% di FBS, l'1% di antibiotico-antimicotico (Gibco), il tampone HEPES 20 mM (Gibco), l'1% di aminoacidi non essenziali MEM (Gibco), 50 μ M β-mercaptoetanolo (Sigma-Aldrich)
Topo ricombinante ICAM-1 Fc chimeraR& D systems796-IC-050o
equivalente Mouse ricombinante IL2Biolegend575410o
equivalente RPMI 1640xThermoFisher11875093o
pin T equivalenti FisherScientificS99385o equivalente
TE2000-U microscopioNikono equivalente
Varie chemochine di topo ricombinantiRe D oequivalente
VCAM-1 Fc chimeraR& D systems643-VM-050o software
VolocityPerkinElmer
equivalente equivalente collegare o equivalenti equivalente

Riferimenti

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