Preparazione di campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione

Sommario

Questo protocollo fornisce una procedura di preparazione ottimizzata ed elaborata per campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione. È adatto per applicazioni che prevedono l'analisi delle sinapsi in organoidi retinici maturi.

Abstract

Gli organoidi retinici (RO) sono un sistema di coltura tridimensionale che imita le caratteristiche della retina umana che si sono differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) in condizioni specifiche. Lo sviluppo e la maturazione delle sinapsi nelle RO sono stati studiati immunocitochimicamente e funzionalmente. Tuttavia, l'evidenza diretta dell'ultrastruttura sinaptica di contatto è limitata, contenendo sia sinapsi speciali a nastro che sinapsi chimiche convenzionali. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è caratterizzata da un'alta risoluzione e da una storia rispettabile che chiarisce lo sviluppo retinico e la maturazione delle sinapsi nell'uomo e in varie specie. È un potente strumento per esplorare la struttura sinaptica nelle RO ed è ampiamente utilizzato nel campo della ricerca sulle RO. Pertanto, per esplorare meglio la struttura dei contatti sinaptici RO su scala nanometrica e ottenere prove microscopiche di alta qualità, abbiamo sviluppato un metodo semplice e ripetibile di preparazione del campione RO TEM. Questo documento descrive il protocollo, i reagenti utilizzati e i passaggi dettagliati, tra cui la preparazione della fissazione RO, la post-fissazione, l'incorporamento e la visualizzazione.

Introduzione

La retina, un organo sensoriale visivo vitale nell'uomo e nei mammiferi, mostra una struttura laminata distinta caratterizzata da tre strati nucleari che ospitano somi neuronali e due strati plessiformi formati da connessioni sinaptiche¹, comprese le sinapsi convenzionali e la sinapsi a nastro specializzata ^2,3. La sinapsi a nastro svolge un ruolo cruciale nella trasmissione degli impulsi delle vescicole in modo graduale ^2,3. Il processo visivo coinvolge la trasmissione del segnale elettro-ottico attraverso vari livelli di neuroni e sinapsi, raggiungendo infine la corteccia visiva ^4,5.

Gli organoidi retinici (RO) rappresentano un sistema di coltura tridimensionale (3D) derivato da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), che imita gli stati fisiologici del tessuto retinico in vitro ^1,6,7. Questo approccio è promettente per lo studio delle malattie retiniche⁸, lo screening farmacologico⁹ e funge da potenziale terapia per le condizioni degenerative retiniche irreversibili come la retinite pigmentosa¹⁰ e il glaucoma¹¹. Essendo un potente sistema di conduzione ottica in vitro, la sinapsi all'interno delle RO è una struttura cruciale che facilita l'efficace trasformazione e trasferimento del segnale⁵.

Lo sviluppo dell'RO può essere approssimativamente suddiviso in tre fasi in base ai loro tratti morfologici e profili di espressione molecolare ^6,12. Le RO allo stadio 1 (circa D21-D60) comprendono cellule progenitrici neurali della retina, molte cellule gangliari retiniche (RGC) e alcune cellule amacrine starburst (SAC), corrispondenti alla prima epoca dello sviluppo fetale umano. Nello stadio 2 (circa D50-D150), gli RO esprimono alcuni precursori dei fotorecettori, interneuroni e geni correlati alla sinaptogenesi, che rappresenta una fase di transizione. I fotorecettori sviluppano la maturità nello stadio 3 delle RO (circa dopo D100-D150), corrispondente al terzo stadio dello sviluppo fetale umano ^6,12,13. In particolare, rispetto alle RO dello stadio 1 e dello stadio 2, le RO dello stadio 3 hanno una struttura lamellare distinta le cui sinapsi sono maturate¹², inclusa la presenza di sinapsi a nastro¹⁴. Inoltre, un recente studio ha confermato che le sinapsi mature esistono nella trasmissione di segnali luminosi, indicando che sono funzionali¹³. Pertanto, le RO allo stadio 3 sono spesso selezionate per studiare la struttura sinaptica.

L'immunoistochimica è ampiamente applicata allo studio dell'espressione di varie proteine molecolari. Tuttavia, il limite della microscopia ottica risiede nella sua capacità di osservare solo un numero limitato di cellule e molecole specifiche alla volta, con conseguente mancanza di un'analisi completa delle relazioni tra le cellule e l'ambiente circostante. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è caratterizzata da un'alta risoluzione, con una risoluzione limitata di 0,1-0,2 nm, superando il microscopio ottico di ~10-20 volte¹⁵. Compensa i difetti della microscopia ottica e viene utilizzato per chiarire lo sviluppo della retina e la maturazione delle sinapsi nell'uomo^16,17 e in varie specie 18,19,20,21. La TEM consente la distinzione diretta delle componenti presinaptiche e postsinaptiche^18,20 e consente anche l'osservazione completa di strutture subcellulari come i nastri ^2,3, le vescicole²² e i mitocondri²³. Pertanto, la TEM è uno strumento essenziale per identificare i tipi di sinapsi ed esplorare l'ultrastruttura dei contatti sinaptici nelle RO su scala nanometrica.

È fondamentale notare che la preparazione del campione è di grande importanza per l'acquisizione di micrografie elettroniche di alta qualità. Sebbene alcuni studi abbiano eseguito EM su RO 12,13,24, le procedure dettagliate non sono chiare. Poiché la qualità dell'immagine al microscopio elettronico dipende in larga misura dall'effetto della fissazione RO e della permeazione del reagente, durante la preparazione è necessario considerare vari fattori importanti. Di conseguenza, per studiare meglio i contatti sinaptici nelle RO, presentiamo un metodo con una buona riproducibilità che mostra i punti operativi del fissaggio, dell'inclusione e dell'identificazione dei siti di osservazione delle RO.

Protocollo

1. Ottenimento di RO da iPSC²⁵

NOTA: Le RO sono state derivate dalle iPSC modificando la procedura precedentemente riportata.

1. Dissociare le iPSC a ~90% di confluenza utilizzando una proteasi batterica (vedi Tabella dei materiali). Taglia le colonie a pezzi e raschia con un sollevatore di cellule.
2. Dopo la raccolta, risospendere i gruppi di cellule in 0,25 mL di Matrigel ghiacciato. Dopo 20 minuti di incubazione a 37 °C, spargere il gel solidificato con il terreno DMEM/F12 (integratore di N2 allo 0,5%, integratore di B27 all'1%, 0,1 mM di β-mercaptoetanolo, 0,2 mM di sostituto della L-glutammina, 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina). Definisci questo tempo come il giorno 0 di differenziazione.
3. Dopo 5 giorni di coltura galleggiante, le cellule si raggruppano per formare cisti cellulari. Trasferisci queste cisti cellulari in una capsula di Petri da 100 mm dove ora aderiranno e cresceranno.
4. Il giorno 15, utilizzare la proteasi batterica per dissociare le cellule aderenti e coltivarle in terreno DMEM/F12 (integratore di B27 al 2%, 0,1 mM di aminoacidi non essenziali).
5. Il giorno 21, sostituire il terreno con 20 ml di terreno contenente siero (terreno DMEM/F12, 8% FBS, 2% integratore di B27, 100 mM di taurina e 2 mM di sostituto della L-glutammina) e sostituire il terreno ogni settimana.

2. Fissazione anteriore delle RO

1. Spostare delicatamente una delle RO coltivate (~D180, una dimensione di circa 1~2 mm di diametro è ottimale) dalla piastra di Petri a provette per microcentrifuga da 1,5 mL con una pipetta e contrassegnare le informazioni rilevanti sulle RO.
   NOTA: Tagliare a metà le RO o tagliare il tessuto mal strutturato con un rasoio al microscopio nella piastra contenente il fissativo se le RO sono troppo grandi.
2. Rimuovere il terreno di coltura da 1,5 mL di provette per microcentrifuga con una pipetta. Aggiungere 1,5 mL di fissativo paraformaldeide al 2% e glutaraldeide diluito in tampone fosfato (PB) 0,1 M, pH 7,4 e fissare a temperatura ambiente (RT) per 4 ore. Conservare le provette per microcentrifuga a 4 °C per una notte.
   NOTA: Questo passaggio può essere messo in pausa per 1 settimana, ma si consiglia di riavviarlo il prima possibile. Se le RO vengono lasciate più a lungo, può causare l'autolisi delle cellule che porta alla distruzione dell'ultrastruttura delle RO. A causa della fragilità degli RO, evitare operazioni di rotazione, oscillazione, ribaltamento o operazioni brusche.

3. Post-fissazione delle RO

1. Rimuovere il fissativo 2% paraformaldeide-2% glutaraldeide e lavare con 1 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato 0,01 M (PBS) a pH 7,4 per 3 x 10 min. Sospendere delicatamente le RO nelle provette da microcentrifuga da 1,5 ml durante il processo di lavaggio per un risciacquo completo. Per ogni giorno aggiuntivo di fissaggio, aumentare il numero di lavaggi di due per rimuovere il più possibile il fissativo residuo.
2. Rimuovere il PBS rimanente utilizzando una pipetta e sostituirlo con ~150 μL di acido osmico all'1% (OsO4) fino a quando i blocchi di tessuto non sono sommersi. Posizionare le provette per microcentrifuga in una scatola buia per proteggerle dalla luce e infiltrarle a RT per 1 ora.
   NOTA: OsO4 è un forte ossidante e deve essere maneggiato in una cappa aspirante.

4. Colorazione e disidratazione

NOTA: Il deumidificatore deve essere acceso per asciugare l'ambiente da questo passaggio.

1. Rimuovere l'OsO4 utilizzando una pipetta, lavare con 0,01 M PBS (pH 7,4) 3 x 10 min, quindi lavare 3 x 10 min con acqua deionizzata.
   NOTA: Per garantire il completo risciacquo degli RO, si consiglia di sospendere gli RO. Aspirare OsO4 in un flacone per lo smaltimento dedicato.
2. Rimuovere l'ultimo lavaggio con acqua deionizzata e sostituirlo con ~150 μL per provetta (garantire la completa infiltrazione dei blocchi di tessuto) di acetato di uranio e colorare per 1-2 ore a RT. Proteggere le provette da microcentrifuga dalla luce.
3. Rimuovere l'acetato di uranio e sostituirlo con 1 mL di acetone al 50% nella cappa aspirante, disidratando per 10 minuti. Quindi, utilizzare acetone al 70%, 80%, 90%, 100% e 100% per la disidratazione graduale degli RO in successione. Ogni disidratazione dura 10 minuti.
   NOTA: Lasciare un po' di liquido in ammollo per ogni scambio per evitare l'esposizione all'aria e all'umidità. Inoltre, operare rapidamente il prima possibile perché l'acetone è volatile. Aspirare l'acetato di uranio in un apposito flacone per lo smaltimento.

5. Infiltrazione

1. Scartare l'acetone e aggiungere ~150 μl della miscela composta da acetone e resina Epon-812 in un rapporto di 1:1. Mettere in forno a 37 °C per 1 ora.
2. Rimuovere la miscela di cui sopra e sostituirla con una miscela composta da acetone e resina Epon-812 in un rapporto di 1:4. Mettere in forno a 37 °C per una notte.
3. Trasferire con cura gli RO nelle nuove provette contenenti ~500 μL di resina epossidica pura e metterli in forno a 45 °C per 1 ora.

6. Incorporamento

1. Preparare i 30-50 mL di resina epossidica pura in una provetta da centrifuga da 50 mL mescolando in anticipo il kit di reagenti secondo le istruzioni del produttore. Ruotare lentamente la resina epossidica pura per 30 minuti per ridurre le bolle d'aria introdotte dal miscelatore. Quindi, lasciare in forno a 37 °C per 20 min. Aggiungere 2/3 del volume di resina epossidica pura alla scanalatura dello stampo di inclusione.
2. Usa uno stuzzicadenti per raccogliere gli RO nello stampo da inclusione dotato di resina epossidica pura.
3. Riempire la scanalatura con resina epossidica pura fino a quando non sporge o si gonfia leggermente.
4. Regolare la posizione delle RO su entrambe le estremità dello stampo di inclusione per l'incorporamento direzionale. Mettere lo stampo da incasso in forno a 45 °C per 1-2 ore e poi metterlo in forno a 65 °C per 48-72 ore.

7. Posizionamento semi-sottile

1. Carteggiare la resina epossidica in eccesso attorno al tessuto dalle estremità dei quattro lati più lunghi del blocco di inclusione per formare una faccia trapezoidale. Installare il blocco di inclusione nel supporto di montaggio del campione e avvitare il bullone con un cacciavite a L. Quindi, installare i coltelli di vetro sul supporto per coltelli e serrare manualmente il dado.
2. Taglia via la resina in eccesso fino a quando l'area desiderata non è esposta.
3. Riempi d'acqua la mangiatoia del coltello di vetro. Tagliare le fette semisottili a uno spessore di 1 μm utilizzando un microtomo semisottile e adagiarle su un vetrino da microscopio con un ago.
4. Aggiungere 50 μl di blu di toluidina all'1% per colorare le fette semisottili e incubare per 1 minuto a 95 °C sulla piastra riscaldante. Risciacquare con acqua distillata per 2 min. Utilizzare un normale microscopio ottico 20x per osservare la struttura delle sezioni.

8. Sezionamento ultrasottile

1. Installare i blocchi di incorporamento e i coltelli di vetro come descritto al punto 7.1. Regola la distanza tra il coltello e il blocco di tessuto, il livello del liquido del lavandino e la velocità di affettatura. Tagliare le sezioni ultrasottili con uno spessore di ~70-100 nm con un microtomo ultrasottile e raccogliere le fette sulla rete di rame (200 mesh) con la pellicola di supporto.
2. Colorare le sezioni ultrasottili con citrato di piombo al 3% per 15 minuti per migliorare il contrasto in una procedura di doppia colorazione.

9. Imaging RO mediante TEM

1. Avviare il software (vedere la Tabella dei materiali).
2. Fare clic sul pulsante Modalità memoria e contrassegnare approssimativamente ogni sezione ultrasottile.
3. Ricerca di strutture sinaptiche.
   1. Distinguere la struttura laminata delle RO a basso ingrandimento.
   2. Individua lo strato nucleare esterno (ONL), che mostra una struttura nucleare con una densità elettronica più profonda. Successivamente, navigare fino al terminale del fotorecettore dove si accumulano numerose vescicole. Cerca i terminali a barra con un singolo nastro sinaptico e i terminali a cono con più nastri sinaptici.
   3. Passa allo strato plessiforme interno (IPL) e cerca una struttura simile con un piccolo nastro.
4. Cattura l'immagine microscopica.
   1. Fare clic su Start e inserire la potenza di ingrandimento corrispondente.
   2. Salva le immagini.

Risultati

La creazione di RO 3D attraverso la differenziazione delle iPSC fornisce un potente strumento per lo studio dei meccanismi delle malattie retiniche e la terapia sostitutiva con cellule staminali. Sebbene altri abbiano dimostrato le connessioni sinaptiche nelle RO funzionalmente e immunocitochimicamente, l'evidenza diretta di sinapsi convenzionali e a nastro è molto limitata. Qui presentiamo un metodo per studiare l'ultrastruttura di due tipi di sinapsi nelle RO mediante TEM. Dopo 180 giorni di coltura, le RO sono state fissate, colorate, incorporate e affettate in ultrasottile. L'osservazione TEM ha rivelato sinapsi a nastro ai terminali assonali dei fotorecettori (Figura 1 e Figura 2), che sono distribuite nell'OPL. Sotto TEM, nastri di bastoncelli sferule attorno all'invaginazione sinaptica, formando un profilo a forma di ferro di cavallo con cellule orizzontali (Figura 1). Le aste in genere hanno un solo nastro, ma i coni hanno più nastri (Figura 2). Inoltre, sono state osservate sinapsi chimiche classiche tra le cellule amacrine nell'IPL (Figura 3). Nell'ambito della TEM, la sinapsi chimica è composta da tre parti: la presinaptica, la fessura sinaptica e la postsinaptica. Le membrane cellulari corrispondenti alle parti presinaptiche e postsinaptiche sono leggermente più spesse del resto delle parti e lo stretto spazio tra le due membrane è chiamato fessura sinaptica. Ci sono molte vescicole sinaptiche nel citoplasma del sito della membrana presinaptica. Questo studio conferma la presenza di connessioni sinaptiche complete nelle RO 3D derivate da iPSC. Tuttavia, va notato che un risciacquo incompleto tra le fasi porterebbe alla precipitazione di particelle nere durante il processo di preparazione del campione (Figura 4).

Figura 1: Immagini TEM delle sinapsi del nastro a bastoncino nelle RO. (A,B) Le cellule a bastoncino e orizzontali formano un profilo a forma di ferro di cavallo. Un singolo nastro (punte di freccia) è stato osservato in corrispondenza di ogni sferule dell'asta nell'OPL delle RO, circondato da numerose vescicole. Barre di scala = 0,2 μm. Abbreviazioni: RO = organoidi retinici; HC = cella orizzontale; OPL = strato plessiforme esterno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini TEM delle sinapsi a nastro conico nelle RO. Tre sinapsi a nastro (punte di freccia) erano evidenti in un peduncolo conico nell'OPL delle RO. Barra di scala = 0,2 μm. Abbreviazioni: TEM = microscopia elettronica a trasmissione; RO = organoidi retinici; OPL = strato plessiforme esterno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagine TEM delle sinapsi chimiche nelle RO. Una sinapsi chimica convenzionale è stata osservata tra le cellule amacrine nello strato IPL delle RO. La sinapsi chimica è composta da tre parti: la presinaptica, la fessura sinaptica e la postsinaptica. Ci sono molte vescicole sinaptiche nel citoplasma del sito della membrana presinaptica. Una freccia indica la direzione della trasmissione sinaptica, indicando il trasferimento di numerose vescicole da un processo AC1 a un altro profilo AC2. Barra di scala = 0,2 μm. Abbreviazioni: TEM = microscopia elettronica a trasmissione; RO = organoidi retinici; IPL = strato plessiforme interno; AC = cellule amacrine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Un esempio di un problema che può verificarsi durante il processo di preparazione del campione. Ci sono molte particelle nere (cerchi) nel peduncolo del cono a causa del risciacquo incompleto tra i passaggi. Frecce: sinapsi a nastro. Barra di scala = 0,2 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

In questo articolo, abbiamo presentato un protocollo dettagliato per l'osservazione dell'ultrastruttura sinaptica convenzionale e a nastro nelle RO mediante TEM. Questo protocollo si basa sui metodi di preparazione della retina precedentemente descritti con alcune modifiche²⁰. Per migliorare il tasso di successo del trattamento dei campioni e la qualità delle micrografie TEM, considerare i seguenti punti chiave. In primo luogo, è importante riconoscere che le RO si sviluppano dalle iPSC, formando una massa cellulare priva di vascolarizzazione ^6,26 e cellule gliali²⁶. Questa assenza può portare a un'organizzazione meno compatta rispetto alla retina in vivo. Pertanto, è fondamentale maneggiare delicatamente i Ros per mantenerne la struttura e l'integrità. Aggiungere liquidi lungo la parete del tubo per ridurre al minimo il disturbo.

È importante assicurarsi che il tessuto sia completamente disidratato nella fase 4 del protocollo e accendere il deumidificatore per ridurre l'umidità della stanza prima di iniziare la fase di disidratazione. Quando si sostituisce l'acetone, operare rapidamente e lasciare un po' di liquido per immergere il tessuto, prevenendo una grave distruzione della struttura tissutale RO. Il tessuto non disidratato si contrae bruscamente ad altitudini EM elevate e l'acqua nel tessuto ostacola la penetrazione dell'agente incorporante.

Poiché le RO si presentano come sfere trasparenti, garantire la direzione corretta durante il taglio di fette semisottili per ottenere strutture lamellari intatte. Infine, le RO allo stadio 3 (circa dopo D100-D150) sono considerate mature e possiedono sinapsi integrali¹², per cui si raccomanda di condurre l'indagine dei contatti sinaptici, comprese le sinapsi a nastro e le sinapsi chimiche.

Sebbene in studi precedenti sia stata fornita una prova ultrastrutturale limitata delle sinapsi RO, non ci sono dettagli sulla procedura completa di preparazione del campione RO e sull'identificazione di vari tipi di strutture sinaptiche 12,13,24. Capowski et al. hanno utilizzato diverse tecniche per studiare le caratteristiche delle RO indotte da diverse linee hPSC in diversi stadi, comprese le micrografie elettroniche che mostrano l'esistenza di sinapsi a nastro cariche di vescicole nel peduncolo del cono, che hanno rivelato che le RO nello stadio 3 indotte da varie linee hPSC sono mature e funzionali¹². Utilizzando TEM e l'imaging a due fotoni, Cowan et al. hanno confermato la formazione di strutture sinaptiche a nastro funzionali negli RO maturi¹³, ma il tipo di sinapsi non è stato indicato (sinapsi a cono o a bastoncello). Tuttavia, i nostri diversi lotti di risultati micrografici hanno mostrato la struttura della membrana delle sinapsi a nastro con una chiarezza e un contrasto ideali, il che dimostra che il nostro metodo è fattibile e riproducibile. Inoltre, abbiamo identificato diversi tipi di sinapsi in base alle loro diverse caratteristiche morfologiche: le sinapsi a cono sono solitamente più grandi e hanno diversi nastri mentre le sinapsi a bastoncello sono solitamente più piccole, mostrando un solo nastro; Nelle sinapsi chimiche, le vescicole si accumulano nelle strutture presinaptiche e la densità elettronica della fessura sinaptica è aumentata.

L'integrità ultrastrutturale dei contatti sinaptici nelle RO è vitale per la loro funzione. L'impiego della TEM per studiare questi contatti offre vantaggi ampi e significativi in vari campi, come lo studio della patogenesi della retina in vitro, la conduzione di screening farmacologici nelle RO e la valutazione delle tecniche di differenziazione delle RO, tra le altre applicazioni. Limitato dall'imaging TEM 2D, è osservabile solo un aspetto specifico dell'ultrastruttura degli RO, rendendo difficile l'analisi stereoscopica dell'intera struttura della sinapsi. Inoltre, la limitatezza della differenziazione contribuisce a far sì che le cellule ^13,26 siano fuori posto, complicando ulteriormente il processo di osservazione. Pertanto, la combinazione dell'EM di volume con la ricostruzione 3D potrebbe superare queste carenze in futuro.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra di Petri da 100 mm	Corning	430167
Acetone Microscopia	elettronica Scienza	10000
B27 supplemento	Gibco	A3582801
Sollevatore cellulare	Santa Cruz	sc-395251
Griglie in rame	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
Software per micrografie digitali	Gatan, Inc.
Software Dispase	StemCell Technologies	#07913	Proteasi batterica
DMEM/F12 medio	Gibco	#11320033
Stampo per inclusione	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
Microscopia elettronica in resina Epon-812	Scienza	#14900
Siero fetale bovino (FBS)	Industrie biologiche	#04-0021A
Microscopia elettronica	glutaraldeide	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co., Ltd.	RC01001-A
Piombo citrato	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	Sostituto della L-glutammina
Matrigel	Corning	356234
Vetrino per microscopio	CITOTEST	80312-3161
Integratore N2	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	Un componente di PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	Un componente di PB/PBS
Aminoacidi non essenziali	Sigma	#M7145
Microscopio ottico	Microscopio biologico binoculare da laboratorio	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Forno	Bluepard	BPG9040A
Scienza	della microscopia elettronica	157-8
Penicillina-streptomicina	Gibco	#15140-122
Microtomo semi/ultrasottile	Reichert-Jung	396649
Taurina	Sigma	#T0625
blu di toluidina	Sangon Biotech	E670105-0100
Microscopi elettronici a	trasmissioneHITACHI	H-7500
Acetato di uranile	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoetanolo	Sigma	444203