Articolo metodologico

Tecnica di coltura in vitro per lo studio della dinamica cellulare nelle squame di zebrafish

DOI:

10.3791/66619

⸱

10 gennaio 2025

 , 
1Department of Biology, Mount Saint Vincent University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo offre un metodo per studiare la dinamica cellulare utilizzando una semplice tecnica di coltura in vitro . Offre ai ricercatori e agli educatori del pesce zebra l'opportunità di studiare i processi cellulari, come quelli legati all'omeostasi ossea e alla biologia cellulare di base, visualizzando nuclei fluorescenti e cellule apoptotiche all'interno delle squame.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le squame di zebrafish offrono una serie di vantaggi per l'uso in laboratori standard per scopi didattici e di ricerca. Le squame possono essere facilmente raccolte senza la necessità di eutanasia, si rigenerano entro un paio di settimane e sono traslucide e piccole, consentendo di visualizzarle utilizzando un microscopio standard. Le squame di pesce zebra sono particolarmente utili negli ambienti educativi, in quanto offrono agli studenti un'opportunità unica di impegnarsi in esperienze di apprendimento pratico, in particolare nella comprensione delle dinamiche cellulari e dei metodi di coltura in vitro . L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di descrivere un metodo per la raccolta e il mantenimento delle squame di zebrafish in coltura da utilizzare in una varietà di studi biologici utilizzando attrezzature di laboratorio di base. Inoltre, il protocollo descrive in dettaglio il loro utilizzo nella comprensione dell'omeostasi ossea esaminando l'attività delle cellule ossee coinvolte nel riassorbimento e nella deposizione ossea. Include anche protocolli aggiuntivi per tecniche generali, come la visualizzazione di nuclei e cellule apoptotiche. Il protocollo di coltura in vitro produce risultati affidabili con reagenti e attrezzature minimi. Questo articolo discute i vantaggi dell'utilizzo di colture in vitro di squame di pesce zebra per promuovere la ricerca scientifica e delinea le risorse necessarie per sostenere la loro integrazione nei contesti educativi.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negli ultimi anni, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un prezioso organismo modello in vari campi scientifici, tra cui la genetica, la biologia dello sviluppo e la tossicologia 1,2,3. I pesci zebra sono piccoli pesci tropicali d'acqua dolce originari dei fiumi del sud-est asiatico4. Sono diventati un popolare organismo modello in biologia grazie alla loro facile manutenzione, alle piccole dimensioni, al rapido ciclo riproduttivo e agli embrioni traslucidi1. Ciò consente una facile osservazione del loro sviluppo interno, rendendoli ideali per lo studio di vari processi biologici nella biologia dello sviluppo. Il pesce zebra condivide somiglianze genetiche con gli esseri umani; Circa il 70% dei geni umani ha almeno una controparte zebrafish, il che li rende un modello eccellente per lo studio di disturbi e malattie genetiche nell'uomo 5,6. Manipolando geni specifici nel pesce zebra, i ricercatori possono ottenere preziose informazioni sulla funzione e sul comportamento dei geni, che possono quindi essere applicate alla ricerca sulla salute umana6, all'editing genetico e alla creazione di linee transgeniche 7,8.

Le squame di pesce zebra si rigenerano dopo la rimozione 9,10 e possono essere coltivate per uno o tre giorni con un'incubatrice di base (non CO2) mentre vengono utilizzate per gli esperimenti11. L'uso di squame di pesce zebra è vantaggioso nei laboratori di base in quanto possono essere rimosse da pesci anestetizzati senza la necessità di eutanasia. Le squame di zebrafish sono un componente dello scheletro dermico, costituito principalmente da due strati: lo strato interno, che è spesso e costituito da tessuto parzialmente mineralizzato formato da strati di fibrille di collagene, e lo strato esterno, che è altamente mineralizzato e contiene una rete di fibrille di collagene intrecciate12,13 (Figura 1A-C). Queste caratteristiche morfologiche e cellulari della cocciniglia sono facilmente osservabili con un microscopio composto standard. Queste caratteristiche rendono le squame di zebrafish un buon modello per lo studio cellulare e molecolare. Ad esempio, le squame di pesce zebra sono state utilizzate per studiare l'omeostasi ossea, compresa l'attività delle cellule ossee11,12. Sono stati anche utilizzati per comprendere la rigenerazione tissutale 9,14,15, le vie geniche e la segnalazione14,16, il metabolismo17, gli studi sul microbiota18, ecc. Il pesce zebra, simile ad altri teleostei, è anche molto sensibile a fattori ambientali come inquinanti e tossine 19,20,21,22. Pertanto, le squame di pesce vengono utilizzate per studiare l'esposizione alle tossine nelle popolazioni ittiche. Queste caratteristiche rendono le scale un modello eccellente per insegnare agli studenti gli impatti dei fattori ambientali sugli organismi viventi. Inoltre, le squame delle linee transgeniche di zebrafish, come Tg(osterix:mCherry) e Tg(runx2a:GFP), potrebbero aggiungere un ulteriore livello di complessità agli esperimenti degli studenti.

In sintesi, utilizzando le squame di zebrafish, i ricercatori possono progettare e condurre esperimenti per studiare vari aspetti della biologia, dai meccanismi cellulari ai cambiamenti ambientali. I pesci zebra sono anche una risorsa preziosa nell'istruzione superiore poiché possono fornire esperienze pratiche nella progettazione sperimentale, nella raccolta dei dati e nell'analisi. Il pesce zebra può anche essere utilizzato in corsi avanzati e programmi incentrati sulla ricerca per esplorare aree di interesse specifiche. Questo articolo descrive un protocollo per l'utilizzo delle squame di pesce zebra negli ambienti di ricerca e di apprendimento in classe.

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Protocollo

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Tutti i protocolli qui descritti seguono le linee guida del Canadian Council on Animal Care e sono stati approvati annualmente dal comitato per la cura degli animali della Saint Mary's University/Mount Saint Vincent University con i numeri di protocollo 20-14 e 21-12. Prima di attuare questo protocollo, gli utenti devono assicurarsi che vengano seguite le linee guida federali e provinciali sull'uso degli animali nella ricerca o nell'insegnamento23. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione dei reagenti per la coltura su scala

  1. Preparare il DMEM medium con HEPES (10 g di DMEM in polvere, 5,95 g di HEPES, in 1 L di acqua distillata o dH2O, pH: 6,91), aliquotare e conservare a 4 °C.
  2. Preparare il terreno di coltura - soluzione di lavoro (88% di terreno DMEM con HEPES, 10% di siero fetale bovino e 2% di penicillina-streptomicina [5000 unità di penicillina e 5 mg di streptomicina per ml] regolato in base al volume necessario il giorno in cui viene eseguito l'esperimento.
    NOTA: La soluzione di lavoro deve essere preparata fresca ogni giorno e non può essere conservata. Il terreno di coltura deve essere mantenuto freddo (a 4 °C o su ghiaccio) fino al momento dell'utilizzo.
  3. Aliquotare la soluzione di lavorazione del terreno di coltura nei contenitori in cui verrà effettuato l'esperimento. In questo caso, sono state utilizzate provette da 0,2 mL o una piastra a 96 pozzetti. Mantenere queste aliquote sul ghiaccio fino al momento del bisogno.
    NOTA: Questa soluzione deve essere preparata fresca e non può essere conservata per più di 1 giorno. Fare riferimento alla Tabella 1 per tutti i reagenti.

2. Rimozione delle squame dai pesci vivi

  1. Preparare un contenitore o una vasca per il pesce zebra con un volume d'acqua di circa 2 L per 4-5 pesci adulti.
    NOTA: I parametri tipici dell'acqua appropriati per il pesce zebra sono pH 7,5, temperatura 28,5 °C, conducibilità 640-781 μS e un ciclo buio-luce di 12-12 ore. Assicurarsi che la temperatura sia costantemente mantenuta nel serbatoio.
  2. Usa una rete per catturare 4-5 pesci zebra adulti e mettili nella vasca di contenimento del pesce zebra preparata sopra.
  3. Preparare un contenitore con almeno 60 ml di acqua dove verrà anestetizzato il pesce.
    NOTA: I pesci devono essere in grado di muoversi nel contenitore ed essere abbastanza profondi da evitare che saltino fuori. Questo contenitore deve contenere tricoina metanosolfonato tamponato allo 0,01% (MS222), che deve essere costituito da acqua di zebrafish (diluire lo 0,1% di MS222, che viene preparato con 0,3 g di MS222, 615 μL di 1 M NaOH in 300 mL di sistema idrico di zebrafish, dieci volte).
    ATTENZIONE: Le persone che conducono questi esperimenti devono avere l'approvazione del comitato etico animale istituzionale per catturare, anestetizzare e maneggiare il pesce zebra. Allo stesso modo, l'anestetico utilizzato è una bassa concentrazione di tricaina metano-solfonato (MS222), che è una sostanza chimica comunemente usata nella biologia dei pesci ma che richiede una manipolazione adeguata, come dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti monouso in nitrile, occhiali di sicurezza/occhiali antispruzzo e camice da laboratorio (fare riferimento alla scheda di sicurezza di MS222 per ulteriori informazioni).
  4. Preparare un contenitore di recupero con le stesse specifiche utilizzate in precedenza nella fase 1 (almeno 2 L di acqua) dove verranno posizionati i pesci dopo la rimozione delle incrostazioni. Questo contenitore dovrebbe avere spazio sufficiente e i parametri dell'acqua corretti, come notato sopra.
  5. Usando una rete, trasferisci con cura un singolo pesce zebra adulto nel contenitore con lo 0,01% di MS222. Attendere che il pesce sia completamente immobile e abbia un movimento opercolare minimo (di solito ci vogliono meno di 10 minuti).
    NOTA: L'intero passaggio viene eseguito un pesce alla volta. Non anestetizzare il pesce successivo fino a quando le squame non sono state rimosse con successo dal pesce che viene maneggiato e fino a quando quel pesce non è stato trasferito nel contenitore di recupero.
  6. Posizionare individualmente il pesce zebra adulto su una capsula di Petri capovolta foderata con un tovagliolo di carta bagnato.
  7. Sotto uno stereomicroscopio da dissezione e utilizzando una pinza fine, rimuovere un massimo di 10-12 squame da un singolo pesce. Le squame vengono rimosse dalla regione laterale del pesce, dove le squame sono più grandi e hanno una dimensione più costante rispetto alle altre parti del corpo (Figura 2). Entrambi i lati del pesce possono essere utilizzati.
    1. Rimuovere le squame una alla volta tirando delicatamente nella direzione naturale della squama (cioè nella direzione da anteriore a posteriore). Questo dovrebbe essere fatto il più rapidamente possibile.
  8. Collocare ogni singola bilancia in una provetta separata da 0,2 mL contenente la soluzione di lavorazione del terreno di coltura per bilancia (preparata al punto 1.1) per evitare la degradazione delle squame. In alternativa è possibile utilizzare una piastra a 96 pozzetti.
    NOTA: L'isolamento delle singole squame in tubi o pozzetti separati impedisce che le squame si attacchino tra loro e consente il tracciamento delle singole squame che potrebbero essere necessarie per più esperimenti.
  9. Se l'esperimento specifico richiede un trattamento in scala, applicarlo in questo passaggio. Per esempi di alcuni protocolli, fare riferimento ai passaggi 4 e 5.
  10. Mettere le provette con la bilancia all'interno di un'incubatrice a 28 °C. Il terreno di coltura deve essere sostituito ogni 24 ore (con la soluzione di lavoro del terreno di coltura). Per gli esperimenti qui descritti è stato utilizzato un incubatore non contenente CO2 .
  11. Dopo la rimozione delle incrostazioni, rimettere con cura il pesce zebra nella vasca di recupero e monitorarlo fino alla ripresa del movimento. Una pipetta o una pietra di aerazione viene utilizzata per fornire aria nel serbatoio per accelerare il recupero.
  12. Una volta ripristinato il movimento, riportare il pesce zebra in una normale vasca di allevamento. Ricordati di tenere i pesci che sono stati utilizzati separatamente da qualsiasi altro pesce in modo che possano riprendersi separatamente e di tenere traccia di quali pesci stanno attivamente rigenerando le loro squame.
  13. Attendere ~2 settimane prima di ripetere la rimozione delle squame da questi stessi pesci. Questo dà loro il tempo di rigenerare le loro squame in modo naturale.

3. Fissazione delle squame

  1. Lavare la bilancia tre volte con 200 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) preparata da 10x PBS (per 1 L, aggiungere 80 g di NaCl, 2 g di KCl e 11,2 g di Na2HPO4, aggiungere dH2O fino a 1 L).
  2. Rimuovere 1x PBS e aggiungere 200 μl di paraformaldeide (PFA) al 4% per una notte a 4 °C. Per 100 ml di PFA, aggiungere 4 g di paraformaldeide e 0,1 g di NaOH, quindi aggiungere 1x PBS fino a 100 mL. Mescolare su una piastra calda a fuoco basso e mescolare fino a quando la soluzione non è limpida, quindi lasciare raffreddare la soluzione e stabilizzare il pH a 7,4. Conservare a -20 °C. Per i dettagli, consultare il fascicolo supplementare 1 (Tabella 1).
  3. Dopo il fissaggio, lavare la bilancia tre volte con 200 μL di 1x PBS. Conservare la bilancia a 4 °C.
    ATTENZIONE: Il PFA è dannoso. Per ulteriori informazioni, fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza. Tutti questi processi richiedono una manipolazione adeguata, come dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti monouso in nitrile, occhiali di sicurezza/occhiali antispruzzo e un camice da laboratorio.

4. Omeostasi ossea

NOTA: Di seguito sono descritte due procedure di omeostasi ossea. La fosfatasi acida resistente ai tartrati (TRAP) e la colorazione con fosfato alcalino (AP) sono tipicamente utilizzate per identificare rispettivamente gli osteoclasti e gli osteoblasti attivi. Gli osteoclasti riassorbono la matrice ossea mentre gli osteoblasti depositano la matrice ossea. AP è il principale enzima rilasciato dagli osteoblasti durante la formazione ossea, mentre TRAP viene secreto dagli osteoclasti nello spazio acido tra l'osteoclasta e la matrice ossea, aiutando la disgregazione e il riassorbimento osseo 24,25,26. Questo protocollo è disponibile anche su The Zebrafish Information Network27ed è stato precedentemente pubblicato28. La fosfatasi alcalina è un enzima prodotto da più tipi di cellule come parte del processo metabolico. Questo processo non è del tutto specifico per gli osteoblasti, ma nel tessuto osseo viene utilizzato come marcatore per la funzione degli osteoblasti.

  1. Colorazione con fosfatasi acida resistente ai tartrati (TRAP)
    1. Inserire ciascuna scala fissa in una provetta da 0,2 mL o in una piastra a 96 pozzetti con 200 μL di dH2O. Lavare le squame aggiungendo e rimuovendo circa 150 μL di dH2O per 15 minuti per tre volte. Per i dettagli, consultare il fascicolo supplementare 1 (Tabella 2).
    2. Rimuovere le squame dalla provetta da 0,2 mL o dal pozzetto e inserirle in una nuova provetta contenente 200 μl di tampone tartrato da 50 mM. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
      1. Per 100 mM di tampone tartrato, preparare un contenitore di vetro, aggiungere 2,3 g di acido tartarico e mescolarlo con 0,2 M di tampone acetato (pH 5,5) fino a 100 mL di soluzione. Mescolare bene e conservare a 4 °C. Per preparare 50 mM di tampone tartrato, aggiungere volumi uguali di dH2O e 100 mM di tampone tartrato. Per i dettagli, si veda il fascicolo supplementare 1 (Tabella 3 e Tabella 4).
    3. Rimuovere il tampone tartrato dalla provetta e aggiungere 200 μl di soluzione di substrato TRAP. Incubare i campioni per 1 ora a temperatura ambiente. Assicurarsi che i campioni rimangano al buio.
      1. Preparare un contenitore di vetro scuro e aggiungere 30 mL di tampone tartrato 100 mM, 1 mL di PRS esazotizzato (soluzione di pararosanilina cloridrato) e 2 mL di soluzione di substrato enzimatico. Mescolate bene.
        NOTA: Questa soluzione non può essere conservata; Tenerlo al buio a temperatura ambiente durante l'uso. Per le soluzioni necessarie per preparare la soluzione di substrato TRAP, vedere il file supplementare 1 (Tabelle 5-9).
    4. Rimuovere la soluzione di substrato TRAP e lavare le squame aggiungendo e rimuovendo circa 150 μL di dH2O per 15 minuti, tre volte.
    5. Rimuovere le squame dalla provetta e inserirle in una nuova provetta o in un pozzetto con 200 μL di glicerolo all'80% (per 100 mL, mescolare 80 mL di glicerolo con 20 mL di dH2O) avvolti in un foglio di alluminio per evitare che sbiadiscano e conservarli a 4 °C.
    6. Per visualizzare le squame al microscopio, utilizzare un vetrino a depressione o concavo.
  2. Colorazione con fosfato alcalino (AP)
    1. Posizionare ciascuna scala fissa in una provetta da 0,2 mL o in una piastra a 96 pozzetti con 200 μL di dH2O e lavarla aggiungendo e rimuovendo circa 150 μL di dH2O per 15 minuti, tre volte. Per i dettagli, consultare il fascicolo supplementare 1 (Tabella 2).
    2. Rimuovere le squame dalle provette o dai pozzetti da 0,2 mL e inserirle in una nuova provetta contenente 200 μL di tampone tris-maleato e incubarla per 1 ora a temperatura ambiente.
      1. Per questo tampone, preparare un contenitore di vetro e aggiungere 0,605 g di tris tampone e 0,55 g di acido maleico. Aggiungere dH2O fino a 25 mL e mescolare bene. Stabilizzare a pH 8,3. Conservare a 4 °C. Per i dettagli, si veda il fascicolo supplementare 1 (tabella 10).
    3. Rimuovere il tampone tris-maleato dalla provetta e aggiungere 200 μl di soluzione di substrato AP. Incubarlo per 1 ora a temperatura ambiente. Assicurarsi che i campioni rimangano al buio.
      1. Per questa soluzione, preparare un contenitore di vetro scuro, aggiungere 8 mg di sale di diazonio e mescolarlo con 0,1 ml di naftolo-AS-TR-fosfato in N,N-dimetilformammide e 10 ml di tampone tris-maleato (pH 8,3), mescolare bene. Prepara questa soluzione fresca. Per i dettagli, si veda il fascicolo supplementare 1 (tabella 11).
    4. Rimuovere la soluzione di substrato AP e lavare le squame aggiungendo e rimuovendo 200 μl di dH2O per 15 minuti, tre volte.
    5. Rimuovere le squame dalla provetta e inserirle in una nuova provetta o in un pozzetto con 200 μl di glicerolo all'80% avvolto in un foglio di alluminio per evitare che sbiadisca. Conservare a 4 °C.
    6. Per visualizzare le squame utilizzando un microscopio, posizionare le squame su un vetrino concavo o a depressione.
      ATTENZIONE: La maggior parte dei reagenti utilizzati nella colorazione TRAP e AP può essere dannosa. Fare riferimento alla scheda di sicurezza di ciascuna sostanza chimica. Tutte queste procedure richiedono una corretta manipolazione, come dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti monouso in nitrile, occhiali di sicurezza/occhiali antispruzzo e un camice da laboratorio.

5. Visualizzazione della dinamica cellulare nelle squame di zebrafish

NOTA: È possibile utilizzare una serie di metodi di colorazione per visualizzare le differenze tra le scale e per etichettare le celle all'interno della scala (Figura 3B). Ad esempio, i metodi per colorare i nuclei e i lisosomi all'interno delle cellule della bilancia sono descritti di seguito.

  1. Colorazione DAPI per la visualizzazione dei nuclei cellulari
    NOTA: DAPI viene utilizzato per marcare i nuclei di tutte le cellule etichettando il DNA. DAPI è un marcatore fluorescente che si lega fortemente alle regioni arricchite per adenina e timina nelle sequenze di DNA.
    1. Prima di utilizzare DAPI, assicurarsi che le scale siano fissate in paraformaldeide al 4% (passaggio 3). Lavare la bilancia con 200 μl 1x PBS per 5 minuti dopo il fissaggio.
    2. Preparare una soluzione di lavoro DAPI in diluizione 1:10 come segue. Miscelare 1 μl di DAPI con 9 μl di 1x PBS per ottenere un volume totale di 10 μl.
    3. Dopo aver preparato la soluzione DAPI, utilizzare una pinza o una pipetta di plastica per posizionare la bilancia su un vetrino concavo, rimuovere il PBS in eccesso e aggiungere circa 10 μl della soluzione DAPI preparata.
      NOTA: DAPI colora immediatamente la scala, in modo che possa essere visualizzata utilizzando un microscopio a fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 352-402 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 417-477 nm. DAPI colora tutti i nuclei cellulari di un colore blu brillante. Per vedere l'intera scala nel campo visivo, è stato utilizzato l'obiettivo 4x. I singoli nuclei colorati sono visibili utilizzando l'obiettivo 20x.
    4. Contare il numero di nuclei colorati con DPI per determinare il numero di cellule nella scala.
  2. Colorazione apoptotica per la visualizzazione della morte cellulare in campioni vivi
    NOTA: I coloranti fluorescenti possono essere utilizzati per etichettare le cellule apoptotiche. Ad esempio, il protocollo del marcatore di fluorescenza utilizzato qui è per ambienti acidi e può essere utilizzato per etichettare e tracciare organelli acidi come i lisosomi. Un aumento del numero di questi organelli è correlato a un aumento della morte cellulare. Questa colorazione deve essere applicata su squame non fissate che sono state appena estratte o sono state coltivate per un massimo di 2 giorni.
    1. Preparare una soluzione del colorante fluorescente per il monitoraggio dell'apoptosi secondo le istruzioni del produttore utilizzando il terreno di coltura come diluente.
      NOTA: La concentrazione della macchia fluorescente può cambiare drasticamente a seconda del metodo di apoptosi utilizzato. Fare riferimento al protocollo commerciale per il colorante di scelta per dettagli specifici sulle concentrazioni consigliate.
    2. Rimuovere con cautela il terreno di coltura da ogni provetta da 0,2 mL o pozzetto da una piastra a 96 pozzetti se le squame sono state precedentemente coltivate.
    3. Aggiungere una quantità di soluzione colorante fluorescente sufficiente a coprire l'intera scala (circa 50 μL).
    4. Coprire tutti i tubi con un foglio di alluminio per evitare che sbiadiscano e lasciare agire per 30 minuti.
    5. Rimuovere la soluzione colorante fluorescente dai tubi o dai pozzetti.
    6. Lavare i campioni aggiungendo 200 μl di 1x PBS alle provette o ai pozzetti per 5 minuti.
    7. Rimuovere il PBS e aggiungere 200 μl di PFA al 4% alle provette o ai pozzetti per fissare i campioni per 1 ora a temperatura ambiente.
    8. Lavare i campioni aggiungendo 200 μl di 1x PBS alle provette o ai pozzetti per 5 minuti.
    9. Trasferire la bilancia in una nuova provetta da 0,2 ml o in un pozzetto e aggiungere 200 μl di 1x PBS fresco. Coprire questi tubi/pozzetti con un foglio di alluminio per evitare che sbiadiscano. Conservare a 4 °C.
    10. Per visualizzare le squame con un microscopio a fluorescenza, utilizzare un vetrino concavo o a depressione e il filtro corretto. Il segnale fluorescente qui utilizzato ha un'eccitazione e un'emissione massime di 577-590 nm. La colorazione fluorescente mostra cellule apoptotiche contenenti lisosomi in rosso.
    11. Contare il numero di cellule colorate per determinare il numero di cellule sottoposte ad apoptosi.
      NOTA: Il foglio di alluminio viene utilizzato durante la colorazione e la conservazione per evitare lo sbiadimento. I campioni possono essere conservati al buio per un paio d'ore o addirittura giorni, a seconda della colorazione fluorescente utilizzata. Per conservare i campioni fluorescenti per periodi più lunghi, utilizzare un protocollo di fissazione e montaggio compatibile con la colorazione fluorescente. Tutte le colorazioni fluorescenti sono state visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di almeno 20x. Il filtro utilizzato è stato il seguente: per DAPI 417-477 nm; per il tracciamento dell'apoptosi 577-590 nm.

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Risultati

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Recentemente, questo protocollo di coltura a scala è stato utilizzato per studiare l'omeostasi ossea11. Le squame possono sopravvivere nel terreno di coltura per almeno 2 giorni. Il numero di cellule apoptotiche è stato analizzato in ogni giorno di coltura, fino a un massimo di tre giorni, contando le cellule marcate. Questi risultati hanno mostrato che le cellule apoptotiche aumentavano significativamente il terzo giorno di coltura, indicando che il tempo di coltura dovrebbe essere limitato a due...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le squame di zebrafish sono un modello in vitro facilmente accessibile per studiare una varietà di processi biologici diversi che possono essere mantenuti per un massimo di 2 giorni utilizzando un metodo di coltura e un'incubatrice per simulare il loro ambiente naturale11. Le bilance hanno una distribuzione regolare e proporzionale delle cellule presenti, che consente ai ricercatori di visualizzare, contare ed etichettare le cellule e di condurre semplici...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano il personale della Mount Saint Vincent University Aquatic Facility e tutti i membri del laboratorio Franz-Odendaal Bone Development per aver fornito le cure necessarie ai pesci. Un ringraziamento specifico ad Alisha McNeil, Keely A. MacLellan e Shirine Jeradi per l'assistenza nell'ottimizzazione di alcuni protocolli. Questa ricerca è stata supportata da finanziamenti dell'Agenzia spaziale canadese (CSA) [19HLSRM01] e del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da 0,2 mLn/an/a
37% HCl EMDHX0603-4Per la stabilizzazione del pH e la preparazione del
vetrino PRS Concaven/an/a
DAPIVectashieldH-1200Per la visualizzazione dei nuclei cellulari
Sale di diazonio (Fast Blue B)SigmaD9805Per la soluzione di substrato AP
Polvere di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Sigma D5523Per terreni di coltura in scala 
Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato (MS222) Sigma E10521Per la preparazione di 0,1% MS222
Siero fetale bovino Sigma F4135Per terreni di coltura in scala 
Microscopio a fluorescenzan/an/a
Acido acetico glaciale PescatoreA38 212Per tampone acetato
GliceroloVWRBDH1172-4LPPer glicerolo all'80% - bilancia di stoccaggio
HEPES ThermoFisher 15630106Per terreni di coltura su scala 
Piastra riscaldanten/an/a
KCl SigmaP217-10Per la preparazione di PBS
LysotrackerThermoFisherL7528Per la visualizzazione dei lisosomi
Acido maleicoSigmaM0375Per tampone Tris-Maleato 
Micropipettan/an/a
Sigma319937Per soluzione substrato AP
N,N-dimetilformammide Sigma319937per soluzione di substrato enzimatico
Na2HPO4 EMDSX0720-1Per la preparazione di PBS
NaCl Sigma S9888Per la preparazione di PBS
NaNO2SigmaS-2252Per il 4% di NaNO2
NaOH SigmaS5881Per la preparazione di PFA
NaOH Sigma S5881Per la fissazione delle incrostazioni e la stabilizzazione del pH
Naptolo-AS-TR-fosfatoSigmaN6125Per soluzione di substrato AP
Naptolo-AS-TR-fosfato SigmaN6125per soluzione di substrato enzimatico
Pararosanilina cloridrato SigmaP3750per PRS
Penicillina-streptomicina 5000 unità penicillina e 5mg streptomicina / mlThermoFisher15140122Per terreni di coltura su scala 
Dispositivi di protezione individuale (DPI): guanti monouso in nitrile, occhiali di sicurezza/occhiali antispruzzo e camice da laboratorio.n/an/a
PFA Sigma P6148Per il fissaggio della bilancia
Acetato di sodio Sigma S2889Per tampone acetato
Microscopio composto standardn/an/a
agitazionen/an/a
Acido tartaricoSigmaT6521Per tampone tartrato
Tris baseRoche03 118 142 001Per tampone tris-maleato 
N,N-dimetilformammide al 4%Piastra di

Riferimenti

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