Articolo metodologico

Sistema di sintesi proteica cell-free per la costruzione di cellule sintetiche

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DOI:

10.3791/66626

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19 aprile 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Jiangsu Normal University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive il sistema di sintesi proteica senza cellule (CFPS) utilizzato nella costruzione di cellule sintetiche. Delinea le fasi chiave con risultati rappresentativi in diversi micro-compartimenti. Il protocollo mira a stabilire le migliori pratiche per i diversi laboratori della comunità delle cellule sintetiche, facendo avanzare i progressi nello sviluppo delle cellule sintetiche.

Abstract

Il sistema di sintesi proteica senza cellule (CFPS) è stato ampiamente impiegato per facilitare l'assemblaggio dal basso verso l'alto di cellule sintetiche. Funge da ospite per il macchinario centrale del Dogma Centrale, rappresentando un telaio ottimale per l'integrazione e l'assemblaggio di diversi sistemi di mimetismo cellulare artificiale. Nonostante il suo uso frequente nella fabbricazione di celle sintetiche, la creazione di un sistema CFPS robusto e su misura per un'applicazione specifica rimane una sfida non banale. In questo articolo sui metodi, presentiamo un protocollo completo per il sistema CFPS, abitualmente impiegato nella costruzione di cellule sintetiche. Questo protocollo comprende le fasi chiave della preparazione del sistema CFPS, tra cui l'estratto cellulare, la preparazione del modello e l'ottimizzazione dell'espressione di routine utilizzando una proteina reporter fluorescente. Inoltre, mostriamo risultati rappresentativi incapsulando il sistema CFPS all'interno di vari micro-compartimenti, come goccioline monostrato, vescicole a doppia emulsione e camere situate sopra doppi strati lipidici supportati. Infine, chiariamo i passaggi critici e le condizioni necessarie per il corretto assemblaggio di questi sistemi CFPS in ambienti distinti. Ci aspettiamo che il nostro approccio faciliti la creazione di buone pratiche di lavoro tra i vari laboratori all'interno della comunità delle cellule sintetiche in continua espansione, accelerando così i progressi nel campo dello sviluppo delle cellule sintetiche.

Introduzione

La sintesi di cellule sintetiche o artificiali è emersa come un campo di ricerca interdisciplinare molto importante, attirando un notevole interesse da parte di scienziati nei settori della biologia sintetica, della chimica e della biofisica. Questi scienziati sono uniti dall'obiettivo comune di costruire una cellula vivente minima 1,2,3. La rapida crescita di questo campo è andata di pari passo con i progressi significativi nelle tecnologie critiche, come la manipolazione del DNA ricombinante4, i materiali biomimetici5 e le tecniche di microfabbricazione per la compartimentazione6, incluso il metodo di sintesi proteica libera da cellule (CFPS)7. I sistemi CFPS comprendono il macchinario cellulare essenziale per la trascrizione e la traduzione, fornendo il quadro di base per lo sviluppo e l'integrazione di cellule artificiali multifunzionali.

Sebbene le tecniche CFPS siano spesso utilizzate nell'assemblaggio di celle sintetiche, lo sviluppo di un sistema CFPS robusto e su misura per l'assemblaggio di vari sistemi di celle sintetiche rimane una sfida complessa. Attualmente, sono disponibili numerosi sistemi CFPS, derivati sia da organismi modello di procarioti che di eucarioti8, ciascuno specializzato per particolari applicazioni nella sintesi cellulare sintetica. Oltre al loro ruolo centrale nella trascrizione e nella traduzione, i sistemi CFPS variano nei loro componenti principali e nelle procedure di preparazione associate. Queste variazioni, che includono differenze negli estratti cellulari, nelle RNA polimerasi, nei metodi di preparazione dei modelli e nelle composizioni dei tamponi, sono in gran parte dovute alle distinte traiettorie di sviluppo perseguite dai gruppi di ricerca che hanno ottimizzato intensamente i loro sistemi per la massima resa proteica.

Tra i vari componenti del sistema CFPS, l'estratto cellulare è un pool enzimatico critico per la trascrizione e la traduzione, e quindi un determinante chiave delle prestazioni della CFPS9. La CFPS a base di Escherichia coli (E. coli) è il sistema più comunemente utilizzato grazie al suo status di organismo procariotico meglio conosciuto. Inoltre, il gruppo di ricerca di Ueda ha sviluppato un sistema CFPS completamente ricostituito che comprende proteine e ribosomi purificati individualmente, noto come PURE10, particolarmente adatto per applicazioni che richiedono un background chiaro. Oggi, anche i sistemi CFPS basati su E. coli si sono diversificati, soprattutto in termini di ceppi sorgente per l'extrac11 e i metodi di preparazione12,13, RNA polimerasi14,15, fonti di energia16,17 e sistemi tampone18,19. I ceppi più frequentemente utilizzati includono i derivati dei ceppi K12 e B, come A1920, JM10921, BL21 (DE3)22 e Rossetta223, insieme alle loro controparti geneticamente modificate.

Inizialmente, sono stati scelti ceppi di E. coli con ridotte attività di RNasi e proteasi per migliorare la stabilità dell'mRNA e la stabilità delle proteine ricombinanti di nuova sintesi, portando a un aumento delle rese proteiche finali24. Successivamente, gli estratti di E. coli sono stati ingegnerizzati per facilitare specifiche modifiche post-traduzionali, tra cui la glicosilazione25, la fosforilazione26 e la lipidazione27, sono stati sviluppati per ottenere le modifiche post-traduzionali di cui sopra. Inoltre, è stata incorporata una serie di additivi come chaperon molecolari28 e stabilizzanti chimici per aiutare il ripiegamento delle proteine bersaglio, contribuendo alla diversificazione dei sistemi CFPS. La batteriofago T7 RNA polimerasi, nota per la sua elevata processività, è prevalentemente impiegata per la trascrizione, sebbene siano state utilizzate anche altre polimerasi come SP629. L'RNA polimerasi endogena di E. coli è stata adattata per la prototipazione di circuiti genetici sfruttando i fattori sigma30. Infine, una varietà di precursori energetici 31,32,33 e diversi sali e componenti tampone 19,34,35 sono stati sistematicamente ottimizzati per migliorare la produttività.

Oltre al sistema CFPS stesso, anche i metodi di incapsulamento e i materiali di compartimentazione sono vitali per il successo dell'assemblaggio di celle sintetiche. Vari sistemi che sono stati sviluppati per incapsulare con successo la reazione CFPS includono goccioline di acqua/olio stabilizzate con tensioattivo, lipidi/polimero e le loro vescicole unilamellari ibride (con diametri che vanno da 50 nm a diversi μm), nonché doppi strati lipidici supportati da planari. Tuttavia, a causa del contenuto di molecole complessate del sistema CFPS, il tasso di successo dell'incapsulamento dipende da casi specifici, in particolare per la formazione di vescicole. Per migliorare il tasso di successo e l'efficienza dell'incapsulamento della CFPS, sono stati sviluppati vari chip di microfluidi per facilitare la formazione di goccioline e vescicole36. Tuttavia, sarà necessario stabilire chip e dispositivi aggiuntivi.

Questo protocollo delinea un sistema CFPS di E. coli che utilizza il ceppo BL21(DE3), che è un ospite comunemente impiegato per la produzione di proteine ricombinanti. Il protocollo comprende un resoconto dettagliato della preparazione dell'estratto cellulare, della preparazione del modello e dell'ottimizzazione dell'espressione standard utilizzando una proteina reporter fluorescente. Inoltre, presentiamo risultati esemplari ottenuti incapsulando il sistema CFPS all'interno di diversi micro-compartimenti, tra cui goccioline monostrato, vescicole a doppia emulsione e camere situate sopra doppi strati lipidici supportati. Infine, vengono illustrati gli elementi procedurali fondamentali e le condizioni necessarie per il successo dell'istituzione di questi sistemi di PCPS in contesti ambientali distinti.

Protocollo

1. Preparazione dell'estratto

  1. Strisciare il ceppo di E. coli BL21 (DE3) da uno stock di glicerolo su una piastra di agar Luria Bertani (LB) e incubare per almeno 15 ore a 37 °C.
  2. Preparare una precoltura notturna inoculando una singola colonia dalla piastra LB appena preparata in un pallone da 50 ml di terreno Luria Bertani (LB).
  3. Inoculare 5 mL di precoltura in 500 mL di terreno 2xYTPG in un pallone di Erlenmeyer da 3 L sconcertato. Coltivatela a 37 °C agitandola vigorosamente (tra 220 giri/min e 250 giri/min) e raccogliete le cellule quando raggiungono la fase di metà log (OD600 ~ 3). Quindi, immergere le colture cellulari in acqua fredda e ghiacciata per 10 minuti e centrifugare a 8.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
    NOTA: In questa fase, il glucosio nel terreno 2xYTPG può essere omesso per applicazioni specifiche 9,12.
  4. Risospendere i pellet di cellule risultanti in 35 mL di tampone S30 A preraffreddato, quindi centrifugare a 8.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
  5. Ripetere il passaggio 1.4 due volte.
    NOTA: I pellet della cella possono essere conservati a -80 °C se non vengono utilizzati immediatamente.
  6. Risospendere i pellet finali nel tampone S30 B (ad esempio, utilizzare 1,1 mL di tampone S30 B per 1 g di pellet cellulare) e disgregare le celle con un passaggio attraverso la French Press a 17.000 psi.
    1. Per l'utilizzo della French Press, seguire il manuale dell'utente e trasferire la sospensione della cella nella camera di disgregazione metallica della French Press, assicurandosi che tutti i componenti siano assemblati e che la valvola inferiore della camera di disgregazione sia chiusa.
    2. Trasferire la camera di disgregazione assemblata sulla piattaforma idraulica e fissare il blocco di sicurezza.
    3. Accendere la pompa idraulica e avviare l'interruzione.
    4. Controllare la valvola di uscita per consentire alla sospensione cellulare di defluire dal tubo di uscita in una nuova provetta da 50 mL. Regola la velocità del flusso per garantire un'interruzione efficiente, idealmente una goccia alla volta. Mantenere la pressione al di sopra del limite inferiore di 15.000 psi.
  7. Centrifugare il lisato risultante a 30.000 × g per 30 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante. Ripetere la centrifugazione una volta e raccogliere il surnatante. Aggiungere 0,3 volumi di tampone di preincubazione nel surnatante raccolto e incubare agitando delicatamente a 37 °C per 80 minuti.
    NOTA: L'uso del tampone di preincubazione potrebbe aumentare la resa finale, anche se è stato riportato che un run-off vuoto (senza tampone di preincubazione) potrebbe anche migliorare l'efficienza37,38, che dipende dal ceppo sorgente corrispondente.
  8. Dializzare la miscela di deflusso risultante per 2 ore contro 2 L di tampone S30 C, sostituire una volta il tampone di dialisi con 2 L di tampone S30 C fresco e dializzare per una notte a 4 °C39.
    NOTA: La seconda fase della dialisi notturna può essere ridotta a circa 3 ore.
  9. Raccogliere il campione dializzato e centrifugare a 30.000 × g per 30 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante e l'aliquota in volumi appropriati e congelare immediatamente in azoto liquido.
    NOTA: Il campione congelato può essere conservato a -80 °C almeno per 6 mesi o 1 anno senza perdita di efficienza.

2. RNA polimerasi T7

  1. Trasformare il plasmide pAR1219 in cellule competenti di E. coli stella BL21(DE3)40.
  2. Inoculare 10 ml di una coltura notturna in 1 litro di terreno LB (contenente 100 μg/mL di ampicillina). Far crescere le cellule a 37 °C fino a quando OD600 raggiunge 0,6-0,8.
  3. Iniziare l'induzione aggiungendo una concentrazione finale di 1 mM IPTG. Indurre le celle per altre 5 ore e raccogliere per centrifugazione a 8.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Conservare i pellet di celle a -80 °C per un massimo di diverse settimane.
  4. Risospendere i pellet cellulari in 30 mL di tampone T7 A e disgregare le cellule con un passaggio attraverso la French Press a 15.000 psi. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 20.000 × g per 30 minuti a 4 °C.
  5. Aggiungere streptomicina solfato goccia a goccia al surnatante del passaggio precedente, raggiungendo una concentrazione finale del 4% (p/v). Dopo una breve incubazione su ghiaccio, centrifugare a 20.000 × g per 30 minuti a 4 °C.
  6. Filtrare il surnatante attraverso una membrana filtrante da 0,45 μm e caricare il campione filtrato su una colonna a scambio anionico forte (volume della colonna di 40 mL), che è stata prebilanciata con 10 volumi di colonna del tampone T7 B, tramite un sistema cromatografo liquido automatizzato.
  7. Lavare la colonna caricata con 50 volumi di tampone T7 B ed eluire il campione con 10 volumi di colonne di miscele di tampone C T7 a basso contenuto di sale (50 mM NaCl) e ad alto contenuto di sale (500 mM), stabilendo un gradiente di concentrazione lineare di NaCl da 50 a 500 mM a una velocità di flusso di ~3 mL/min41.
  8. Raccogli le frazioni di picco e analizzale con SDS-PAGE.
    NOTA: La polimerasi T7 mostra una banda predominante a ~100 kDa, mentre quantità significative di impurità appaiono ancora sul gel SDS-PAGE.
  9. Raggruppare le frazioni contenenti T7 polimerasi e dializzare contro 2 L di tampone T7 C durante la notte.
  10. Aggiungere glicerolo per raggiungere una concentrazione finale del 10% e concentrare la miscela risultante fino a una concentrazione finale di 3-4 mg/mL mediante ultrafiltrazione42.
    NOTA: Se durante il processo di concentrazione compaiono precipitazioni, arrestare immediatamente e rimuovere i precipitati mediante centrifugazione.
  11. Regolare la concentrazione di glicerolo al 50%. Aliquotare e congelare il campione con azoto liquido. Conservare a −80 °C per un periodo più lungo.
    NOTA: Una piccola aliquota può anche essere conservata a -20 °C per almeno 1 mese senza perdita di efficienza.

3. Preparazione del tampone

  1. Preparare i tamponi come indicato nella Tabella 1 un giorno prima dell'uso.

4. Progettazione e preparazione del modello

  1. Clonare il gene di interesse in un vettore basato sul promotore T7 o generare un prodotto di PCR lineare contenente il gene di interesse.
    NOTA: Vedere la sezione di discussione per i principi di progettazione.
  2. Preparare il plasmide da una coltura notturna utilizzando un kit di estrazione del plasmide.
    NOTA: Si consiglia di selezionare un kit plasmidico che includa una fase di precipitazione dell'isopropanolo seguita da una procedura di lavaggio con etanolo al 70%.
  3. Sciogliere il DNA essiccato in un piccolo volume di acqua ultrapura a una concentrazione compresa tra 200 μg/mL e 500 μg/mL, come determinato da uno spettrofotometro a micro volume.
  4. Opzionale: Esprimere direttamente le proteine dai prodotti di PCR lineare.
    NOTA: In questo caso, è necessaria una fase di purificazione PCR.

5. Ottimizzazione di Mg2+ e K+

  1. Preparare una miscela master per lo screening della concentrazione di Mg2+ come indicato nella tabella 2 o per lo screening della concentrazione di K+ come indicato nella tabella 3.
  2. Trasferire la miscela master in provette per microfusibili individuali o in una piastra a 96 pozzetti a forma di V.
  3. Pipettare il volume esatto delle soluzioni madre di Mg2+ o K+ in provette per microfusi individuali o nella piastra a 96 pozzetti a forma di V e completare le reazioni CFPS con acqua ultrapura. Incubare le reazioni per almeno 2 ore.
    NOTA: Se si utilizza una piastra a 96 pozzetti a forma di V, sigillare la piastra con un coperchio di plastica per evitare l'evaporazione.
  4. Prelevare 2 μl della miscela di reazione e trasferirla in una piastra nera a 96 pozzetti per le misure di fluorescenza con un lettore di piastre.
    NOTA: Utilizziamo un lettore di piastre fluorescenti con la seguente configurazione: eccitazione/emissione: 485/528, guadagno: 50, altezza di lettura: 7,00 mm. Tuttavia, è necessario regolare il lettore di piastre per generare una curva di calibrazione specifica utilizzando proteine fluorescenti purificate.

6. Incapsulamento

  1. Gocciolina
    1. Preparare un olio fluorurato contenente tensioattivo (2% PFPE-PEG in HFE7500) o una soluzione di olio lipidico-minerale sciogliendo il lipide in olio minerale (fare riferimento al passaggio 6.2.1)
    2. Preparare un volume totale di 100 μl di reazione CFPS combinando i corrispondenti reagenti 2-18 della Tabella 4. Aggiungere la reazione CFPS a 500 μl di olio precedentemente preparato in una provetta da 1,5 mL, quindi strofinare energicamente la provetta sulla rastrelliera per provette 50 volte per formare goccioline fini (acqua nell'olio). Incubare la provetta a 30 °C per eseguire la reazione.
      NOTA: Semplici chip microfluidici potrebbero anche essere utilizzati per generare goccioline omogenee43.
  2. Vescicole unilamellari giganti (GUV)
    1. Preparazione della soluzione di olio lipidico-minerale
      1. Aggiungere 57 μL di cloroformio in un flaconcino di vetro da 4 mL e quindi aggiungere 18 μL di lipidi 25 mg/mL di 1-palmitoil-2-oleoil-glicerolo-3-fosfocolina (POPC) per formare la soluzione lipidica di cloroformio, raggiungendo una concentrazione finale di 8 mM (utilizzare altri lipidi con concentrazioni finali simili).
        NOTA: Questa fase di miscelazione ha lo scopo di garantire una miscelazione omogenea di diversi lipidi.
      2. Far evaporare il cloroformio sotto un flusso di argon per 15 minuti, quindi evaporare ulteriormente sotto vuoto per 1 ora.
      3. Sciogliere i lipidi secchi risultanti in 1.500 μL di olio minerale, raggiungendo una concentrazione finale di 400 μM. Incubare la miscela per una notte a temperatura ambiente.
    2. Formazione di uno strato lipidico interfacciale
      1. Aggiungere 500 μl della soluzione esterna (vedere Tabella 5) in una provetta da 1,5 mL e sovrapporre lentamente 250 μl di soluzione di olio lipidico-minerale sopra la soluzione esterna. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per formare uno strato lipidico interfacciale stabile.
    3. Preparazione della soluzione interna
      1. Mescolare tutti i reagenti della Tabella 6 per formare la soluzione interna e tenerla in ghiaccio fino all'uso. Completare la soluzione interna aggiungendo T7RNAP, estratto S30 e stampo di DNA nella soluzione preinterna come reagenti 16-18 elencati nella Tabella 4.
        NOTA: L'aumento della concentrazione di saccarosio incapsulato al di sopra di 250 mM potrebbe inibire la traduzione senza cellule44.
    4. Formazione di GUV
      1. Aggiungere 50 μl di soluzione interna a una nuova provetta da 1,5 mL contenente 500 μl di olio lipidico-minerale, pipettare rapidamente su e giù e agitare energicamente.
      2. Lasciare la provetta in ghiaccio per 10 minuti e aggiungere lentamente 20 μl della miscela di emulsione alla parte superiore della fase oleosa nella provetta da 1,5 mL del passaggio 6.2.2.
      3. Centrifugare a 800 × g (utilizzare una velocità di centrifugazione compresa tra 100 × g e 1000 × g) per 10 minuti a 4 °C e osservare la formazione di GUV sul fondo della provetta.
        NOTA: Potrebbe essere utilizzata una velocità di centrifugazione specifica più elevata; tuttavia, si potrebbe considerare che la velocità di centrifugazione potrebbe influenzare la dimensione dei GUV formati45.
      4. Rimuovere la fase superiore dell'olio.
      5. Aspirare con cura 30 μl di GUV sul fondo della provetta. Incubare i GUV raccolti a 30 °C.
        NOTA: La temperatura di incubazione ottimale varia a seconda delle proteine.
      6. Utilizzare la microscopia confocale a scansione laser (LSM) per monitorare l'espressione delle proteine fluorescenti.
  3. Doppio strato lipidico supportato (SLB)
    1. Preparazione delle camere SLB
      1. Piranha-clean 24 x 24 mm #1.5 vetrini coprioggetti aggiungendo sette gocce di acido solforico e due gocce di perossido di idrogeno al 50% al centro di ciascun vetrino di copertura. Incubare i reagenti sui vetrini coprioggetti per almeno 45 minuti; Sciacquare abbondantemente con acqua ultrapura.
      2. Assemblare la camera di ricostituzione applicando una provetta per microfuge da 0,5 mL sui vetrini coprioggetti puliti utilizzando colla ottica polimerizzata sotto una lampada a raggi ultravioletti (365 nm) per 10 minuti per formare una camera di reazione.
    2. Formazione di SLB
      1. Sciogliere l'80 mol% di 1,2-dioleoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina (DOPC), il 19,95 mol% di 1,2-dioleoil-sn-glicerolo-3-fosfo-L-serina (DOPS) e lo 0,05 mol% di Atto488-DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolammina = DOPE), mescolare in cloroformio, asciugare con un flusso di azoto delicato e aspirare per 1 ora per rimuovere completamente il solvente.
      2. Reidratare il film lipidico essiccato nel tampone SLB A, ottenendo una concentrazione lipidica finale di 4 mg/mL.
      3. Vorticare e sonicare i campioni risultanti fino a quando non diventano chiari.
      4. Diluire 4 mg/mL di SUV con 130 μL di tampone SLB A, trasferire 75 μL della sospensione nelle camere di reazione preformate e incubarla su un blocco termico a 37 °C per 1 minuto. Aggiungere 150 μl di tampone SLB A alla camera di reazione per un'ulteriore incubazione per 2 minuti.
      5. Lavare la camera con 2 mL di tampone SLB B (tampone SLB A senza MgCl2) prima di sostituire il tampone S30 C con BSA allo 0,4% (p/v) per le reazioni CFPS, lasciando 100 μL di tampone all'interno della camera per evitare che l'SLB formato si secchi.
      6. Rimuovere il tampone S30 C residuo e aggiungere con cautela la miscela di reazione CFPS nella camera SLB. Incubare la camera a 30 °C e monitorare l'espressione al microscopio confocale a scansione laser.

Risultati

Per ogni nuovo lotto di estratto cellulare e di RNA polimerasi T7, si raccomanda di eseguire uno screening di base delle concentrazioni di Mg2+ e K+ per garantire le prestazioni ottimali del sistema CFPS. La fluorescenza della supercartella GFP può fungere da indicatore della resa complessiva del sistema CFPS in condizioni variabili, come illustrato nella Figura 1A, B. Inoltre, nella Figura 1C viene mostrato un confronto parallelo della resa del sistema CFPS in diversi compartimenti, che dimostra prestazioni costanti nei sistemi CFPS incapsulati, anche se con una leggera diminuzione dei GUV, potenzialmente dovuta all'influenza del saccarosio46. Inoltre, le reazioni CFPS sono state incapsulate con successo in goccioline (Figura 2), GUV (Figura 3) e sopra SLB (Figura 4).

La Figura 2A evidenzia la formazione di goccioline di emulsione, evidente quando la soluzione di olio diventa turbolenta. L'espressione delle proteine fluorescenti verde/rossa (GFP e mCherry) è stata catturata utilizzando una microscopia confocale a scansione laser. La Figura 3 ha mostrato il successo dell'incapsulamento della reazione CFPS all'interno dei GUV attraverso il semplice processo di trasferimento dell'emulsione. Il canale rosso indicava i lipidi etichettati; il canale verde mostrava l'espressione della supercartella GFP; e il canale giallo rappresentava un colorante fluorescente inerte. La Figura 4A mostra la camera SLB in cui potrebbe essere depositata la reazione CFPS. All'interno di questa camera, è stato formato un SLB sopra il vetrino coprioggetti, con la miscela di reazione CFPS posizionata sopra l'SLB preformato, consentendo l'imaging tramite una microscopia a scansione laser confocale. Come indicato nella Figura 4B, SLB è stato visualizzato da lipidi marcati, mostrati in verde, mentre la piccola GTPasi Cdc42 espressa fusa con mCherry è stata mostrata in magenta. L'espressione in situ di mCherry-Cdc42 è stata osservabile al microscopio, insieme al processo di targeting reversibile della membrana. Tuttavia, il sistema CFPS utilizzato è stato integrato con macchinari per la prenilazione, come dettagliato in una recente pubblicazione47.

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Figura 1: Ottimizzazione e confronto del sistema CFPS. Screening delle concentrazioni di (A) Mg2+ e (B) K+ per il sistema CFPS in blocco. (C) Un grafico a barre che mostra le rese di espressione proteica in diversi compartimenti. La fluorescenza della supercartella GFP è stata utilizzata per determinare la resa del sistema CFPS, misurata da un lettore di piastre o da un microscopio a scansione laser confocale. Abbreviazioni: CFPS = sintesi proteica cell-free; GFP = proteina fluorescente verde; sfGFP = supercartella GFP; GUV = vescicola unilamellare gigante; SLB = doppio strato lipidico supportato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Sintesi proteica cell-free in goccioline. (A) Una foto di reazioni CFPS incapsulate in goccioline di acqua in olio stabilizzate con tensioattivo. (B) Immagini in campo chiaro e (C,D) in fluorescenza di CFPS di (C) mCherry e (D) superfolder GFP incapsulate in goccioline visualizzate mediante microscopia a scansione laser confocale. La Superfolder GFP è indicata in verde; mCherry è indicato in magenta. Barre di scala = 20 μm. Abbreviazioni: CFPS = sintesi proteica cell-free; GFP = proteina fluorescente verde. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Sintesi proteica cell-free nei GUV. (A) Una foto delle reazioni CFPS incapsulate nei GUV. (B-D) Immagine a fluorescenza di CFPS incapsulati all'interno di POPC GUV, che esprime la GFP della supercartella. (B) Il doppio strato lipidico è stato marcato con lipidi Atto647N-DOPE marcati allo 0,05%, mostrati in rosso, (C) un colorante inerte mostrato in giallo e (D) la supercartella GFP è stata indicata in verde. Barre di scala = 20 μm. Abbreviazioni: CFPS = sintesi proteica cell-free; GFP = proteina fluorescente verde; GUV = vescicola unilamellare gigante; POPC = 1-palmitoil-2-oleoil-glicerolo-3-fosfocolina; DOPE = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Sintesi proteica libera da cellule della piccola proteina GTPasi-Cdc42 sopra le SLB. (A) Illustrazione schematica della ricostituzione del targeting di membrana di Cdc42 e dell'estrazione di membrana RhoGDI-dipendente su SLB, come visualizzato dalla microscopia a scansione laser confocale. Il meccanismo di prenilazione è stato implementato tramite un estratto arricchito con prenlitransferasi, descritto in dettaglio altrove. 47. (B) Una vista ortogonale della pre- e post-prenilazione della miscela di reazione sopra SLB. (C, D) Serie temporali dell'intensità di mCherry-Cdc42 sulla membrana (rosa) e in soluzione (nero) durante il targeting della membrana (C) e l'estrazione della membrana (D). Le barre della scala = 10 μm. (A-D) sono state adattate da Kai et al.47. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Elenco dei buffer. NOTA: Aggiungere β-mercaptoetanolo e DTT appena prima dell'uso. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Schema di pipettaggio per lo screening della concentrazione di Mg2+ . Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Schema di pipettaggio per lo screening della concentrazione di K+ . Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: Composizione della soluzione interna. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 5: Composizione della soluzione esterna. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 6: Composizione della soluzione preinterna. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Questo manoscritto delinea un sistema di sintesi proteica libera da cellule (CFPS) modificato progettato per l'uso in vari micro-compartimenti attraverso piattaforme cellulari sintetiche, tra cui goccioline di acqua in olio, GUV e SLB. Abbiamo utilizzato il ceppo ospite standard di espressione proteica ricombinante di E. coli, BL21(DE3), come estratto di origine per la costruzione di sistemi cellulari sintetici incentrati sulle proteine. Questo approccio ha prodotto circa 0,5 mg/mL di proteine in diversi compartimenti. Sebbene possano essere utilizzati altri ceppi di origine di estratti personalizzati, questi sistemi sono stati ottimizzati principalmente per un tipo specifico di proteina o attività metabolica, che può essere subottimale per l'espressione proteica generale. I recenti progressi nell'analisi quantitativa della spettrometria di massa hanno facilitato studi pilota sull'analisi proteomica del lisato cellulare48,49, in particolare in varie condizioni di preparazione.

Nonostante l'acquisizione di informazioni da questi studi, stabilire una correlazione quantitativa tra questi fattori proteici identificati e le prestazioni complessive dei sistemi CFPS rimane difficile. Questa lacuna ha lasciato senza risposta le domande su come valutare quantitativamente le prestazioni di un determinato lotto di estratto. Inoltre, non è stato riportato alcun confronto sistematico e parallelo dei diversi ceppi sorgente. In questo studio, abbiamo utilizzato il terreno 2xYPTG per aumentare la produzione di biomassa, una strategia raccomandata per la transizione a 2xYPT quando si utilizza l'RNA polimerasi endogena per la trascrizione. Nonostante i suggerimenti che la polimerasi T7 potesse essere integrata nella procedura di preparazione dell'estratto45, abbiamo optato per un protocollo di preparazione separato per l'estratto S30 e l'RNA polimerasi T7 per ridurre le elevate variazioni da lotto a lotto.

La produzione di proteina bersaglio è intrinsecamente legata al processo centrale di trascrizione/traduzione. Il design corretto e la purezza del modello sono fondamentali per il successo dell'espressione senza cellule. Oltre al modello plasmidico, è possibile utilizzare anche il DNA lineare a doppio filamento generato mediante PCR, che offre l'idoneità per lo screening e le applicazioni ad alto rendimento. A differenza della progettazione convenzionale del modello per l'espressione in vivo in E. coli, la progettazione del modello nel sistema senza cellule di E. coli è semplificata senza la necessità di considerazioni sull'induzione dell'espressione. L'unico elemento essenziale di un modello di espressione cell-free è una sequenza regolatoria T7. Tuttavia, in alcuni casi, la sequenza 5' del gene bersaglio potrebbe influenzare l'inizio della traduzione, a seconda della struttura secondaria formata dal corrispondente mRNA trascritto. Se il sito di legame del ribosoma si trova all'interno di un anello staminale stabile dell'mRNA trascritto, l'inizio della traduzione potrebbe essere significativamente ostacolato, portando a una scarsa espressione complessiva. Allo stesso modo, i codoni rari consecutivi possono ostacolare l'espressione e dovrebbero essere ottimizzati, in modo simile agli studi in vivo . Ciò può essere ottenuto attraverso server open source dedicati all'ottimizzazione del codone50 e alla previsione della struttura secondaria dell'mRNA51.

Per quanto riguarda il sistema tampone, abbiamo utilizzato un tampone acetato integrato con creatina fosfato e creatina chinasi come fonti di rigenerazione energetica nella nostra configurazione sperimentale. Questa configurazione ha prodotto un livello di espressione moderato e una cinetica relativamente veloce, attribuibile alla reazione di rigenerazione energetica a passo singolo catalizzata dalla creatina chinasi utilizzando la creatina fosfato. Mentre alcuni ricercatori sono passati a un sistema tampone glutammato, citando la sua più stretta somiglianza con l'ambiente cellulare52, non abbiamo osservato differenze significative nelle rese di espressione proteica con i nostri protocolli attuali. Tuttavia, recenti analisi proteomiche hanno indicato che diversi sistemi tampone in combinazione con metodi di lavorazione dell'estratto potrebbero influenzare la resa finale dell'espressione19. Per quanto riguarda i precursori energetici, diversi substrati sono stati studiati da numerosi gruppi di ricerca per ottenere un rapporto costo-efficacia e rese di espressione più elevate53,54. Nel contesto del sistema CFPS presentato, la creatinfosfato e la creatinchinasi sono state scelte deliberatamente. Questa selezione è stata motivata dall'efficienza della rigenerazione energetica ottenibile attraverso una reazione a singolo passaggio e dall'assenza di interferenze con gli enzimi endogeni ereditati dall'estratto. Di conseguenza, questa configurazione stabilisce un sistema semplice ma robusto, adatto a vari ambienti a micro-scomparti.

Come indicato nei risultati presentati, abbiamo dimostrato il successo dell'espressione proteica in tre distinti microcompartimenti: goccioline di acqua in olio stabilizzate da olio semi-fluorurato, GUV formati attraverso il trasferimento di emulsione e in cima a un doppio strato lipidico supportato. La versatilità dell'espressione proteica in diversi micro-compartimenti evidenzia la robustezza del nostro sistema CFPS per la costruzione di cellule sintetiche. Tra questi metodi di incapsulamento, la tecnica delle goccioline di emulsione era un approccio notevolmente semplice per incapsulare il sistema CFPS, che richiedeva solo agitazione o vortice. Tuttavia, queste goccioline tendono ad essere instabili a causa della precaria interfaccia con l'acqua, una limitazione che potrebbe essere affrontata aggiungendo lipidi o tensioattivi nella fase oleosa. Nonostante la praticità delle goccioline stabilizzate di acqua in olio, non replicano completamente l'ambiente cellulare naturale, che consiste in due compartimenti acquosi separati da una membrana cellulare. Al posto delle goccioline, sono state stabilite vescicole unilamellari giganti (GUV) con dimensioni superiori a 1 micron per imitare più da vicino le cellule. Il sistema CFPS è stato incapsulato all'interno del doppio strato lipidico di queste vescicole, fornendo un macchinario di trascrizione e traduzione per diversi sistemi cellulari sintetici55.

Il trasferimento dell'emulsione, noto anche come doppia emulsione, si distingue come la tecnica tipica per incapsulare le reazioni CFPS, grazie al suo processo di preparazione delicato e all'efficienza di incapsulamento relativamente elevata rispetto ai metodi privi di solventi. Tuttavia, la generazione di vescicole a doppia emulsione può variare da semplici fasi di centrifugazione all'uso del trasferimento di emulsione assistito da microfluidica, ogni metodo con i suoi vantaggi e svantaggi associati, come riassunto altrove36. Il successo dell'incapsulamento del sistema CFPS all'interno dei GUV si basa sulla regolazione dell'osmolarità e sull'applicazione della forza appropriata per attraversare l'interfaccia olio-acqua. Sebbene il metodo di trasferimento dell'emulsione qui descritto sia il più semplice e non richieda attrezzature di laboratorio specifiche, l'efficienza e l'omogeneità dei GUV generati potrebbero variare tra i diversi lotti. Inoltre, tutti i metodi di trasferimento dell'emulsione devono gestire l'olio residuo nel lume dell'interfaccia a doppio strato formata, richiedendo un ulteriore passaggio di rimozione dell'olio56, che può rappresentare una sfida nei progetti cinetici.

Infine, abbiamo dimostrato il successo dell'espressione di CFPS su un doppio strato lipidico supportato (SLB), offrendo un approccio valido per progetti che richiedono la sintesi proteica in prossimità dell'ambiente della biomembrana lipidica. Attraverso l'utilizzo del sistema CFPS presentato, abbiamo dimostrato la sua applicazione di successo nella caratterizzazione del processo di targeting reversibile di membrana di Cdc4247, una molecola proteica centrale cruciale per la polarità cellulare. In sintesi, le costanti rese di espressione del mezzo e la robustezza intrinseca osservate in vari micro-compartimenti evidenziano il potenziale di questo sistema CFPS nella costruzione di diversi sistemi cellulari sintetici. Questa capacità può essere ulteriormente estesa per includere vari modelli centrati sulle proteine, avanzando infine verso la realizzazione di cellule minime.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

M. Y. riconosce il finanziamento del Postgraduate Research & Practice Innovation Program della provincia di Jiangsu, Cina (Grant No. KYCX22_2803). L.K. è grato per il sostegno della ricerca sulle scienze naturali degli istituti di istruzione superiore di Jiangsu in Cina, Cina (sovvenzione n. 17KJB180003), della Fondazione per le scienze naturali dell'Università normale di Jiangsu, Cina (sovvenzione n. 17XLR037), dello sviluppo del programma accademico prioritario degli istituti di istruzione superiore di Jiangsu, in Cina, e del programma di professori appositamente nominati di Jiangsu, in Cina.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina(DOPC)Avanti850375P
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (sale sodico)(DOPS)Avanti840035P
1,4 ditiotreitolo (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC)Avanti850457P
3,5-ciclico AMP (cAMP)Sigma-AldrichA9501
Provette da 50 mLEppendorfProvette Eppendorf BioBased
50% perossido di idrogenoSigma-Aldrich516813
AcetatoSigma-AldrichA6283
Agar polvereSigma-Aldrich05040
AlaninSigma-AldrichA4349
Amicon Cellule AgitateMerckMilliporeUFSC05001
Acetato di Ammonio (NH4OAc)Sigma-AldrichA7262
ArgininaSigma-AldrichA4474
AsparaginaSigma-AldrichA0884
AspartatSigma-AldrichA5474
ATPRoche11140965001
Atto 488 DOPESigma-Aldrich67335
Atto 647N DOPESigma-Aldrich42247
Pallone di Erlenmeyer deflettoShuniu250 mL, 1000mL
Albumina sierica bovina (BSA)Roche10711454001
CentrifugaTube Eppendorf Eppendorf3810X
Rack per centrifugaper provetteEppendorf0030119819
Sistema di imaging a chemiluminescenza ed epifluorescenzaUvitecAlliance Q9
Sigma-Aldrich288306
Microscopia confocale a scansione laser (LSM)ZEISSLSM 780
Countess Cell Counting Camera VetriniThermo Fisher ScientificC10283
Vetrino coprioggettiThermo ScientificMenzel BB02400500A113MNZ0
creatina chinasi (CK)Roche10127566001
Creatina fosfato (CP)Sigma-Aldrich 10621714001
Piatto di colturaHuanqiu90 mm
CysteinSigma-AldrichC5360
Citidina 5'-trifosfato sale disodico (CTP)aladdinC101487
Membrana per dialisiSpettro TuboRC standard MWCO: 12-14 kD
E.Z.N.A. Ciclo Pure KitOmega Bio-TekD6492-01
Coltivatore a temperatura eretta con elettroriscaldamentoStrumento YihengDHP-9602
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Biosharp
Lettore di piastre fluorescentiBioTekSynergy 2
Olio fluoruratoSuzhou CChip strumento scientifico2%HFE7500
Acido folinicoSigma-Aldrich47612
French PressG.HeinemannHTU-DIGI-Press
GlucosioSigma-AldrichG7021
GlutammatoSigma-AldrichG5667
GlutamminaSigma-AldrichG5792
GliceroloSigma-AldrichG5516
GlicinaSigma-AldrichG7126
Guanosina 5'-trifosfato sale sodico idrato (GTP)Roche10106399001
HEPESSigma-AldrichH3375
HiPrep Q FF 16/10Cytiva28936543
HistidinSigma-AldrichH6034
IsoleucinSigma-AldrichI5281
Isopropil-beta;-D-tiogalattopiranoside (IPTG)Sigma-AldrichI5502
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
LeucinaSigma-AldrichL6914
LisinaSigma-AldrichL5501
Acetato di magnesio tetraidrato (Mg(OAc)2 )Sigma-AldrichM5661
Cloruro di magnesio (MgCl2)Sigma-AldrichM2670
MetioninaSigma-AldrichM8439
MicrocentrifugaEppendorf5424 R
Olio mineraleSigma-AldrichM5904
Mini-PROTEAN Tetra Cell SystemsBio-Rad1645050
Centrifuga multiusoEppendorf5810 R
NaN3Sigma-AldrichS2002
Acido nucleico & Misure di analisi UV delle proteineIMPLENNanoPhotometer N60
NucleoBond Xtra Maxi kit per plasmide di trasfezione DNAMACHEREY-NAGEL740414.5
Nunc-Immuno MicroWell 96 pozzetti piastre in polistireneSigma-AldrichP8616
PCR Thermal CyclerEppendorfMastercycler nexus
PeptoneSigma-Aldrich83059
FenilalaninaSigma-AldrichP8740
Fosfoenolpiruvat (PEP)GLPBIOGC44635
PMSFSigma-AldrichPMSF-RO
Polietilenglicole 8000 (PEG 8000)Sigma-Aldrich89510
Acetato di potassio (KOAc)Sigma-AldrichP5708
Cloruro di potassio ( KCl)Sigma-AldrichP9541
Glutammato di potassio (K-glutammato)Sigma-AldrichG1501
Idrossido di potassio (KOH)Sigma-Aldrich221473
ProlinSigma-AldrichP8865
Piruvato chinasi (PK)Sigma-AldrichP9136
SerinSigma-AldrichS4311
AgitatoreZhichushakersZQZY-AF8
Cloruro di sodio (NaCl)Sigma-AldrichS5886
Idrossido di sodio (NaOH)Sigma-AldrichS5881
SaccarosioaladdinS112226
Acido solforicoSigma-Aldrich339741
Filtri per siringheJinteng0.45 μ m
ProvettaShuniu20 mL
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad#1610175
ThermoMixerEppendorfThermoMixer C
TreoninaSigma-AldrichT8441
Tris baseSigma-AldrichV900483
tRNARoche 10109550001
TryptoneSigma-AldrichT7293
TriptofanoSigma-AldrichT8941
TirosinaSigma-AldrichT8566
UTP Sale trisodico (UTP)aladdinU100365
Pompa per vuoto con sistema di acqua circolataZhengzhou Greatwall Scientific Industrial and Trade Co.LtdSHB-figure-materials-1
ValinSigma-AldrichV4638
Miscelatori a vorticeKylin-BellVortex QL-861
Sistema di purificazione dell'acquaMerckMilliporeAcqua ultrapura diretta (Tipo 1)
Estratto di lievitoSigma-Aldrich70161
β-mercaptoetanoloSigma-Aldrich444203
Cloroformio avanzato 1100027

Riferimenti

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