Rimodellamento dipendente dall'esperienza del cervello giovanile, neurone sensoriale olfattivo, connettività sinaptica in un periodo critico della prima infanzia

Sommario

Descriviamo qui i metodi per indurre e analizzare il rimodellamento olfattivo dipendente dall'esperienza dei glomeruli sinaptici del lobo antennale nel cervello giovanile di Drosophila .

Abstract

L'esperienza sensoriale olfattiva precoce induce un drammatico rimodellamento dei glomeruli sinaptici nel cervello giovanile di Drosophila , che è esperienzialmente dose-dipendente, temporalmente limitato e transitoriamente reversibile solo in un breve periodo critico ben definito. La direzionalità del rimodellamento della connettività sinaptica del circuito cerebrale è determinata dall'odorante specifico che agisce sulla classe di recettori rispondenti dei neuroni sensoriali olfattivi. In generale, ogni classe di neuroni esprime un solo recettore olfattivo e innerva un singolo glomerulo sinaptico olfattivo. Nel modello genetico di Drosophila , l'intera gamma di glomeruli olfattivi è stata mappata con precisione dalla risposta agli odori e dall'output comportamentale. L'odorizzante etilbutirrato (EB) attiva i neuroni del recettore Or42a che innervano il glomerulo VM7. Durante il primo periodo critico della vita, l'esperienza dell'EB guida l'eliminazione delle sinapsi dose-dipendenti nei neuroni sensoriali olfattivi Or42a. Periodi temporizzati di esposizione all'odorizzante EB dosato consentono di studiare la potatura della connettività circuitale dipendente dall'esperienza nel cervello giovanile. L'imaging al microscopio confocale dei glomeruli sinaptici del lobo antennale viene eseguito con marcatori transgenici guidati dal recettore Or42a che forniscono la quantificazione del numero di sinapsi e del volume di innervazione. Il sofisticato kit di strumenti genetici per la Drosophila consente la dissezione sistematica dei meccanismi cellulari e molecolari che mediano il rimodellamento dei circuiti cerebrali.

Introduzione

Il rimodellamento dei circuiti cerebrali giovanili durante i primi anni di vita rappresenta l'ultima possibilità per cambiamenti di connettività sinaptica su larga scala per adattarsi all'ambiente altamente variabile e imprevedibile in cui un animale nasce. Essendo il gruppo di animali più abbondante, gli insetti condividono questo meccanismo di rimodellamento del periodo critico fondamentale^{e conservato dal} punto di vista evolutivo 1. I periodi critici si aprono con l'inizio dell'input sensoriale, mostrano cambiamenti reversibili del circuito per ottimizzare la connettività e poi si chiudono quando le forze di stabilizzazione resistono a ulteriori rimodellamenti². Gli insetti dipendono particolarmente dalle informazioni sensoriali olfattive e mostrano un periodo critico olfattivo ben definito. La Drosophila fornisce un eccellente modello genetico per studiare questo periodo critico dipendente dall'esperienza nel cervello giovanile. L'esperienza degli odori durante i primi giorni dopo l'eclosion guida sorprendenti cambiamenti di connettività circuitale nei glomeruli sinaptici ^3,4 identificati individualmente. La direzione del rimodellamento dipende dall'esperienza specifica dell'odorizzante in ingresso. Alcuni odoranti causano un aumento del volume del glomerulo sinaptico per un paio di giorni dopo l'eclosione (dpe)3,5,6,7, mentre altri odoranti causano una rapida eliminazione delle sinapsi durante il periodo critico 0-2 dpe, con conseguente diminuzione del volume di innervazione ^8,9,10. In particolare, l'esperienza con gli odori del butirrato di etile (EB) guida la potatura sinaptica dose-dipendente dei neuroni del recettore olfattivo Or42a solo durante questo periodo critico della prima infanzia⁸. L'eliminazione delle sinapsi è completamente reversibile modulando l'apporto di odorizzante EB entro il periodo critico ma diventa permanente dopo la chiusura del periodo critico. Questa potatura sinaptica dipendente dall'esperienza olfattiva fornisce un prezioso sistema sperimentale per chiarire i meccanismi temporalmente limitati alla base del rimodellamento del circuito cerebrale giovanile.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato utilizzato per indurre e analizzare la potatura sinaptica EB dipendente dall'esperienza dei neuroni sensoriali olfattivi del recettore Or42a durante il periodo critico precoce della vita. Mostriamo che i terminali sinaptici di Or42a nel glomerulo VM7 del lobo antennale possono essere marcati in modo specifico guidando transgenicamente un marcatore mCD8::GFP legato alla membrana, fuso direttamente con il promotore di Or42a (Or42a-mCD8::GFP)¹¹ o utilizzando il sistema di espressione binaria Gal4/UAS (Or42a-Gal4 che guida UAS-mCD8::GFP)¹². Le singole sinapsi dei neuroni Or42a possono essere marcate in modo simile utilizzando l'espressione transgenica mirata di marcatori presinaptici della zona attiva fusi a una serie di tag fluorescenti (ad esempio, Bruchpilot::RFP)⁸ o un segnale ad alta densità di elettroni per analisi di sinapsi ultrastrutturali (ad esempio, miniSOG-mCherry)⁸. I terminali sinaptici Or42a possono essere visualizzati con una combinazione di microscopia confocale a scansione laser e microscopia elettronica a trasmissione. Mostriamo che la potatura dei glomeruli sinaptici Or42a è dose-dipendente dall'EB, scalando alla concentrazione dell'esperienza odorizzante temporizzata. La percentuale di odorizzante EB disciolto nell'olio minerale utilizzato come veicolo può essere variata, così come la durata temporizzata dell'esposizione all'odorizzante negli animali in fase di sviluppo. Infine, mostriamo i metodi utilizzati per analizzare l'entità della potatura dei glomeruli sinaptici misurando l'intensità e il volume della fluorescenza dell'innervazione VM7. Il numero di sinapsi può anche essere quantificato contando i punti sinaptici marcati e misurando i parametri dell'ultrastruttura sinaptica utilizzando la microscopia elettronica^{a trasmissione 8}. Nel complesso, il protocollo mostrato qui è un approccio potente che consente la dissezione sistematica dei meccanismi cellulari e molecolari che mediano la potatura della connettività sinaptica del circuito olfattivo di Drosophila durante un periodo critico giovanile. La configurazione generale dell'esposizione agli odori descritta in questo studio è stata utilizzata in studi precedenti utilizzando altri odori e analizzando altri glomeruli ^3,7.

Protocollo

1. Esposizione agli odori

1. Usando un pennello fine, selezionare 40-50 animali in fase di sviluppo come pupe scure di farato (90+ ore dopo la nascita a 25 °C) in fiale di polistirene Drosophila da 25 mm x 95 mm contenenti cibo standard per melassa di farina di mais (Figura 1A).
2. Posizionare una sottile rete metallica in acciaio inossidabile sull'estremità delle fiale di Drosophila per contenere le mosche e consentire anche un buon flusso d'aria. Fissare i tappi di rete metallica con una pellicola trasparente nastrata sul lato dei flaconcini di Drosophila .
3. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, inserire 1 mL di olio minerale al 100% (controllo del veicolo) o sciogliere l'odorizzante etilbutirrato (EB) nell'olio minerale in un'altra provetta per produrre la concentrazione desiderata (ad es. 15% (150 μL) o 25% (250 μL)).
4. Posizionare le provette per microcentrifuga per il controllo del veicolo o per l'odorizzante in posizione verticale all'interno di un contenitore ermetico Glasslock da 3700 mL. Utilizzando del nastro adesivo, ancorare saldamente i tubi al centro delle camere degli odori insieme alle fiale di Drosophila (Figura 1B).
5. Collocare le camere sigillate di controllo del veicolo e le camere di odorante EB contenenti le fiale di pupe di Drosophila pharate in un incubatore umidificato (70%) a temperatura controllata (25 °C) con un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore.
6. Rimuovere le mosche appena chiuse dopo 4 ore di esposizione in camera di odorante e trasferire rapidamente 20-25 mosche in fiale di Drosophila fresche in camere con odorizzante appena fatto (Figura 1A, B). Scartare le pupe non chiuse.
7. Conservare le mosche nelle loro camere odorose sigillate nelle incubatrici per un totale di 24 ore. Per un dosaggio più lungo dell'odorizzante, trasferire rapidamente le mosche in nuove fiale di Drosophila in camere odorizzanti appena fatte ogni 24 ore.
8. Anestetizzare i moscerini in fase di sviluppo immergendoli in una capsula di etanolo al 70% per 1 minuto in preparazione per la dissezione cerebrale immediata e l'elaborazione immunocitochimica.

2. Dissezione cerebrale

1. Contrassegnare le fiale come veicolo di controllo (solo olio minerale al 100%) o EB esposte (% EB) etichettandole e mantenere queste designazioni per l'intera durata della dissezione cerebrale e della successiva elaborazione. Processa 10-20 animali per ogni genotipo/condizione odorizzante.
2. Usando una pinza, trasferisci una singola mosca anestetizzata in una piccola piastra di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) appena ^preparata13. Immergere la mosca nel PBS e continuare la dissezione completa del cervello con la mosca completamente sommersa.
3. Con una pinza affilata (#5) fine in entrambe le mani, posizionare la mosca con il lato ventrale rivolto verso l'alto e afferrare la parte superiore del torace con una pinza e la testa sotto la proboscide con l'altra pinza. Fare attenzione a non penetrare nel cervello.
4. Rimuovere la testa dal resto del corpo tirando delicatamente in direzioni opposte con entrambe le mani. La testa dovrebbe staccarsi facilmente dal torace; lasciare la testa isolata per la dissezione (Figura 1C).
5. Far scorrere la pinza precedentemente utilizzata per afferrare il torace sotto il lato opposto della proboscide. Inizia a tirare delicatamente la cuticola dell'esoscheletro in direzioni opposte in modo che si strappi tra gli occhi per rivelare il cervello.
6. Durante la trazione, i lobi ottici del cervello possono separarsi insieme all'esoscheletro. Per evitare ciò, utilizzare una trazione lenta e costante con le due pinze mentre si rimuove la cuticola dell'esoscheletro (Figura 1C, al centro).
7. Continua a rimuovere la cuticola dell'esoscheletro dalla testa. Assicurarsi che tutte le parti dell'esoscheletro siano state rimosse. Rimuovere tutti i tessuti attaccati al cervello, compreso il corpo grasso e qualsiasi trachea sporgente.
8. Per evitare che si attacchi, sciacquare il puntale di una pipetta P20 con PBS + 0,2% Triton-X 100 (PBST). Immediatamente dopo la dissezione, trasferire il cervello nella soluzione di fissaggio (4% paraformaldeide (PFA) + 4% saccarosio) in una provetta tappata (Figura 1C, D).

3. Immunocitochimica cerebrale

1. Fissare il cervello per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) con rotazione end-over-end. Tenendo il cervello nella provetta, pipettare e smaltire correttamente il fissativo pericoloso. Lavare rapidamente i cervelli fissi 3 volte con PBS (Figura 1D).
2. I cervelli possono spesso essere trovati bloccati nel tappo dei tubi dopo la rotazione. Per evitare la perdita accidentale del cervello, che è un pericolo costante in tutti i trasferimenti, utilizzare un microscopio da dissezione durante il pipettaggio dei liquidi.
3. In preparazione per la marcatura degli anticorpi, bloccare i cervelli fissi per 1 ora a RT in PBST + 1% albumina sierica bovina (BSA) + 0,5% siero di capra normale (NGS) con rotazione costante end-over-end (Figura 1D).
4. Rimuovere il blocco e incubare il cervello con l'anticorpo primario selezionato diluito in modo appropriato in PBST + 0,2% BSA + 0,1% NGS. Incubare il cervello per una notte (14-16 ore) a 4 °C con rotazione costante.
   NOTA: Esempi di anticorpi utilizzati: anti-CadN di ratto (diluizione 1:50)¹⁴ per marcare i glomeruli sinaptici e anti-GFP di pollo (1:1000)⁸ per marcare Or42a-mCD8::GFP (Figura 1D).
5. Pipettare l'anticorpo primario. Lavare il cervello 3 volte per 20 minuti ciascuno con PBST. Incubare cervelli con anticorpi secondari diluiti in PBST con 0,2% BSA + 0,1% NGS per 2 ore a RT con rotazione costante.
   NOTA: In alternativa, incubare il cervello per una notte (14-16 ore) a 4 °C. Diluire gli anticorpi in PBST con 0,2% BSA + 0,1% NGS; Anticorpi secondari utilizzati qui: 488 capra anti-pollo (1:250) e 546 capra anti-ratto (1:250).
6. Pipettare gli anticorpi secondari. Lavare il cervello 3 volte per 20 minuti ciascuno con PBST. Terminare lavando il cervello per 20 minuti con PBS (Figura 1D).
7. Preparare i vetrini da microscopio in vetro (75 mm x 25 mm) aggiungendo due sottili strisce di nastro biadesivo al vetrino a ~25 mm di distanza l'una dall'altra. Questo fornisce un distanziatore per evitare di schiacciare il cervello.
8. Pipettare ~10-15 μL di terreno di montaggio tra le due strisce di nastro per montare i cervelli. Con un puntale per pipetta P20 pre-risciacquato con PBST, trasferire i cervelli marcati sul vetrino del microscopio (Figura 1E).
9. Una volta che i cervelli sono stati trasferiti, usa un pennello fine per allinearli, assicurandoti che i lobi antennali siano rivolti verso l'alto. Cerca il lato che ha la gobba arcuata, che conterrà i lobi antennali.
10. Una volta che i cervelli sono orientati correttamente, coprirli con un vetrino coprioggetti di vetro (n. 1.5H), assicurandosi che il vetrino coprioggetti sia ben saldo sul nastro. Quindi, riempire i lati del vetrino coprioggetti con un mezzo di montaggio aggiuntivo (Figura 1E).
11. Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con smalto trasparente. Lasciare asciugare completamente il vetrino, quindi conservarlo in frigorifero per l'imaging successivo.

4. Imaging confocale

1. Accecare tutti i vetrini cerebrali sia al genotipo che alle condizioni di esperienza prima dell'imaging contrassegnando il vetrino con un'etichetta codificata per la successiva decodifica.
2. Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo a immersione in olio 63x. In tutte le immagini mostrate qui utilizziamo un microscopio Zeiss 510 META (Figura 1F).
3. Utilizzare linee laser appropriate per i fluorofori utilizzati. In questo caso, utilizzare un laser Argon 488 e HeNe 543 per i glomeruli sinaptici del lobo antennale e l'imaging dei neuroni sensoriali olfattivi Or42a (Figura 2).
4. Determina il guadagno e l'offset ottimali per entrambi i canali, mantenendo idealmente il guadagno per entrambi i canali <750 e l'offset ≈0. Questo viene fatto per garantire che il rapporto segnale-rumore sia ottimale, limitando al contempo lo sfondo.
5. Posizionare l'imaging al centro del cervello. Durante l'imaging, i glomeruli VM7 risiedono prossimalmente al foro lasciato al centro del cervello dopo la rimozione dell'esofago durante la dissezione (Figura 2A).
   NOTA: I glomeruli VM7 saranno sempre vicini all'apertura dell'esofago. Tuttavia, la posizione e le dimensioni esatte variano leggermente in base alla dissezione cerebrale e alle differenze di montaggio, quindi tenetene conto durante l'imaging.
6. Selezionare la risoluzione dell'immagine e lo spessore della fetta ottica. In questo caso, viene utilizzata una risoluzione di 1024 x 1024 con uno spessore della fetta Z-stack di 0,37 μm.
7. Prendi un'intera proiezione confocale Z-stack attraverso il lobo antennale, assicurando la cattura dell'intera innervazione neuronale Or42a dei glomeruli VM7.

5. Misure sinaptiche

1. Caricare l'immagine in cieco genotipo/condizione in Fiji (1.54f). Dividi i canali della linea laser facendo clic su Immagine > Colore > Dividi canali.
2. Nel canale sensoriale olfattivo Or42a, determina quali fette contengono l'innervazione Or42a scorrendo l'intero Z-stack, identificando dove inizia e finisce la fluorescenza.
3. Creare una proiezione di fette di somma che includa solo le sezioni contenenti l'innervazione del neurone Or42a facendo clic su Immagine > Pile > Progetto Z > Somma fette e inserendo l'intervallo desiderato.
4. Nelle Figi, fare clic sullo strumento Lazo nella barra superiore per tracciare il contorno dell'innervazione del neurone Or42a nel glomerulo VM7, trattando ciascun glomerulo del lato del cervello in modo indipendente (Figura 3).
5. Moltiplica la circonferenza per il numero di fette Z-stack e lo spessore di ciascuna fetta per ottenere il volume di innervazione del glomerulo sinaptico VM7. Per quantificare il numero di sinapsi, lo strumento find maxima può essere utilizzato insieme alla macro find maxima stacks per contare i punti di sinapsi nella regione delineata ^8,15.

Risultati

La Figura 1 mostra il flusso di lavoro per l'esposizione agli odori del periodo critico dipendente dall'esperienza olfattiva e i metodi di imaging cerebrale. Il protocollo inizia con l'abbinamento per età delle pupe scure del farato immediatamente prima dell'eclosion (Figura 1A). Le pupe vengono poste in camere odorizzanti per 4 ore, quindi gli adulti appena chiusi vengono capovolti in fiale fresche nel controllo del veicolo o nelle camere odorose EB dosate (Figura 1B). In genere ci esponiamo all'odorizzante per 24 ore, anche se è possibile qualsiasi durata. Dopo l'esposizione agli odori, la dissezione cerebrale inizia rimuovendo la testa dal torace e quindi rimuovendo l'esoscheletro della cuticola con una pinza fine (Figura 1C). Il cervello isolato viene ripulito da tutti i tessuti associati che potrebbero interferire con l'imaging e quindi immediatamente fissato in paraformaldeide al 4% e saccarosio al 4% in PBS. Una breve dose di 30 minuti è sufficiente per una buona integrità del tessuto cerebrale. Il protocollo immunocitochimico inizia con un blocco di 1 ora (ad es. BSA, NGS), l'incubazione notturna in anticorpi primari (ad es. anti-GFP, -CadN) e quindi una breve incubazione di 2 ore in anticorpi secondari (Figura 1D). I cervelli marcati sono montati su vetrini sotto vetrini coprioggetti sigillati con la superficie dorsale del cervello rivolta verso l'alto per una migliore imaging dei lobi antennali (Figura 1E). Si noti che tutti i campioni sono all'oscuro sia del genotipo che delle condizioni di esperienza, contrassegnando il vetrino con una designazione codificata per la decodifica successiva. Un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo a immersione in olio 63x viene utilizzato per visualizzare i lobi delle antenne del cervello centrale (Figura 1F). Vengono selezionate linee laser ottimali per i fluorofori utilizzati (ad esempio, Argon 488 e HeNe 543) per visualizzare l'innervazione olfattiva dei neuroni sensoriali Or42a di VM7 nel contesto dei glomeruli circostanti.

È importante selezionare il guadagno, l'offset, la risoluzione dell'imaging e lo spessore della fetta ottica ottimali per catturare l'intera proiezione Z-stack dell'innervazione del neurone Or42a nei glomeruli VM7. Tutti i genotipi e le condizioni di esperienza da confrontare vengono visualizzati con le stesse impostazioni del microscopio. Gli Z-stack vengono elaborati utilizzando il software ImageJ con variazioni dipendenti dall'esperienza valutate principalmente dal volume di innervazione ^7,14. Ci sono due modi in cui sono state calcolate le misure volumetriche. Si calcola l'area di innervazione fetta per fetta utilizzando la funzione lazo ImageJ e quindi si moltiplica ogni valore per lo spessore di ogni fetta (μm)^8,9. L'altro utilizza le proiezioni Z della somma delle fette e moltiplica il numero di fette Z-stack per lo spessore della fetta per determinare il volume medio. Entrambi i metodi danno risultati coerenti. Oltre alle misure di volume, l'intensità della fluorescenza può essere valutata anche con la proiezione dell'intensità massima di VM7 glomeruli¹⁶. La somma ponderata di tutti i pixel viene valutata tramite la proiezione massima della fetta somma ImageJ, con il numero di pixel a ciascun livello di intensità sommato per calcolare l'intensità complessiva ^8,9. Lo sfondo può essere sottratto quantificando una regione extra-glomerulare di dimensioni identiche. Questo metodo di sottrazione richiede più tempo ma è più accurato, in quanto tiene conto dei diversi livelli di marcatura degli anticorpi di fondo in ciascun campione di cervello per produrre una quantificazione più rappresentativa dei valori di intensità della fluorescenza dell'innervazione. Le misurazioni dell'intensità vengono effettuate in un intervallo tipico di 18-30 fette ottiche (0,37 μm/fetta) all'interno di uno Z-stack, in media per ogni cervello¹⁶. In quasi tutti i casi, le misurazioni dell'intensità e del volume della fluorescenza per innervazione forniscono risultati coerenti.

In tutte le modalità di misurazione, i risultati rappresentativi rimangono invariati; l'esperienza precoce con l'odorizzante EB provoca una significativa perdita dell'innervazione del neurone Or42a. Il glomerulo VM7 può essere identificato in modo affidabile per dimensioni, forma e posizione tra gli altri glomeruli olfattivi del lobo antennale mappati con precisione (Figura 2A) e dall'espressione mirata dell'etichetta di membrana Or42a-mCD8::GFP accoppiata alla marcatura glomerulare con caderina anti-neurale (CadN; Figura 2B). L'esposizione temporizzata al controllo del veicolo odorizzante (olio minerale) provoca l'innervazione del neurone Or42a indistinguibile da un animale normale non trattato. Tuttavia, l'esperienza dell'odore EB nei primi giorni dopo l'eclosione (dpe) provoca la potatura dei glomeruli sinaptici (Figura 2C). Questo meccanismo di potatura è interamente limitato al breve periodo critico precoce della vita ^8,10. In genere ora utilizziamo esposizioni odorose 24 ore su 24 per valutare la potatura sinaptica dei glomeruli VM7 e la conseguente diminuzione del volume di innervazione nel cervello di Drosophila giovanile. Un'esposizione di 24 ore (0-1 dpe) al controllo del veicolo odorizzante (olio minerale) mantiene la normale, densa innervazione Or42a-mCD8::GFP (verde) nei glomeruli sinaptici VM7 (cerchi bianchi tratteggiati) in entrambi i lobi antennali dell'emisfero cerebrale (Figura 2D, a sinistra). In netto contrasto, l'esposizione di 24 ore (0-1 dpe) al 25% di odorante EB disciolto nell'olio minerale provoca una forte potatura dell'innervazione Or42a-mCD8::GFP (verde) e una perdita del volume glomerulare sinaptico (Figura 2D, a destra). Questi risultati sono sia visivamente evidenti che costantemente chiari. Uno dei maggiori attributi di questo protocollo di esperienza con gli odori è la chiarezza dei risultati dell'imaging cerebrale, che sono anche estremamente suscettibili di semplici quantificazioni dell'intensità e del volume della fluorescenza dell'innervazione.

Il principale vantaggio di questo protocollo di esperienza olfattiva è la capacità di sfruttarlo per lo studio della restrizione temporale e dei meccanismi dose-dipendenti dell'odorizzante durante la potatura sinaptica del periodo critico. Per l'eliminazione delle sinapsi del neurone Or42a guidata da EB nel glomerulo VM7, il meccanismo di rimodellamento è principalmente limitato al giovane precoce (0-2 dpe), senza potatura sinaptica rilevabile esperienza-dipendente alla maturità (7-9 dpe) tranne una modulazione minore ai livelli di esposizione EB più alti⁸. Tale restrizione temporale definisce un periodo critico e la comprensione di questo meccanismo di temporizzazione è un obiettivo importante. Un altro attributo di questo protocollo è che la potatura sinaptica dipendente dall'esperienza è dose-dipendente dall'EB (Figura 3). L'esposizione temporizzata al controllo del veicolo odorizzante (olio minerale) con lo 0% di odorante EB provoca una normale innervazione del neurone Or42a del glomerulo sinaptico VM7, che è indistinguibile da un animale non trattato. Il calcolo del volume tridimensionale dell'innervazione del neurone Or42a mostra una dimensione tipica di un cervello giovanile normale (2260 μm³; Figura 3A, a sinistra). Risultati rappresentativi mostrano che l'aumento della concentrazione di odorante EB provoca una potatura dei glomeruli sinaptici progressivamente maggiore. Ad esempio, un'esposizione di 24 ore (0-1 dpe) al 15% di odorizzante EB provoca una perdita di innervazione chiara e costante (Figura 3A, al centro). La quantificazione del volume di innervazione 3D mostra una notevole riduzione rispetto ai controlli del veicolo (760 μm³ rispetto a 2260 μm³). Un'esposizione di 24 ore (0-1 dpe) al 25% di odorante EB provoca una perdita di innervazione ancora maggiore (281 μm³; Figura 3A, a destra). Le quantificazioni rappresentative per questo intervallo di concentrazioni di odoranti EB mostrano risultati coerenti per l'intensità della fluorescenza (Figura 3B) e il volume di innervazione (Figura 3C). Questa dipendenza dalla dose consente lo studio dei mezzi per prevenire la potatura sinaptica e migliorare la potatura con esposizioni odorose inferiori per dimostrare un aumento del rimodellamento dei glomeruli sinaptici. Alcuni studi precedenti hanno dimostrato l'effetto opposto dell'aumento del volume glomerulare utilizzando altri odoranti con questo protocollo¹⁰. L'esposizione agli odori EB nel periodo critico si traduce sempre in una potatura dei glomeruli sinaptici sorprendente e facilmente rilevabile.

Figura 1: Diagramma di flusso degli studi sull'esposizione agli odori nel cervello giovanile di Drosophila . (A) Le pupe scure del farato (90+ ore dopo la puberazione a 25 °C) vengono raccolte e poste in camere odorose. In condizioni odorizzanti, sono consentite 4 ore per l'eclosione, quindi le mosche giovani vengono trasferite in una fiala fresca. (B) Le mosche di pari età sono suddivise in condizioni di esperienza di controllo del veicolo (olio minerale al 100%) o di butirrato di etile (EB; % v/v in olio minerale). Una sottile rete metallica (riquadro) consente l'accesso agli odorizzanti. Le mosche sono in genere esposte per ulteriori 20 ore per un totale di 24 ore di esposizione, 0-1 giorno dopo l'esplosione (DPE). (C) Le mosche vengono sezionate rimuovendo prima la testa, quindi vengono utilizzate pinze fini per rimuovere delicatamente l'esoscheletro della cuticola e isolare il cervello giovanile. Il cervello isolato viene ripulito da tutti i tessuti circostanti e dalla trachea sporgente. (D) I cervelli isolati vengono fissati, bloccati e quindi incubati in sequenza in anticorpi primari e secondari. La gamma di anticorpi utilizzati include tipicamente una sonda di membrana generale per rivelare i glomeruli sinaptici del lobo antennale e una sonda di membrana specifica per i neuroni sensoriali olfattivi Or42a. (E) I cervelli etichettati sono posti in un supporto di montaggio su un vetrino da microscopio con distanziatori a nastro sotto un vetrino coprioggetti sigillato. Il corretto orientamento del cervello (superficie dorsale verso l'alto) è fondamentale per l'imaging ottimale dei lobi antennali. (F) I cervelli vengono visualizzati utilizzando un microscopio fluorescente confocale a scansione laser. Tutti i campioni sono in cieco rispetto al genotipo e sperimentano le condizioni prima dell'imaging e delle successive analisi quantificate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Potatura dei glomeruli sinaptici del periodo critico dipendente dall'esperienza odorosa. (A) I glomeruli olfattivi del lobo antennale (AL) sono mappati con precisione. Sono mostrati alcuni glomeruli sinaptici rappresentativi. La classe dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) del recettore Or42a innerva specificamente i glomeruli VM7. (B) I neuroni marcati con Or42a-mCD8::GFP (verde) innervano densamente i glomeruli VM7 accoppiati sui lati sinistro (L) e destro (R) del cervello, con la marcatura anticorpale N-Caderina (CadN) di tutti i glomeruli sinaptici AL (magenta). La linea di mosca è w¹¹¹⁸; Or42a-mCD8::GFP/+. (C) Rappresentazione grafica schematica dell'innervazione OSN Or42a dei glomeruli sinaptici VM7 in condizioni di controllo del veicolo (100% olio minerale; a sinistra) e dell'esposizione al butirrato di etile (% EB v/v in olio minerale; a destra) durante il periodo critico giovanile. La potatura dell'innervazione dipendente dall'esperienza si verifica solo con l'esposizione all'EB nelle prime fasi della vita, con l'eliminazione delle sinapsi e la perdita degli assoni, con conseguente riduzione del volume di innervazione. (D) Immagini confocali rappresentative dell'innervazione OSN di Or42a dei glomeruli sinaptici VM7 accoppiati (cerchi di contorno bianco tratteggiati; Or42a-mCD8::GFP, verde) dopo il controllo del veicolo a olio (a sinistra) e il 25% di esposizione all'EB (a destra) per 24 ore (0-1 dpe). L'esperienza dell'odorizzante EB guida la potatura sinaptica e la perdita di volume di innervazione. Questo meccanismo dipendente dall'esperienza è temporalmente limitato e reversibile transitoriamente solo entro un periodo critico olfattivo ben definito nei primi giorni dopo l'eclosione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Quantificazione dell'intensità e del volume della fluorescenza dell'innervazione dei glomeruli sinaptici dose-dipendenti dell'EB. (A) Innervazione marcata con Or42a-mCD8::GFP in un glomerulo sinaptico VM7 (verde) esposto da 0-1 dpe al controllo dell'olio minerale del veicolo odorizzante (0% EB, a sinistra), 15% EB (al centro) o 25% EB (a destra). Sotto: Le stesse immagini con l'innervazione glomerulare delineata (cerchi bianchi) e il volume di innervazione tridimensionale calcolato. Il controllo del veicolo ha un'innervazione del glomerulo sinaptico VM7 da parte dei neuroni Or42a che è indistinguibile dagli animali non trattati. L'esperienza in un periodo critico con un'esposizione al 15% di ef odorizzante si traduce in un'evidente potatura sinaptica del glomerulo, con una diminuzione del 66% del volume di innervazione tridimensionale in questo caso. L'esposizione al livello più elevato del 25% di EB si traduce in una maggiore potatura, con una perdita di quasi il 90% del volume del glomerulo sinaptico in questo caso. Pertanto, si può immaginare una potatura dose-dipendente man mano che l'esperienza dell'odorizzante aumenta. (B) Risultati rappresentativi dell'intensità di fluorescenza marcata con Or42a-mCD8::GFP all'interno di glomeruli sinaptici VM7 esposti da 0-1 dpe al controllo del veicolo odorizzante (olio, verde), 15% EB (medio, arancione) o 25% EB (destra, nero). (C) Risultati rappresentativi dei volumi di innervazione tridimensionale dei glomeruli VM7 nelle stesse condizioni di esposizione agli odori del periodo critico. I grafici a dispersione mostrano tutti i singoli punti dati con la media ± SEM. La significatività è indicata come p≤0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***) e p ≤ 0,0001 (****). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo di esposizione agli odori e di imaging cerebrale qui presentato può essere utilizzato per indurre e quantificare in modo affidabile la potatura dei glomeruli sinaptici dei neuroni sensoriali olfattivi dipendenti dall'esperienza durante un periodo critico precoce della vita. Studi precedenti che utilizzavano questo paradigma di trattamento per esplorare il rimodellamento del circuito olfattivo hanno iniziato l'esposizione agli odori il 2^° giorno dopo l'eclosion ^3,4,5. Al contrario, iniziamo l'esposizione agli odori nelle pupe di farato prima dell'eclosione adulta e scopriamo che la stragrande maggioranza del rimodellamento si verifica entro le prime 24 ore dopo l'eclosazione ^8,9. Pertanto, un passaggio essenziale in questo protocollo di esposizione agli odori è quello di posizionare le pupe scure in fasi nelle camere degli odori prima dell'eclosione (Figura 1). Questo non è per l'esposizione all'odore della pupa di per sé, ma piuttosto per garantire l'esposizione all'odore immediatamente dopo l'eclosione adulta. Sono stati selezionati adulti giovani chiusi 4 ore dopo la stadiazione per sincronizzare l'età all'interno di una finestra temporale ristretta e per evitare differenze nei tempi di esposizione agli odori. Questo intervallo di esperienza precoce è in linea con studi recenti che dimostrano che l'assuefazione all'olfatto EB si chiude dopo soli 2 giorni dopo l'esplosione¹⁰. Tuttavia, le conseguenze delle differenze di tempo di esposizione agli odori all'interno del periodo critico (ad esempio, 0-1 vs. 1-2 giorni) non sono state ben caratterizzate. I neuroni sensoriali olfattivi Or42a innervano selettivamente il glomerulo VM7 nel lobo antennale, che è facilmente identificabile sulla base delle precise mappe glomerulari e dell'etichettatura di innervazione mirata (ad esempio, Or42a-mCD8::GFP; Figura 2). L'esposizione all'odorizzante EB durante il periodo critico non altera l'espressione del promotore di Or42a o i livelli del reporter⁸. L'esposizione temporizzata agli odori provoca l'eliminazione sequenziale delle sinapsi e la perdita di innervazione degli assoni dai neuroni del recettore Or42a. Questa potatura è completamente reversibile entro il primo periodo critico di vita (0-2 dpe) ma non alla maturità adulta (7-9 dpe) quando i cambiamenti nell'ambiente odorizzante non alterano più l'innervazione. La stretta restrizione temporale di questo meccanismo dipendente dall'esperienza sensoriale è una delle principali questioni in sospeso nel campo. Sono stati fatti molti tentativi per riaprire la plasticità critica del periodo alla maturità. Il protocollo qui fornito è una potente via per l'indagine.

La facilità dell'esposizione agli odori e il protocollo di imaging cerebrale qui descritti consentono un'ampia accessibilità e un'ampia adattabilità. L'insorgenza, la terminazione e la durata dell'esperienza di esposizione agli odori sono tutte completamente a discrezione dello sperimentatore per consentire studi mirati sulle proprietà del periodo critico, sulla reversibilità del rimodellamento e sulla riapertura della plasticità del periodo critico. Allo stesso modo, la forza dell'esperienza odorizzante può essere facilmente manipolata per lo studio della potatura dei glomeruli sinaptici dose-dipendenti (Figura 3). È importante sottolineare che gli studi che utilizzano concentrazioni di EB più basse (ad esempio, il 15% di EB) possono essere utilizzati per testare manipolazioni che potrebbero aumentare il tasso o l'entità del rimodellamento dei glomeruli sinaptici. Ad esempio, i risultati potrebbero mostrare che la potatura sinaptica a livelli di EB più bassi (ad esempio, il 15%) è indistinguibile da livelli di EB più elevati (ad esempio, 25%). Attraverso diverse manipolazioni, i risultati possono essere confrontati con l'innervazione costante dei controlli del veicolo odorizzante e la robusta potatura sinaptica dei glomeruli che si verifica al 25% di EB (Figura 3). Una limitazione di questo metodo è che l'esposizione all'odorizzante si basa interamente sulla volatilità dell'odorizzante disciolto. Fattori variabili come la temperatura e l'umidità relativa influenzano l'efficacia dell'esposizione agli odori⁸. La densità delle mosche nelle camere degli odori potrebbe anche potenzialmente influire sull'esposizione agli odori, ad esempio attraverso la produzione di odori derivati dalle mosche. Si raccomanda una densità non superiore a 20-25 mosche per fiala. La concentrazione di odorante richiesta per indurre una potatura dei glomeruli sinaptici molto forte è probabilmente superiore a quella tipicamente sperimentata in natura^10,17. Sarebbero necessarie tecniche di imaging a risoluzione molto più elevata per dosare l'eliminazione delle sinapsi a concentrazioni di odori più basse. Tuttavia, l'attuale protocollo consente studi coerenti e affidabili per una serie di manipolazioni.

Ci sono immensi vantaggi in questo protocollo di esposizione agli odori e di imaging cerebrale. La Drosophila è un modello animale enormemente vantaggioso fondato su un ampio e sofisticato kit di strumenti genetici, che può essere sistematicamente sfruttato per l'ampio studio delle interazioni gene-ambiente nel rimodellamento del circuito olfattivo in periodi critici. Gli esempi mostrati qui includono la linea di driver transgenica Or42a-Gal4, il marcatore di membrana UAS-mCD8::GFP e la fusione diretta Or42a-mCD8::GFP. Non ci sono differenze distinguibili tra la potatura dei glomeruli sinaptici con la fusione diretta Or42a e gli approcci di marcatura indiretta Gal4/UAS ^8,9. Il driver Or42a-Gal4 offre la capacità di manipolare i neuroni del recettore olfattivo mirato e di visualizzare i cambiamenti dipendenti dall'esperienza nell'innervazione di VM7, mentre la linea di fusione diretta libera il sistema transgenico binario UAS-Gal4 per altre manipolazioni mirate alle cellule. Molte altre linee mutanti e transgeniche dell'ampio toolkit di Drosophila possono essere impiegate per testare meccanismi di restrizione temporale e dipendenti dall'esperienza, tra cui l'identificazione delle cellule che mediano la potatura sinaptica, le vie di segnalazione intercellulari che trasmettono le informazioni sull'esperienza olfattiva e il macchinario intracellulare necessario per l'eliminazione mirata delle sinapsi. Nel complesso, questo protocollo consente l'interrogazione sistematica di molti meccanismi che guidano il rimodellamento del circuito cerebrale dipendente dall'esperienza olfattiva. Questo protocollo di esposizione agli odori e di imaging cerebrale può essere utilizzato anche per studiare le modifiche comportamentali dell'esperienza olfattiva specifica del periodo critico, le manipolazioni genetiche e farmaceutiche che possono consentire la riapertura della plasticità critica del periodo alla maturità e altri aspetti della plasticità del circuito olfattivo oltre alla potatura dei glomeruli sinaptici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Per l'esposizione agli odori
Drosophila fiale	Genesee Scientific	32-110
Butirrato di etile	Sigma Aldrich	E15701
Provette per microcentrifuga	Fisher Scientific	05-408-129
Olio minerale	Sigma Aldrich	M3516
Camere per odori	Glasslock
Pennelli	Winsor & Newton	Serie 233
Parafilm	Thermofisher	S37440
Rete metallica	Scienceware	378460000<
strong>Brain Dissection
Etanolo, 190 proof	Decon Labs	2801	Diluito al 70%
Pinze	Fine Science Tools	11251-30	Dumont #5
Paraformaldeide	Microscopio elettronico Sciences	157-8	diluito al 4%
piastre di Petri	Fisher Scientific	08-757-100B
Soluzione salina tamponata con fosfato	Thermo Fisher Scientific	70011-044	Diluito a 1x
saccarosio	Fisher Scientific	BP220-1
Sylgard	Microscopio Elettronico Scienze	24236-10
Triton-X 100	Fisher Scientific	BP151-100
Brain Immunocitochimica
488 capra anti-pollo	Invitrogen	A11039
546 capra anti-ratto	Invitrogen	A11081
Albumina sierica bovina	Sigma Aldrich	A9647
Pollo anti-GFP	Abcam	13970
Vetrini coprioggetti	Avantor	48366-067	25 x 25 mm
Nastro biadesivo	Scotch	34-8724-5228-8
Fluoromount-G	Microscopio elettronico Sciences	17984-25
Vetrini per microscopio	Fisher Scientific	12-544-2	75 x 25 mm
Smalto per unghie	Sally Hansen	109	Xtreme Wear, Invisibile
Siero di capra normale	Sigma Aldrich	G9023
Rat anti-CadN	Developmental Studies Hybridoma Bank	AB_528121
Confocale/Analisi
Qualsiasi computer/laptop
Microscopio confocale	Carl Zeiss		Zeiss 510 META
Fiji software Fiji			Versione 2.14.0/1.54f