Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.
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Articolo metodologico
Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Questo processo è fondamentale per il corretto funzionamento del cervello e la sua disregolazione può provocare disturbi dello sviluppo neurologico e psichiatrici dopo la nascita. Infatti, è stato scoperto che molti geni responsabili di queste malattie sono coinvolti in questo processo, e quindi, rivelare come queste mutazioni influenzano la dinamica cellulare è importante per comprendere la patogenesi di queste malattie. Questo protocollo introduce una tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni migratori e progenitori gliali in fette di cervello ottenute da embrioni di topo. Le cellule sono marcate con proteine fluorescenti utilizzando l'elettroporazione in utero , che visualizza le singole cellule che migrano dalla zona ventricolare con un alto rapporto segnale/rumore. Inoltre, questo sistema di trasferimento genico in vivo ci permette di eseguire facilmente esperimenti di guadagno o perdita di funzione su determinati geni mediante co-elettroporazione dei loro vettori di espressione o knockdown/knockout. Utilizzando questo protocollo, è possibile analizzare il comportamento migratorio e la velocità di migrazione delle singole cellule, informazioni che non vengono mai ottenute da cervelli fissi.
Introduzione
Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, la glia radiale (apicale) nella zona ventricolare palliale (VZ) che riveste il ventricolo laterale produce prima neuroni e poi progenitori gliali con un periodo di sovrapposizione1. I neuroni sono generati anche da progenitori intermedi o glia radiale basale nella zona subventricolare (SVZ) adiacente alla VZ, entrambi originati dalla glia radiale (apicale) 2,3. Nei topi, le cellule gliali radiali producono solo neuroni nel giorno embrionale (E) 12-14, sia neuroni che progenitori gliali in E15-16 e progenitori gliali da E17 in poi
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Protocollo
Il presente studio è stato condotto con l'approvazione e seguendo le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto per la ricerca sullo sviluppo, del Centro per la disabilità dello sviluppo di Aichi (#2019-013) e dell'Università di Keio (A2021-030). Topi ICR (wild-type) gravidi temporizzati sono stati ottenuti commercialmente (vedi Tabella dei materiali). Per osservare la relazione tra le cellule in migrazione e i vasi sanguigni, sono stati utilizzati topi Flt1-DsRed, in cui le cellule endoteliali esprimono DsRed22. I topi maschi Flt1-DsRed sono stati incrociati con topi ICR femmine (entrambi i topi a....
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Risultati
Le cellule gliali radiali nel VZ palliale producono solo neuroni fino a E14, e sia i neuroni che le cellule gliali a E15 ed E16. Per osservare contemporaneamente i comportamenti migratori dei neuroni e delle cellule gliali, li abbiamo marcati con GFP potenziata (EGFP) e RFP, rispettivamente, utilizzando un promotore neurone-specifico, il promotore Tα127 e il promotore28 della proteina acida fibrillare gliale umana (hGFAP), che è preferenzialmente attivato negli ast.......
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Discussione
Questo protocollo ha introdotto un metodo per l'osservazione in time-lapse di cellule derivate dal VZ palliale (corticale). Per marcare le cellule in migrazione dal VZ, abbiamo utilizzato l'elettroporazione in utero, in cui le singole cellule sono state chiaramente marcate con un rapporto segnale/rumore più elevato rispetto alla marcatura mediata da vettori virali. Utilizzando l'elettroporazione in utero, qualsiasi tipo di vettore in qualsiasi combinazione può essere facilmente introdotto nelle cellule .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il promotoreT α1 è un dono di P. Barker e F.D. Miller. Il promotore Dcx è un regalo di Q. Lu. hGFAP-Cre è stato un dono di Albee Messing. Il sistema vettoriale di trasposone PiggyBac è stato fornito dal Sanger Institute. I topi Flt1-DsRed sono stati forniti da M. Ema (Shiga University). Questo lavoro è stato sostenuto da JSPS KAKENHI (Grant Number JP21K07309 a H. Tabata, JP20H05688 e JP22K19365 a K. Nakajima) e Takeda Science Foundation, Keio Gijuku Fukuzawa Memorial Fund for the Advancement of Education and Research, Keio Gijuku Academic Development Funds a K. Nakajima.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Gruppo tubo aspiratore | Drummond | 2-040-000 | |
| Atipamezolo (5 mg/mL) | Meiji | Mepatia | |
| Autoclip | Becton Dickinson | 427630 | Integratore |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Butorfanolo (5 mg/mL) | Meiji | Vetorphale | |
| Inserto per colture cellulari | Millipore | PICM ORG 50 | |
| Microscopio confocale | Nikon | A1RHD25 | Dotato di una lente a lunga distanza di lavoro (S Plan Fluor ELWD 20XC) |
| Cryomold | Tissue-Tek | 4566 | |
| Camera di coltura | Tokken | TK-NBCMP | Elettroporatore su misura |
| NEPA Gene | NEPA21 | ||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Miscelatore di gas | Tokken | TK-MIGM01-02 | |
| Piatto di base in vetro | Iwaki | 3910-035 | Il diametro della base in vetro è di 27 mm |
| Capillari in vetro | Narishige | GD-1 | |
| HBS (2x) | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HBSS(-) | Wako | 084-08345 | |
| Unità di riscaldamento | Tokken | TK-0003HU20 | Su misura, compresa la cappa e il riscaldatore |
| hGFAP-Cre | Addgene | #40591 | Un regalo da Albee Messing |
| ImageJ | https://imagej.net/ij/ | ||
| L-glutammina (200 mM) | Gibco | 25030 | |
| Agarosio a bassa temperatura di fusione | Lonza | 50100 | |
| Medetomidina (1 mg/mL) | Meiji | Medetomin | |
| Microiniettore | Narishige | IM-300 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Sandoz | Midazolam | |
| MTrackJ | https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ | ||
| Terreno neurobasale | Gibco | 21103-049 | |
| pCAG-hyPBase | Il cDNA della pCMV-hyPBasi (un dono del Sanger Institute) è stato inserito a valle del promotore CAG della pCAGGS (un dono di J. Miyazaki). | ||
| pDcx-Dre | Il promotore Dcx di Dcx4kbEGFP70 (un dono di Q. Lu) è stato scambiato con il promotore CAG di pCAG-NLS-HA-Dre34 (un dono di Pawel Pelczar, Addgene #51272). | ||
| Penicillina + streptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Kit di purificazione del plasmide | Invitrogen | PureLink HiPure plasmidi midiprep kit (K210005) | |
| pPB-CAG-LNL-RFP | CAG-LNL di pCALNL-DsRed (un dono di Connie Cepko, Addgene #13769) e TurboRFP cDNA (Evrogen, FP232) sono stati inseriti nel sito di clonaggio di pPB-CAG.EBNXN (un dono del Sanger Institute). | ||
| pPB-CAG-rDIO-EGFP | La sequenza contenente i siti rox sintetici, la cassetta DIO sintetica e il cDNA EGFP di pEGFP-N1 (Clontech, U55762) in direzione inversa sono stati inseriti nel sito di clonaggio di pPB-CAG.EBNXN (un dono del Sanger Institute). La sequenza è fornita nel file supplementare. | ||
| Estrattore | Narishige | PN-31 | |
| StackRed | un plug-in per ImageJ | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | |
| Ago da sutura | Nazme | C-24-521-R No.1 | 1/2 cerchio, lunghezza 14 mm |
| Filo di sutura | Nazme | C-23-B2 | Seta, misura 5-0 |
| Topi ICR gravidi a tempo (wild-type) | Giappone SLC | ICR mouse | |
| TrackMate | https://imagej.net/plugins/trackmate/index | ||
| Elettrodo a pinzetta | BEX o NEPA Gene | CUY650P5 | |
| T&alfa; 1-EGFP | di pEGFP-N1 (Clontech, U55762) è stato inserito a valle del T&alfa; 1 promotore nel plasmide 253 (un dono di P. Barker e F.D.Miller) | ||
| Microtomo vibrante | Leica o Zeiss | Microtomo a lama vibrante VT1000S o Hyrax V50. |
Riferimenti
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32 (1), 149-184 (2009).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric d....
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Ristampe e permessi
