Il presente studio riporta un protocollo più semplice, rapido ed economico per isolare e far crescere in modo efficiente le cellule epiteliali mammarie umane primarie (HMEC) da piccole quantità di tessuto mammario. Questo protocollo è adatto per la produzione rapida di HMEC primari sia per applicazioni di laboratorio che cliniche.
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Articolo metodologico
Isolamento e coltura di cellule epiteliali mammarie umane primarie
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ghiandola mammaria è una struttura fondamentale del seno e svolge un ruolo essenziale nella riproduzione. Le cellule epiteliali mammarie umane (HMEC), che sono le cellule originarie del cancro al seno e di altre malattie infiammatorie correlate al seno, hanno attirato una notevole attenzione. Tuttavia, l'isolamento e la coltura di HMEC primari in vitro per scopi di ricerca è stato impegnativo a causa della loro natura altamente differenziata e cheratinizzazione e della loro breve durata. Pertanto, lo sviluppo di un metodo semplice ed efficiente per isolare e coltivare gli HMEC è di grande valore scientifico per lo studio della biologia mammaria e delle malattie correlate al seno. In questo studio, siamo riusciti a isolare gli HMEC primari da piccole quantità di tessuto mammario mediante digestione con una miscela di enzimi combinata con una coltura iniziale in siero fetale bovino-DMEM al 5% contenente l'inibitore della chinasi associata a Rho (ROCK) Y-27632, seguita da espansione della coltura in terreno cheratinocitario privo di siero. Questo approccio promuove selettivamente la crescita delle cellule epiteliali, con conseguente resa cellulare ottimizzata. La semplicità e la convenienza di questo metodo lo rendono adatto sia per la ricerca di laboratorio che per quella clinica, che dovrebbe fornire preziose informazioni su queste importanti aree di studio.
Introduzione
Il cancro al seno è il principale tipo di cancro diagnosticato nelle donne a livello globale ed è la principale causa di morte per cancro1. La patogenesi del cancro al seno è complessa e coinvolge molteplici fattori come la genetica, l'ambiente e lo stile di vita. Le HMEC, cellule attive che producono latte, sono uno dei componenti più importanti del tessuto mammario e probabilmente sono le cellule originali coinvolte nella carcinogenesi del cancro al seno. Pertanto, gli HMEC hanno ricevuto la massima attenzione dai ricercatori per lo studio del cancro al seno2. Inoltre, le cellule primarie hanno la capacità di fornire una caratterizzazione biologicamente rilevante di processi cellulari complessi grazie al loro mantenimento della stabilità genetica, della normale morfologia e di un insieme più completo di funzioni cellulari di base che non possono essere raggiunte con linee cellulari immortalizzate3. Pertanto, l'isolamento e la coltura degli HMEC primari è un passo essenziale per lo studio della maggior parte delle malattie legate al seno come il cancro al seno e le malattie infiammatorie al seno.
Attualmente, è stato stabilito un sistema stabile e riproducibile per l'isolamento, la coltura e l'identificazione di cellule epiteliali mammarie da ratti, mucche, suini e capre 4,5,6,7. Tuttavia, l'isolamento e la coltura degli HMEC primari sono difficili a causa del complesso microambiente e della bassa resa delle cellule. Per decenni, gli scienziati hanno cercato il metodo più efficace per isolare e coltivare gli HMEC, anche se un sistema di coltura per gli HMEC è stato istituito quasi 20 anni fa. Ad esempio, Hammond et al. hanno sviluppato un terreno di coltura privo di siero in cui gli HMEC sono cresciuti in modo efficiente8. Recentemente, Zubeldia-Plazaola et al. hanno testato quattro diversi metodi di isolamento utilizzando procedure di digestione enzimatica veloce/lenta combinate con fasi di filtrazione sequenziale o centrifugazione differenziale per ottenere HMEC9. Hanno scoperto che il metodo della digestione lenta insieme alla centrifugazione differenziale è il metodo più efficiente per isolare gli HMEC dal tessuto mammario fresco. Tuttavia, questo metodo di isolamento richiede grandi pezzi di tessuto (40-75 g) e utilizza quantità maggiori di enzimi per la digestione. La loro procedura è complicata (almeno tre diverse centrifugazioni per ottenere diverse frazioni cellulari), oltre che dispendiosa in termini di tempo. Pertanto, è ancora necessario un metodo semplice e rapido per ottenere in modo efficiente popolazioni di HMEC da piccole quantità di tessuto mammario per la ricerca e le applicazioni cliniche9.
I nostri studi precedenti hanno dimostrato che l'aggiunta dell'inibitore della chinasi associata Rho (ROCK) Y-27632 nel terreno di coltura iniziale può semplificare il processo di isolamento delle cellule epidermiche della pelle umana10, che è stato utilizzato con successo anche per l'isolamento delle cellule epiteliali gengivali11. Inoltre, ricerche precedenti condotte dal gruppo di Zubeldia-Plazaola e dal gruppo di Jin hanno indicato che Y-27632 ha la capacità di stimolare la crescita rapida e illimitata in vitro di cellule epiteliali primarie derivate dal tessuto mammario 9,12. Il presente studio mirava a verificare se l'uso di Y-27632 avrebbe semplificato l'isolamento e la coltura degli HMEC e abbiamo stabilito con successo un metodo semplice e facilmente eseguibile per isolare gli HMEC da piccoli pezzi (1 g) di tessuto mammario.
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Protocollo
I tessuti mammari freschi e normali utilizzati in questo protocollo vengono raccolti dalla chirurgia intorno alla lesione della mastite lobulare granulomatosa refrattaria nel primo ospedale affiliato dell'Università di medicina cinese di Zhejiang secondo le linee guida del Comitato etico medico del primo ospedale affiliato dell'Università di medicina cinese di Zhejiang (protocollo n. ChiMCTR2100005281, Data: 2017-07-17).
1. Acquisizione di tessuti
- Raccogliere tessuti mammari freschi da campioni chirurgici prelevati da donne adulte in provette sterili contenenti 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con il 3% di penicillina/streptomicina (P/S).
NOTA: I tessuti mammari devono essere maneggiati secondo i seguenti dettagli entro 24 ore dal prelievo dall'intervento.
2. Pretrattamento dei tessuti
- Rimuovere il tessuto adiposo dal tessuto mammario con due paia di pinze, assicurandosi che il tessuto mammario rimanente abbia un peso di ~1 g.
- Sciacquare il tessuto mammario in una soluzione di etanolo al 75% (5 mL) per 5 s e quindi lavare con 20 mL di soluzione di lavaggio (Tabella 1) per 2 x 5 min.
3. Digestione dei tessuti
- Tagliare il tessuto mammario in frammenti più piccoli, sminuzzando il tessuto utilizzando due lame chirurgiche per una durata di 15 minuti per ottenere l'omogeneizzato tissutale. Trasferire i pezzi di tessuto in una provetta da centrifuga da 50 ml.
- Aggiungere 10 mL di 5,0 mg/mL di dispasi + 5,0 mg/mL di soluzione di collagenasi, 3 mL di tripsina allo 0,25% e 7 mL di PBS per un totale di 20 mL di soluzione digestiva in una provetta da centrifuga da 50 mL che contiene i frammenti di tessuto mammario. Porre la provetta a bagnomaria a 37 °C e incubare per 1,5 h; Agitare il tubo ogni 20 minuti.
- Arrestare il processo di digestione iniettando 20 ml di soluzione neutralizzante. Miscelare il contenuto pipettando ~15x.
- Filtrare la miscela attraverso un filtro a maglie da 100 μm. Centrifugare a 156 × g per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e ripetere l'incubazione del pellet con 20 mL di soluzione neutralizzante. Miscelare il contenuto pipettando 15 volte e centrifugare a 156 × g per 5 minuti.
- Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 10 mL di terreno di coltura iniziale. Piastra la sospensione cellulare in una piastra per coltura cellulare da 100 mm.
- Coltivare le cellule in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C. Sostituire il terreno di coltura originale con un terreno di coltura epiteliale fresco ogni tre giorni. Controllare le celle e rinfrescare il terreno ogni 2 giorni.
4. Passaggio di celle
- Rimuovere la piastra da 100 mm dall'incubatore quando le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza, scartare il terreno utilizzato e sciacquare la piastra 2 volte con 2 mL di PBS. Rimuovere il PBS e quindi aggiungere 2 ml di tripsina allo 0,05% in ogni piatto da 100 mm.
NOTA: Agitare la pirofila per assicurarsi che la soluzione di tripsina sia a contatto sufficiente con il fondo della piastra. - Posizionare la piastra da 100 mm in un'incubatrice a 37 °C per ~7 minuti per il processo di digestione.
- Esamina le cellule con un microscopio utilizzando un obiettivo 40x per assicurarti che la maggior parte delle cellule sia stata dissociata dal fondo del piatto.
- Arrestare il processo di digestione aggiungendo 8 ml di soluzione neutralizzante e trasferire le cellule in una provetta da 15 ml. Mescolare le cellule pipettando su e giù 10-15 volte. Centrifugare le celle a 156 × g per 5 min.
- Rimuovere con cura il surnatante, risospendere le cellule con 10 ml di terreno cellulare epiteliale e contare il numero di cellule.
- Aggiungere 1 × 106 cellule in 10 mL di terreno cellulare epiteliale in un piatto da 100 mm.
- Rinfrescare il terreno cellulare epiteliale e osservare le cellule ogni 2 giorni.
5. Crioconservazione cellulare
- Ripetere i passaggi 4.1-4.4.
- Rimuovere con cura il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL di soluzione di crioconservazione cellulare.
- Trasferire 1 mL della soluzione di crioconservazione contenente le cellule in ciascuna fiala criogenica.
- Annota i nomi delle celle crioconservate, i numeri di passaggio e le date.
- Porre i flaconcini in un contenitore di congelamento a velocità controllata a -80 °C per una notte.
- Rimuovere le fiale criogeniche dal congelatore a -80 °C e trasferirle rapidamente in azoto liquido per una conservazione a lungo termine.
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Risultati
Nella Figura 1 viene illustrato uno schema della procedura. Il protocollo prevede l'uso di una combinazione di enzimi, vale a dire dispasi, collagenasi e tripsina. Questa combinazione viene utilizzata allo scopo di staccare il foglio epiteliale dallo strato di fibroblasti sottostante e successivamente utilizzare la tripsina per dissociare le cellule epiteliali mammarie in una sospensione. Inoltre, la crescita delle cellule epiteliali è stata efficacemente promossa aggiungendo Y-27632 al terr...
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Discussione
Gli HMEC sono vitali per preservare l'integrità anatomica e funzionale del tessuto mammario e sono utili nelle indagini scientifiche, nelle implementazioni cliniche e nei domini associati15. Le cellule epiteliali primarie sono un tipo di cellule specializzate che hanno passaggi limitati e una durata di vita più breve. Tuttavia, la crescita degli HMEC è stata ostacolata da vincoli tecnici, che hanno di conseguenza ostacolato i progressi della ricerca sul cancro al seno e su altre malattie infiammat...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non vi sono conflitti di interesse in merito alla pubblicazione di questo articolo.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del programma di scienza e tecnologia TCM della provincia di Zhejiang, Cina (2017ZA055; 2018ZA036) e il progetto scientifico e tecnologico di Zunyi, provincia di Guizhou, Cina (Zunyi City Kehe Support NS (2020) n. 18) a X. Xu. Gli autori ringraziano il Laboratorio di Biologia Molecolare della Società di Tecnologia Biomedica Youjia (Hangzhou) per aver fornito formazione sulle colture cellulari.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina | Basalmedia | K431010 | Per dissociazione HMEC |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | NEST | 081722CK01 | Per digestione cellulare |
| 100 &; filtro a rete | m Solarbio | 431752 | Per la filtrazione di HMEC |
| Piatto per colture cellulari da 100 mm Corning | 430167 | Per colture cellulari | |
| % paraformaldeide | solarbio | P1110-100ml | Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HMEC |
| Provetta da centrifuga da 50 ml | Corning | 430829 | Per centrifugazione cellulare |
| Filtro cellulare | Solarbio | 431752 | Centrifuga di filtrazione cellulare |
| Eppendorf | 5404HN133048 | Centrifuga cellulare | |
| CO2 Incubatore | Thermo Scientific | 42820906 | Per incubazione cellulare |
| Collagenasi Tipo I | Merck | SKU:SCR103 | Per isolamento HMEC |
| Dispase | Solarbio | CAS:42613-33-2 | Per l'isolamento |
| HMEC DMEM | Gibco | 8122622 | Componente del mezzo di neutralizzazione |
| Fetale Siero bovino fetale | Gibco | 2556132P | Componente del mezzo di neutralizzazione |
| Penicillina/Streptomicina | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotici |
| Soluzione tamponata con fosfato | Tecono | 20201033 | Soluzione di lavaggio |
| coniglio anti CK7 | abcam | ab68459 | Per colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HMEC |
| coniglio anti GATA3 | abcam | ab199428 | Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HMEC |
| Y-27632 | Solarbio | IY0040 | ROCK inibitore |
Riferimenti
- Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers (Basel). 14 (10), 2569(2022).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: Their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
- Faridi, N., et al. Isolation and characterization of the primary epithelial breast cancer cells and the adjacent normal epithelial cells from iranian women's breast cancer tumors. Cytotechnology. 70 (2), 625-639 (2018).
- Tovar, E. A., et al. Dissecting the rat mammary gland: Isolation, characterization, and culture of purified mammary epithelial cells and fibroblasts. Bio Protoc. 10 (22), e3818(2020).
- Jiang, X., Yang, H., Jing, Q., He, X. A "selective secondary tissue attachment" method for isolation and purification of mammary epithelial cells. Acta Histochem. 124 (8), 151972(2022).
- Bernardini, C., et al. Development of a pig mammary epithelial cell culture model as a non-clinical tool for studying epithelial barrier-a contribution from the imi-conception project. Animals (Basel). 11 (7), 2012(2021).
- Zhang, D., et al. Transdifferentiation of goat ear fibroblasts into lactating mammary epithelial cells induced by small molecule compounds. Biochem Biophys Res Commun. 573, 55-61 (2021).
- Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. Serum-free growth of human mammary epithelial cells: Rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (17), 5435-5439 (1984).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. J Vis Exp. (138), e57784(2018).
- Xie, Z., et al. Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using y-27632. J Vis Exp. (177), e62978(2021).
- Jin, L., et al. Characterization of primary human mammary epithelial cells isolated and propagated by conditional reprogrammed cell culture. Oncotarget. 9 (14), 11503-11514 (2018).
- Böcker, W., Hungermann, D., Decker, T. Anatomy of the breast. Pathologe. 30 (1), 6-12 (2009).
- Kouros-Mehr, H., Slorach, E. M., Sternlicht, M. D., Werb, Z. Gata-3 maintains the differentiation of the luminal cell fate in the mammary gland. Cell. 127 (5), 1041-1055 (2006).
- Wang, X., Reagan, M. R., Kaplan, D. L. Synthetic adipose tissue models for studying mammary gland development and breast tissue engineering. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (3), 365-376 (2010).
- Ethier, S. P., Mahacek, M. L., Gullick, W. J., Frank, T. S., Weber, B. L. Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media. Cancer Res. 53 (3), 627-635 (1993).
- Band, V., Sager, R. Distinctive traits of normal and tumor-derived human mammary epithelial cells expressed in a medium that supports long-term growth of both cell types. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (4), 1249-1253 (1989).
- Taylor-Papadimitriou, J., Shearer, M., Tilly, R. Some properties of cells cultured from early-lactation human milk. J Natl Cancer Inst. 58 (6), 1563-1571 (1977).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
- Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C378-C387 (2008).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., Mcbride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Ścieżyńska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. J Invest Dermatol. 93 (2), 287-290 (1989).
- Ren, H. J., et al. Primary cultures of mouse small intestinal epithelial cells using the dissociating enzyme type I collagenase and hyaluronidase. Braz J Med Biol Res. 50 (5), e5831(2017).
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