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Articolo metodologico

Preparazione e analisi di vetrini istologici di bulbi oculari di ratto e topo per la valutazione della retina

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DOI:

10.3791/66663

⸱

23 agosto 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chair and Department of Experimental and Clinical Physiology, Laboratory of Centre for Preclinical Research, Medical University of Warsaw, 2Department of Pathology, Medical University of Warsaw

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto presenta un protocollo per la preparazione istologica di vetrini da bulbi oculari di roditori. Con il metodo proposto, la retina interna può essere facilmente visualizzata e valutata al microscopio ottico. La procedura è presentata per i bulbi oculari di topi e ratti.

Abstract

Un bulbo oculare di roditore è un potente strumento per la ricerca dei meccanismi patologici di molte malattie oftalmiche, come il glaucoma, la retinopatia ipertensiva e molte altre. Gli esperimenti preclinici consentono ai ricercatori di esaminare l'efficacia di nuovi farmaci, sviluppare nuovi metodi di trattamento o cercare nuovi meccanismi patologici coinvolti nell'insorgenza o nella progressione della malattia. L'esame istologico fornisce molte informazioni necessarie per valutare gli effetti degli esperimenti condotti e può rivelare degenerazioni, rimodellamento tissutale, infiltrazioni e molte altre patologie. Nella ricerca clinica, raramente c'è la possibilità di ottenere un tessuto oculare adatto a un esame istologico, motivo per cui i ricercatori dovrebbero sfruttare l'opportunità offerta dall'esame dei bulbi oculari dei roditori. Il manoscritto presenta un protocollo per la preparazione istologica delle sezioni dei bulbi oculari dei roditori. La procedura è presentata per i bulbi oculari di topi e ratti e prevede le seguenti fasi: (i) raccolta del bulbo oculare, (ii) conservazione del bulbo oculare per ulteriori analisi, (iii) elaborazione del tessuto in paraffina, (iv) preparazione di vetrini, (v) colorazione con ematossilina ed eosina, (vi) valutazione del tessuto al microscopio ottico. Con il metodo proposto, la retina può essere facilmente visualizzata e valutata in dettaglio.

Introduzione

Il bulbo oculare è una struttura simile a un globo che costituisce l'organo della vista. L'interno del bulbo oculare può essere diviso in due segmenti: il segmento anteriore, che comprende la cornea, l'iride, il corpo ciliare, il cristallino, la camera anteriore e la camera posteriore, e il segmento posteriore, che comprende il corpo vitreo, la retina, la coroide, la sclera, la testa del nervo ottico. La camera anteriore si trova tra la cornea e l'iride 1,2. L'iride è una struttura circolare con un'apertura al centro chiamata pupilla. All'incrocio tra la cornea e l'iride, c'è l'angolo di drenaggio, dove un sistema specializzato di trabecole drena l'umore acqueo dal bulbo oculare al sistema venoso. La camera posteriore è delimitata dall'iride, dal corpo ciliare e dal cristallino, nonché dai legamenti sospensori che tengono il cristallino in posizione. Dietro la lente si trova il corpo vitreo, che è la struttura più grande del bulbo oculare. Il corpo vitreo aderisce alla retina e ne stabilizza la posizione. La retina è circondata dalla coroide e dalla sclera1. L'anatomia del bulbo oculare è riassunta nella Figura 1.

La parete del bulbo oculare è costituita da tre strati. Lo strato più esterno è la sclera, che protegge il bulbo oculare dalle lesioni e ne mantiene la forma. Al polo anteriore del bulbo oculare, la sclera si trasforma in una cornea trasparente. Sotto la sclera c'è una struttura vascolare chiamata uvea, la cui funzione primaria è quella di nutrire le strutture dell'occhio. L'uvea forma la coroide e, all'interno del polo anteriore, il corpo ciliare e l'iride1. Lo strato più interno è la retina, che è una struttura altamente specializzata dell'occhio, composta da neuroni, cellule gliali e cellule epiteliali pigmentate. I neuroni retinici includono le cellule fotorecettrici (bastoncelli e coni), le cellule orizzontali, le cellule bipolari, le cellule amacrine e le cellule gangliari retiniche (RGC). Queste cellule sono organizzate in strati complessi e il loro ruolo è quello di ricevere ed elaborare gli stimoli luminosi 2,3. Le cellule gliali della retina comprendono le cellule di Müller, gli astrociti e la microglia, che sono presenti in tutti gli strati della retina. Le numerose funzioni delle cellule gliali includono la nutrizione dei neuroni, il supporto della barriera emato-retinica, il supporto strutturale dei neuroni per mantenere la struttura stratificata della retina, la regolazione del metabolismo dei neuroni, la secrezione di proteine biologicamente attive che regolano il funzionamento, la crescita e la sopravvivenza dei neuroni e la regolazione dei processi immunologici all'interno della retina4. Le cellule epiteliali pigmentate costituiscono lo strato più esterno della retina e fungono da barriera tra la coroide e i fotorecettori. Queste cellule regolano il trasporto bidirezionale dei prodotti di scarto e dei nutrienti e proteggono anche la retina da danni indotti dalla luce eccessiva assorbendo l'energia luminosa e neutralizzando le specie reattive dell'ossigeno generate dalla luce5.

La retina può essere suddivisa in dieci strati: (i) l'epitelio pigmentato retinico, (ii) lo strato del segmento fotorecettore (bastoncelli e coni), (iii) membrana limitante esterna (ELM), (iv) strato nucleare esterno (ONL), (v) strato plessiforme esterno (OPL), (vi) strato nucleare interno (INL), (vii) strato plessiforme interno (IPL), (viii) strato di cellule gangliari (GCL), (ix) strato di fibre nervose retiniche (RNFL), e (x) membrana limitante interna (ILM)2. Gli strati nucleati della retina includono l'ONL, l'INL e il GCL, mentre gli strati con connessioni sinaptiche tra le cellule includono l'OPL e l'IPL6. I nuclei dei bastoncelli e dei coni formano l'ONL e i loro assoni si estendono nell'OPL, dove si collegano ai dendriti delle cellule bipolari e orizzontali. All'interno dell'INL si trovano i nuclei delle cellule orizzontali, bipolari e amacrine. All'interno dell'IPL, i terminali assonali delle cellule bipolari e amacrine fanno sinapsi con i dendriti delle RGC. All'interno del GCL, le RGC costituiscono la maggior parte dei corpi cellulari, ma vi si possono trovare anche alcune cellule amacrine dislocate. Gli assoni delle RGC formano l'RNFL e, inoltre, il nervo ottico 7,8,9.

Molte malattie oftalmiche, come i disturbi neurodegenerativi della retina, portano a cecità irreversibile e incurabile10. La vista è considerata uno dei sensi più importanti11 e la cecità permanente riduce significativamente la qualità della vita del paziente. Per approfondire la comprensione dei meccanismi patologici di molte malattie, viene ampiamente eseguita la ricerca preclinica utilizzando colture cellulari o modelli animali. Gli studi preclinici su animali da esperimento offrono l'opportunità di valutare i meccanismi patologici alla base delle malattie oculari e di sviluppare nuove strategie terapeutiche. Le malattie degli occhi possono essere modellate sia in animali di grandi dimensioni (scimmie, mucche, cani e gatti) che in piccoli animali (conigli, ratti, topi e pesci zebra). L'uso di animali più grandi consente un migliore accesso all'occhio grazie alle sue dimensioni. Gli esperimenti condotti con i roditori, invece, a causa della loro riproduzione relativamente rapida, consentono l'allevamento di ceppi consanguinei caratterizzati da suscettibilità a determinate malattie12,13.

Nei modelli animali è possibile l'enucleazione, che consente di eseguire un esame istopatologico dettagliato del bulbo oculare, con la valutazione di patologie minori che compaiono in particolari strutture dell'occhio durante lo sviluppo della malattia, un esame che può essere eseguito molto raramente tra gli esseri umani. La valutazione istopatologica è uno strumento estremamente prezioso nella ricerca dei meccanismi patologici dei disturbi oculari. Nella letteratura pubblicata, le descrizioni della metodologia per l'esame istologico dei bulbi oculari sono molto limitate e mancano guide passo-passo, il che rende difficile per i principianti ricreare. Questo studio mira a fornire un metodo semplice e conciso per preparare vetrini istologici e valutare la retina di ratto e topo.

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Protocollo

La ricerca è stata condotta nel rispetto delle linee guida istituzionali. I bulbi oculari utilizzati in questo studio sono stati ottenuti da animali inclusi in un esperimento condotto sulla base del numero di approvazione dello studio WAW2/122/2020 emesso dal 2° Comitato Etico Locale presso l'Università di Scienze della Vita di Varsavia, in Polonia. Il nostro protocollo è stato sviluppato esaminando topi di età compresa tra 11 e 44 settimane e ratti di età compresa tra 6, 12 e 16 settimane.

1. Preparazione dei bulbi oculari del mouse

NOTA: Questo protocollo presenta il metodo di preparazione di sezioni di bulbi oculari di topo ed è stato sviluppato utilizzando bulbi oculari raccolti da: topi femmina C57Bl/6 di 11 settimane (peso medio 21 g), femmine di topi C57Bl/6 di 44 settimane (peso medio 25 g), femmine di topi DBA/2 di 11 settimane (peso medio 21,5 g) e femmine di topi DBA/2 di 44 settimane con glaucoma (peso medio 25 g).

  1. Enucleazione
    1. Usa una piccola pinza per aprire le palpebre. Premi le palpebre per far prolassare il bulbo oculare.
    2. Seziona il bulbo oculare dall'orbita tagliando il tessuto dietro il bulbo oculare con forbici piccole e affilate. Una volta rimosso il bulbo oculare dall'orbita, tagliare il tessuto connettivo sporgente e i muscoli perioculari.
      1. Segna i bulbi oculari per un migliore orientamento, ad esempio, legando una piccola sutura sul moncone del tendine del muscolo retto laterale del bulbo oculare per contrassegnare il lato temporale del bulbo oculare.
  2. Fissazione dei tessuti
    1. Porre il bulbo oculare enucleato in provette da microcentrifuga da 1,5 mL e lasciarlo riposare in una soluzione al 4 % di paraformaldeide (PFA) disciolta in soluzione salina tampone fosfato (PBS) per 24 ore.
    2. Successivamente, trattare il bulbo oculare per 24 ore in una soluzione al 10% di saccarosio, quindi rimuoverlo e posizionarlo per 24 ore in una soluzione al 20% di saccarosio e, infine, rimuovere e posizionare per 24 ore in una soluzione al 30% di saccarosio.
      NOTA: Durante tutto il processo, mantenere il bulbo oculare a una temperatura bassa di 4 °C. Le punture dell'ago per infiltrazione di saccarosio devono essere evitate per ridurre al minimo il rischio di danni al bulbo oculare.
  3. Congelamento e conservazione dei tessuti
    1. Togliete il bulbo oculare dalla soluzione di saccarosio e asciugatelo tamponandolo leggermente con un tovagliolo di carta.
    2. Posizionare il bulbo oculare in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 ml e congelare a - 80 °C per una futura lavorazione.
      NOTA: Se conservato a - 80 °C, un bulbo oculare può rimanere vitale fino a 12 mesi fino a una futura elaborazione.
  4. Preparazione dei vetrini
    1. Scongelare il bulbo oculare a temperatura ambiente. Spostarlo dalla provetta della microcentrifuga in una cassetta e sciacquarlo sotto l'acqua corrente per 20 minuti per lavare via il saccarosio.
    2. Disidratare il bulbo oculare immergendolo nelle seguenti soluzioni sotto una cappa aspirante e quindi rimuovendolo dalle seguenti soluzioni: soluzione al 70% di alcol etilico (EtOH) per 10 minuti, soluzione all'80% di EtOH per 10 minuti, soluzione al 96% di EtOH per 10 minuti, soluzione al 99,9% di EtOH per 10 minuti e acetone per 5 minuti.
    3. Pulisci il bulbo oculare mettendolo nello xilene per 5 minuti sotto una cappa aspirante.
    4. Sciogliere la paraffina mettendo un po' di paraffina solida in un becher e mettendola in un incubatore da laboratorio impostato a una temperatura superiore a quella di fusione specificata dal produttore della paraffina (la temperatura di fusione della paraffina è compresa tra 46 °C e 68 °C). Dopo che la paraffina è completamente sciolta (il tempo dipende dalla quantità di paraffina utilizzata), spostare il bulbo oculare nel becher con la paraffina e tenere in caldo nell'incubatrice per 1 ora. Durante 1 ora di infiltrazione di paraffina nel tessuto, mescolare la paraffina ogni 10 - 15 minuti.
      NOTA: Per questa fase è possibile utilizzare un processatore di tessuti che consenta l'infiltrazione di paraffina durante l'agitazione della soluzione.
    5. Incorporare il bulbo oculare in un blocco di paraffina come descritto di seguito.
      1. Aprire la cassetta e rimuovere il coperchio superiore. Scegli uno stampo di metallo e versa una piccola quantità di paraffina per coprire il fondo dello stampo. Rimuovere il bulbo oculare dalla cassetta con una pinza e posizionarlo sulla paraffina nello stampo. Posizionare il bulbo oculare su un lato per garantire il taglio sul piano sagittale.
        NOTA: Posizionando il bulbo oculare su un lato (con il polo anteriore da un lato e il polo posteriore dall'altro) sarà possibile tagliare sul piano sagittale. In questo modo, si otterranno sezioni attraverso la cornea, l'iride, il corpo ciliare, la pupilla, la retina periferica e centrale.
      2. Raffreddare brevemente lo stampo su una piastra di raffreddamento impostata a - 15 °C in modo che la paraffina si solidifichi leggermente per ancorare il tessuto in posizione. Coprire accuratamente il fazzoletto con paraffina e il fondo della cassetta per formare un blocco. Mettere il blocco su una piastra di raffreddamento per solidificare completamente. Quindi, rimuovere il blocco dallo stampo di metallo e riposizionare i blocchi di paraffina sulla piastra di raffreddamento per almeno 15 minuti a raffreddare prima di tagliare.
    6. Fissare un blocco di paraffina nel microtomo. Impostare il microtomo per tagliare la paraffina in eccesso dal blocco (lo abbiamo impostato per tagliare 15 μm) e tagliare fino al centro del bulbo oculare. Modificare le impostazioni del microtomo per tagliare sezioni più sottili (lo abbiamo impostato per tagliare 3,5 μm) e posizionare la sezione su un vetrino. Se si utilizza un microtomo con un bagnomaria adiacente, rimuovere l'acqua in eccesso dal vetrino con un fazzoletto umido.
      NOTA: L'obiettivo è quello di ottenere almeno 3 sezioni trasversali attraverso la pupilla. Meno esperto è il ricercatore, più sezioni dovrebbero essere ottenute per garantire il sezionamento a livello dell'alunno. Posiziona un paio di sezioni su un vetrino. Inoltre, per i ricercatori meno esperti, tagliare il tessuto più spesso, ad esempio, in sezioni di 4 μm o 5 μm di spessore. L'uso di un microtomo con un bagno d'acqua adiacente rende il processo di trasferimento di sezioni di tessuto su vetrini molto più semplice rispetto all'utilizzo di microtomi senza bagni d'acqua. Un altro punto degno di nota è che l'obiettivo potrebbe essere difficile da tagliare. Per ridurre al minimo il rischio di danni ai tessuti causati dalla lente fragile, utilizzare solo lame per microtomo affilate progettate per tagliare i tessuti duri. Prendi in considerazione l'utilizzo di una lama per il taglio e un'altra per il taglio delle sezioni per ridurre al minimo l'smussamento della lama.
    7. Posizionare il vetrino in un incubatore da laboratorio a 56 °C per 30 minuti.
    8. Rimuovere il vetrino dall'incubatrice e iniziare a colorarlo manualmente con ematossilina ed eosina (H&E) inserendo e rimuovendo in sequenza il vetrino da e verso le seguenti soluzioni. Inizia con 7 minuti di xilene, 5 minuti di xilene (un altro becher con una soluzione pulita) e 5 min di xilene (un altro becher con una soluzione pulita). Seguire con 2 minuti di EtOH al 96%, 1 minuto di EtOH al 96% (un altro bicchiere con una soluzione pulita), 1 minuto di EtOH al 96% (un altro bicchiere con una soluzione pulita).
    9. Lavare in 5 minuti di acqua corrente, quindi 2 minuti di ematossilina di Mayer, 2 minuti di ematossilina di Mayer (un altro becher con una soluzione pulita), 5 minuti di acqua corrente, 5 minuti di acqua corrente (un altro becher pulito).
    10. Aggiungere l'1% di eosina per 2 minuti, seguito da 1 minuto di EtOH al 96%, 30 s di EtOH al 96% (un altro becher con una soluzione pulita), 30 s di EtOH al 96% (un altro becher con una soluzione pulita), 2 min di xilene, 1 min di xilene (un altro becher con una soluzione pulita), 2 min di xilene (un altro becher con una soluzione pulita).
      NOTA: In alternativa, utilizzare un coloratore automatico per vetrini.
    11. Sigillare il vetrino utilizzando un sigillatore automatico per vetrini. Il vetrino preparato è pronto per la conservazione e la valutazione al microscopio ottico.
      NOTA: In alternativa, eseguire manualmente la sigillatura dei vetrini posizionando un sottile strato di polistirene sul tessuto colorato e coprendolo con un vetrino coprioggetti.
      ATTENZIONE: I passaggi che includono PFA, EtOH, acetone e xilene devono essere eseguiti sotto una cappa aspirante da laboratorio.

2. Preparazione della sezione dei bulbi oculari di ratto e del montaggio del vetrino

NOTA: Questo protocollo presenta il metodo di preparazione di sezioni di bulbi oculari di ratto ed è stato sviluppato utilizzando i bulbi oculari raccolti da: ratti SHR maschi di 6 settimane (peso medio 115,5 g), ratti SHR maschi di 12 settimane con ipertensione arteriosa (peso medio 262,5 g), ratti WKY maschi di 6 settimane (peso medio 143,5 g), ratti WKY maschi di 12 settimane (peso medio 265 g), ratti Lewis maschi di 12 settimane (peso medio 310 g) e ratti Lewis maschi di 16 settimane con diabete mellito indotto (peso medio 259 g).

  1. Enucleazione
    1. Usa una piccola pinza per aprire le palpebre. Premere sulle palpebre per prolassare il bulbo oculare.
    2. Seziona il bulbo oculare dall'orbita tagliando il tessuto dietro il bulbo oculare con forbici piccole e affilate.
      NOTA: Segnare i bulbi oculari per un migliore orientamento, ad esempio legando una piccola sutura sul moncone del tendine del muscolo retto laterale del bulbo oculare per contrassegnare il lato temporale del bulbo oculare.
  2. Fissazione dei tessuti
    1. Posizionare il bulbo oculare enucleato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e lasciarlo riposare in una soluzione al 4% di paraformaldeide (PFA) disciolta in soluzione salina tampone fosfato (PBS) per 24 ore.
    2. Successivamente, trattare il bulbo oculare per 24 ore in una soluzione al 10% di saccarosio, quindi rimuoverlo e posizionarlo per 24 ore in una soluzione al 20% di saccarosio, e infine rimuoverlo e posizionarlo per 24 ore in una soluzione al 30% di saccarosio.
      NOTA: Durante tutto il processo, mantenere il bulbo oculare a una temperatura bassa di 4 °C. Le punture dell'ago per infiltrazione di saccarosio devono essere evitate per ridurre al minimo il rischio di danni al bulbo oculare.
  3. Congelamento e conservazione dei tessuti
    1. Togliete il bulbo oculare dalla soluzione di saccarosio e asciugatelo tamponandolo leggermente con un tovagliolo di carta.
    2. Posizionare il bulbo oculare in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 ml e congelarla a -80 °C per una futura elaborazione.
      NOTA: Se conservato a -80 °C, il bulbo oculare può rimanere vitale fino a 12 mesi fino alla futura lavorazione.
  4. Preparazione dei vetrini
    1. Rimuovere il bulbo oculare dal congelatore e dalla provetta da microcentrifuga. Taglia il bulbo oculare a metà lungo il piano sagittale con un bisturi affilato. Rimuovere ed eliminare l'obiettivo.
      NOTA: Questo passaggio è più facile da eseguire su un bulbo oculare congelato, appena estratto dal congelatore. Durante il taglio del bulbo oculare, la lente può danneggiare il tessuto circostante. Per ridurre al minimo il rischio di danni, utilizzare un bisturi molto affilato e rimanere prudenti.
    2. Scongelare il bulbo oculare a temperatura ambiente. Spostare le due metà in una cassetta e sciacquarle sotto l'acqua corrente per 20 minuti per lavare via il saccarosio.
    3. Disidratare il bulbo oculare inserendolo e quindi rimuovendolo dalle seguenti soluzioni sotto una cappa aspirante: soluzione al 70% di alcol etilico (EtOH) per 15 minuti, soluzione all'80% di EtOH per 15 minuti, soluzione al 96% di EtOH per 15 minuti, soluzione al 99,9% di EtOH per 15 minuti e acetone per 7 minuti.
    4. Pulisci il bulbo oculare mettendolo nello xilene per 7 minuti sotto una cappa aspirante.
    5. Sciogliere la paraffina mettendo un po' di paraffina solida in un becher e mettendola in un incubatore da laboratorio impostato a una temperatura superiore a quella di fusione specificata dal produttore della paraffina (la temperatura di fusione della paraffina è compresa tra 46 °C e 68 °C). Dopo che la paraffina è completamente sciolta (il tempo dipende dalla quantità di paraffina utilizzata), spostare il bulbo oculare nel becher con la paraffina e tenerlo in caldo nell'incubatrice per 1 ora. Durante 1 ora di infiltrazione di paraffina nel tessuto, mescolare la paraffina ogni 10 - 15 minuti.
      NOTA: Per questa fase è possibile utilizzare un processatore di tessuti che consenta l'infiltrazione di paraffina durante l'agitazione della soluzione.
    6. Incorporare il bulbo oculare in un blocco di paraffina come descritto di seguito.
      1. Aprire la cassetta e rimuovere il coperchio superiore. Scegli uno stampo di metallo e versa una piccola quantità di paraffina per coprire il fondo dello stampo. Rimuovere il bulbo oculare dalla cassetta con una pinza e posizionarlo sulla paraffina nello stampo. Posiziona una metà del bulbo oculare con la parte inferiore della tazza verso l'alto e l'altra verso il basso.
        NOTA: Posizionando le metà del bulbo oculare con una metà con la parte inferiore della coppetta verso l'alto e l'altra verso il basso, sarà possibile tagliare il tessuto sul piano sagittale. In questo modo, si otterranno sezioni attraverso la cornea, l'iride, il corpo ciliare, la pupilla, la retina periferica e centrale.
      2. Raffreddare brevemente lo stampo su una piastra di raffreddamento impostata a - 15 °C in modo che la paraffina si solidifichi leggermente e ancoracci il bulbo oculare in posizione. Coprire accuratamente il bulbo oculare con paraffina e il fondo della cassetta per formare un blocco. Mettere il blocco su una piastra di raffreddamento per solidificare completamente. Quindi, rimuovere il blocco dallo stampo di metallo e riposizionare i blocchi di paraffina sulla piastra di raffreddamento per almeno 15 minuti a raffreddare prima di tagliare.
    7. Fissare un blocco di paraffina nel microtomo. Imposta il microtomo per tagliare la paraffina in eccesso dal blocco (l'abbiamo impostato per tagliare 15 μm) e taglia fino a raggiungere il centro del bulbo oculare. Modificare le impostazioni del microtomo per tagliare sezioni più sottili (lo abbiamo impostato per tagliare 3,5 μm) e posizionare la sezione su un vetrino. Se si utilizza un microtomo con un bagnomaria adiacente, rimuovere l'acqua in eccesso dal vetrino con un fazzoletto umido.
      NOTA: L'obiettivo è quello di ottenere almeno 3 sezioni trasversali attraverso la pupilla. Meno esperto è il ricercatore, più sezioni dovrebbero essere ottenute per garantire il sezionamento a livello dell'alunno. Posiziona un paio di sezioni su un vetrino. Inoltre, per i ricercatori meno esperti, tagliare il tessuto più spesso, ad esempio, in sezioni di 4 μm o 5 μm di spessore. L'uso di un microtomo con un bagno d'acqua adiacente rende il processo di trasferimento di sezioni di tessuto su vetrini molto più semplice rispetto all'utilizzo di microtomi senza bagni d'acqua.
    8. Rimuovere il vetrino e iniziare a colorare manualmente con ematossilina ed eosina (H&E) inserendo e rimuovendo in sequenza il vetrino da e verso le seguenti soluzioni. Inizia con 7 minuti di xilene, 5 minuti di xilene (un altro becher con una soluzione pulita) e 5 min di xilene (un altro becher con una soluzione pulita). Seguire con 2 minuti di EtOH al 96%, 1 minuto di EtOH al 96% (un altro bicchiere con una soluzione pulita), 1 minuto di EtOH al 96% (un altro bicchiere con una soluzione pulita).
    9. Lavare in 5 minuti di acqua corrente, quindi 2 minuti di ematossilina di Mayer, 2 minuti di ematossilina di Mayer (un altro becher con una soluzione pulita), 5 minuti di acqua corrente, 5 minuti di acqua corrente (un altro becher pulito).
    10. Aggiungere l'1% di eosina per 2 minuti, seguito da 1 minuto di EtOH al 96%, 30 s di EtOH al 96% (un altro becher con una soluzione pulita), 30 s di EtOH al 96% (un altro becher con una soluzione pulita), 2 min di xilene, 1 min di xilene (un altro becher con una soluzione pulita), 2 min di xilene (un altro becher con una soluzione pulita).
      NOTA: In alternativa, utilizzare un coloratore automatico per vetrini.
    11. Sigillare il vetrino utilizzando un sigillatore automatico per vetrini. I vetrini preparati sono pronti per la conservazione e la valutazione al microscopio ottico.
      NOTA: In alternativa, eseguire manualmente la sigillatura dei vetrini, posizionando un sottile strato di polistirene montante sul tessuto macchiato e coprire con un vetrino coprioggetti.
      ATTENZIONE: I passaggi che includono PFA, EtOH, acetone e xilene devono essere eseguiti sotto una cappa aspirante da laboratorio.

3. Valutazione delle sezioni del bulbo oculare

  1. Scansione di vetrini
    1. Inserire il vetrino in uno scanner per vetrini istopatologico ed eseguire la scansione delle sezioni utilizzando la modalità di scansione: 40x. Salva le immagini come file digitali ad alta risoluzione.
  2. Analisi dei vetrini
    1. Aprire il file scansionato con l'uso di un software di visualizzazione delle immagini. Trova le sezioni trasversali delle pupille e analizza tre sezioni consecutive.
    2. Trova la parte più spessa della retina e ingrandisci l'immagine a 20x premendo sulla casella di ingrandimento nell'angolo in alto a destra e scegliendo 20x. Sposta il mouse al livello di ELM nella parte più spessa della retina e premi il pulsante destro del mouse, scegli Annota e Righello.
    3. Spostare il mouse verso l'ILM e fare clic con il pulsante sinistro. Intitola la misura RT e seleziona le caselle mostra titolo e mostra lunghezza. In questo modo, verrà misurato lo spessore della retina (RT) e la misurazione verrà mostrata in μm. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2 e nella Figura 3.
    4. Usa il righello, misura lo spessore di ogni strato retinico, inclusi ONL, OPL, INL e IPL, ed etichettali. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 4 e nella Figura 5.
    5. Per contare il numero di cellule all'interno del GCL, stabilire una lunghezza predeterminata della retina. Ad esempio, per la retina del topo, utilizzare una sezione da 500 μm e per la retina del ratto, utilizzare cinque sezioni da 100 μm.
    6. Utilizzando il righello, misurare la distanza scelta lungo il GCL. Premere il tasto destro del mouse e selezionare Annota > Salvato > 1x RBC. Fare clic su ciascuna cellula identificata come un corpo rotondo colorato di ematossilina lungo il GCL per la lunghezza predeterminata della retina. Conta il numero di celle cerchiate. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 6 e nella Figura 7.
    7. Dopo aver analizzato tre sezioni consecutive, disegna la media per tutte le misurazioni.

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Risultati

Con l'uso del protocollo presentato, l'anatomia e la morfologia di strutture specifiche del bulbo oculare possono essere valutate in dettaglio. Il nostro team si concentra sulla ricerca dei meccanismi patologici della neurodegenerazione nei disturbi della retina, come il glaucoma, la retinopatia diabetica e la retinopatia ipertensiva. Per valutare le caratteristiche della neurodegenerazione nella retina, abbiamo valutato l'RT (bulbo oculare del topo -Figura 2, bulbo oculare del ratto -

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Discussione

Un esame istologico del bulbo oculare del topo e del ratto è uno strumento potente nel campo dell'oftalmologia sperimentale. Può fornire nuove informazioni relative ai cambiamenti nelle strutture oculari nel corso di malattie oftalmiche, che altrimenti non sarebbero osservati in ambito clinico. I protocolli descritti presentano un metodo semplice per condurre un'analisi istologica della retina. Le sottigliezze della procedura necessaria per elaborare i tessuti anteriori, come la cornea, ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Il lavoro, che include i ratti, è stato finanziato nell'ambito del progetto TIME 2 MUW - teaching excellence as an opportunity for the development of the Medical University of Warsaw cofinanziato dal Fondo Sociale Europeo nell'ambito del Programma Operativo Knowledge Education Development per il periodo 2014-2020, il numero dell'accordo di cofinanziamento: POWR.03.05.00-00-Z040/18-00. Il lavoro, che ha incluso i topi, è stato svolto nell'ambito di un progetto attuato negli anni dal 2020 al 2022, finanziato da una sovvenzione per la scienza ottenuta dall'Università di Medicina di Varsavia.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acetone Chempur 
Dumont Pinzette #5, 11cm, 0,05 x 0,01 mm PunteWorld Precision Instruments14095pinze microchirurgiche piccole
EosinMar-Four4P.05.2001/LSoluzione acquosa
Alcool etilico 96 %Chempur CH.ET. AL.96%CZDA.
Alcool etilico 99,9 %Chempur Ch. ETYL. ALK.99,9%BWUtilizzare per preparare soluzioni al 70% e all'80% di EtOH
Glacier - 86 gradi C Congelatore a bassissima temperatura NU-9483ENuAire13027D0034Temperatura di congelamento - 80 gradi C
VetriniMar-FourMI.15.01673Vetrini in vetro smerigliato con campo opaco su entrambi i lati per la descrizione
Leica CV5030 Vetrino coprioggetti completamente automatizzatoLeica Biosystems 14,04,78,80,101Sigillatrice automatica per vetrini 
Ematossilina di MayerChempur 
Stampi con base in metallo 15 mm x 15 mmLeica Biosystems
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0Microtomo
Lame da barba MicrotomeMar-FourHI. N.35Angolo di taglio 35°
Cassetta per biopsia Micro-TwinMar-FourLN.13874550
Processore di tessuti ibrido a microondeMilestone
Multistainer Leica ST5020Leica Biosystems Coloratore automatico per vetrini 
Scanner per vetrini NanoZoomer 2.0-HTHamamatsuC9600Scanner per vetrini istopatologici
NDP.view2 Software di visualizzazionedelle immagini HamamatsuU12388-01Software di visualizzazione delle immagini
Paraffin Pathowax PlusMar-Four4P. PWP.010Temperatura di fusione 56 ° C - 58 gradi C
ParaformaldeideSigma - Aldrich441244-1KGPreparare una soluzione al 4% in PBS
PBS CompresseMerck Millipore524650-1EAUtilizzare per preparare una soluzione di soluzione salina tampone fosfato, secondo le istruzioni del produttore
Provette per microcentrifuga Pierce, 1,5 mLThermo Scientific69715
Frigorifero-congelatore EN14000AWElectrolux925032562-00refrigerazione 4 gradi C
Lama per bisturiSwann-MortonT.OST. SKAL00.024
SaccarosioChempur 
Forbici a molla SuperCut, 12,5 cm, CurvedWorld Precision Instruments501925Nastro per forbici microchirurgiche curve e piccole
Mar-FourKP-3020/SMRH001
XyleneChempur Ch. KSYL.5l.METAL.OP 
111024800CH1246874023803081427720906

Riferimenti

  1. Kels, B. D., Grzybowski, A., Grant-Kels, J. M. Human ocular anatomy. Clin Dermatol. 33 (2), 140-146 (2015).
  2. Gupta, M. P., Herzlich, A. A., Sauer, T., Chan, C. C. Retinal anatomy and pathology. Dev Ophthalmol. 55, 7-17 (2016).
  3. Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  4. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  5. Boulton, M., Dayhaw-Barker, P. The role of the retinal pigment epithelium: Topographical variation and ageing changes. Eye (Lond). 15 (Pt 3), 384-389 (2001).
  6. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).
  7. Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Chédotal, A. Development of retinal layers. C R Biol. 337 (3), 153-159 (2014).
  8. Adams, T., Chernoff, E., Wilson, J., Dharmarajan, S. Reactive muller glia as potential retinal progenitors. InTech. , (2013).
  9. Salman, A., Mcclements, M. E., Maclaren, R. E. Insights on the regeneration potential of müller glia in the mammalian retina. Cells. 10 (8), 1957(2021).
  10. Marchesi, N., Fahmideh, F., Boschi, F., Pascale, A., Barbieri, A. Ocular neurodegenerative diseases: Interconnection between retina and cortical areas. Cells. 10 (9), 2394(2021).
  11. Enoch, J., Mcdonald, L., Jones, L., Jones, P. R., Crabb, D. P. Evaluating whether sight is the most valued sense. JAMA Ophthalmol. 137 (11), 1317-1320 (2019).
  12. Struebing, F. L., Geisert, E. E. What animal models can tell us about glaucoma. Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 365-380 (2015).
  13. Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609(2012).
  14. Wilding, L. A., Uchihashi, M., Bergin, I. L., Nowland, M. H. Enucleation for treating rodent ocular disease. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (3), 328-332 (2015).
  15. Lin, C. H., et al. A protocol to inject ocular drug implants into mouse eyes. STAR Protoc. 3 (1), 101143(2022).
  16. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in sd-oct imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  17. Castro, G., Navajas, E., Farah, M. E., Maia, M., Rodrigues, E. B. Migration, integration, survival, and differentiation of stem cell-derived neural progenitors in the retina in a pharmacological model of retinal degeneration. ISRN Ophthalmol. 2013, 752161(2013).
  18. Chai, G. R., Liu, S., Yang, H. W., Chen, X. L. Quercetin protects against diabetic retinopathy in rats by inducing heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 16 (7), 1344-1350 (2021).
  19. Igarashi, T., et al. Tyrosine triple mutated aav2-bdnf gene therapy in a rat model of transient iop elevation. Mol Vis. 22, 816-826 (2016).
  20. Zhang, W., et al. Therapeutic efficacy of neural stem cells originating from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in diabetic retinopathy. Sci Rep. 7 (1), 408(2017).
  21. Dorfman, D., Aranda, M. L., Rosenstein, R. E. Enriched environment protects the optic nerve from early diabetes-induced damage in adult rats. PLoS One. 10 (8), e0136637(2015).
  22. Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. J Clin Invest. 102 (4), 783-791 (1998).
  23. Steinle, J. J., Kern, T. S., Thomas, S. A., Mcfadyen-Ketchum, L. S., Smith, C. P. Increased basement membrane thickness, pericyte ghosts, and loss of retinal thickness and cells in dopamine beta hydroxylase knockout mice. Exp Eye Res. 88 (6), 1014-1019 (2009).
  24. Polley, E. H., Walsh, C. A technique for flat embedding and en face sectioning of the mammalian retina for autoradiography. J Neurosci Method. 12 (1), 57-64 (1984).
  25. Turner, K. W. Hematoxylin toluidine blue-phloxinate staining of glycol methacrylate sections of retina and other tissues. Stain Technol. 55 (4), 229-233 (1980).
  26. Cheng, J., et al. Correlation of optical coherence tomography and retinal histology in normal and pro23his retinal degeneration pig. Transl Vis Sci Technol. 7 (6), 18(2018).

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