Articolo metodologico

Metodo di bioprinting ad alta produttività per la modellazione della permeabilità vascolare in piastre standard a sei pozzetti con flessibilità di dimensioni e modelli

DOI:

10.3791/66676

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16 agosto 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Convergence Biosystems Engineering, College of Agriculture and Life Sciences (CALS), Chonnam National University, 2Interdisciplinary Program in IT-Bio Convergence System, Chonnam National University, 3Advanced Bio and Healthcare Materials Research Division, Korea Institute of Materials Science (KIMS), 4Advanced Materials Engineering, Korea National University of Science and Technology (UST)

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un protocollo per la produzione ad alta produttività di canali vascolari con dimensioni flessibili e modelli desiderati su una piastra standard a sei pozzetti utilizzando la tecnologia di bioprinting 3D, denominata vessels-on-a-plate (VOP). Questa piattaforma ha il potenziale per far progredire lo sviluppo di terapie per i disturbi associati all'endotelio compromesso.

Abstract

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La permeabilità vascolare è un fattore chiave nello sviluppo di terapie per i disturbi associati alla compromissione dell'endotelio, come la disfunzione endoteliale nelle arterie coronarie e la compromissione della funzione della barriera emato-encefalica. Le tecniche di fabbricazione esistenti non replicano adeguatamente la variazione geometrica delle reti vascolari nel corpo umano, che influenza sostanzialmente la progressione della malattia; Inoltre, queste tecniche spesso comportano procedure di fabbricazione in più fasi che ostacolano la produzione ad alto rendimento necessaria per i test farmacologici. Questo articolo presenta un protocollo di bioprinting per la creazione di più tessuti vascolari con i modelli e le dimensioni desiderate direttamente su piastre standard a sei pozzetti, superando le sfide esistenti in termini di risoluzione e produttività nella tecnologia di bioprinting. È stato stabilito un approccio di fabbricazione semplificato per costruire sei canali cavi e perfusibili all'interno di un idrogel, che sono stati successivamente rivestiti con cellule endoteliali della vena ombelicale umana per formare un endotelio funzionale e maturo. La natura controllata dal computer della biostampa 3D garantisce un'elevata riproducibilità e richiede meno passaggi di fabbricazione manuale rispetto ai metodi tradizionali. Ciò evidenzia il potenziale di VOP come piattaforma efficiente ad alto rendimento per la modellazione della permeabilità vascolare e l'avanzamento della scoperta di farmaci.

Introduzione

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La rete vascolare in tutto il corpo umano funziona come una barriera di trasporto cruciale regolando dinamicamente lo scambio di molecole e cellule tra il sangue e i tessuti circostanti. Questa regolazione è essenziale per prevenire l'edema tissutale e consentire lo scambio selettivo di nutrienti e cellule, supportando così il metabolismo tissutale e l'omeostasi1. L'alterata permeabilità endoteliale, un fattore in molte condizioni di salute, influisce sia sulla gravità della malattia che sull'efficacia del trattamento2. L'endotelio vascolare funge da barriera selettiva, facilitando il trasferimento tra vasi, tessuti e organi. Questa regolazione coinvolge diversi meccanismi, come il filtraggio di base di soluti e piccole molecole, la rottura intenzionale della barriera vascolare e l'influenza di molecole come le prostaglandine e i fattori di crescita sui livelli di permeabilità3.

I fattori chiave di questa regolazione includono le giunzioni delle cellule endoteliali, la migrazione dei leucociti e la funzionalità della barriera emato-encefalica4. Data la sua complessità, il processo varia tra i diversi ambienti, coinvolgendo vari tipi di vasi sanguigni e utilizzando percorsi anatomici distinti. Comprendere le basi biologiche della permeabilità vascolare è fondamentale per ideare approcci terapeutici per trattare le condizioni associate a una permeabilità vascolare anormale. Il mantenimento della permeabilità vascolare è fondamentale per la salute del sistema vascolare e dei tessuti circostanti; Di conseguenza, la compromissione di questa funzione porta alla disfunzione endoteliale, uno stato in cui l'endotelio perde la sua normale funzionalità.

La disfunzione endoteliale è un precursore di diverse malattie umane prevalenti, tra cui ipertensione, malattia coronarica, diabete e cancro 5,6,7. Questa condizione può presentarsi in diversi modi, tra cui una diminuzione della vasodilatazione, un aumento della permeabilità dei vasi e una tendenza verso uno stato pro-infiammatorio. Questo stato patologico è la fase iniziale di diversi problemi cardiovascolari critici, come la malattia coronarica, l'ictus e l'arteriopatia periferica8, che continuano ad essere le principali cause di mortalità negli Stati Uniti1. La disfunzione endoteliale influisce sulla salute cardiovascolare e sulla barriera emato-encefalica (BEE) e svolge un ruolo importante nella progressione di vari disturbi neurologici. La disfunzione può aumentare la permeabilità della BBB, consentendo così alle tossine, agli agenti patogeni e alle cellule immunitarie di infiltrarsi nel sistema nervoso centrale e contribuendo a disturbi neurologici come ictus, morbo di Alzheimer, sclerosi multipla e infezioni cerebrali9.

La disfunzione endoteliale nel diabete è caratterizzata dalla compromissione della capacità dell'endotelio di regolare il tono vascolare e produrre mediatori vasodilatatori, come l'ossido nitrico, che porta a una compromissione della vasodilatazione10. Questa condizione è esacerbata da vie indotte dall'iperglicemia, come l'attivazione della proteina chinasi C e lo stress ossidativo, che contribuiscono in modo significativo alla progressione della malattia vascolare diabetica11. Inoltre, è stato scoperto che un ambiente infiammatorio migliora l'adesione delle cellule tumorali alle cellule endoteliali microvascolari cerebrali, mentre è stato riportato che un endotelio permeabile è un fattore importante nelle metastasi del cancro12,13. È stato scoperto che la geometria dei vasi sanguigni influenza direttamente le metastasi del cancro al cervello. Le cellule tumorali si attaccano preferenzialmente alle aree di maggiore curvatura dei vasi sanguigni7. Questa scoperta sottolinea l'importanza della geometria vascolare nelle metastasi del cancro. Ancora più importante, in condizioni come la fibrosi e il cancro, l'interruzione della funzione della barriera endoteliale non solo svolge un ruolo nello sviluppo della malattia, ma ostacola anche l'efficacia del trattamento ostacolando un'adeguata somministrazione del farmaco14. La ricerca sulla permeabilità vascolare è fondamentale per far progredire il trattamento delle malattie cardiovascolari e offrire approfondimenti sulla gestione di altre malattie che coinvolgono una funzione vascolare compromessa.

Dato il ruolo cruciale della permeabilità vascolare nella salute e nella malattia, una notevole ricerca si è concentrata sull'esame della natura selettiva della barriera endoteliale per lo sviluppo terapeutico utilizzando modelli animali, accanto alle tradizionali piattaforme di test in vitro 2D e 3D. Tuttavia, i modelli animali hanno limitazioni a causa delle differenze specie-specifiche e delle questioni etiche, oltre che dei costi elevati15,16. Ad esempio, Pfizer, nel 2004, ha dichiarato che negli ultimi 10 anni aveva speso oltre 2 miliardi di dollari per lo sviluppo di farmaci che mostravano effetti promettenti in modelli animali, ma che alla fine hanno fallito nelle fasi avanzate di test sull'uomo17. Inoltre, i modelli 2D tradizionali non imitano accuratamente l'architettura tridimensionale (3D) e la complessa struttura geometrica dei canali vascolari.

Con i progressi nelle tecnologie di biofabbricazione, sono stati compiuti ampi sforzi per fabbricare canali vascolari ricapitolando l'architettura 3D. I canali vascolari su microscala possono essere efficacemente fabbricati all'interno di chip microfluidici utilizzando la litografia morbida, offrendo così un vantaggio dell'analisi in tempo reale18,19. Metodi alternativi, come la colata di idrogel o l'avvolgimento di fogli di celle attorno a uno stampo o a un mandrino, possono essere utilizzati per creare strutture tubolari autoportanti con il diametro desiderato20,21. Tuttavia, questi metodi hanno dei limiti; Ad esempio, i chip microfluidici sono limitati alle configurazioni a microcanali e la colata di idrogel attorno a uno stampo non replica efficacemente più geometrie.

Con l'emergere della tecnologia di bioprinting 3D22, è diventato possibile replicare geometrie complesse depositando con precisione vari materiali idrogel basati su matrice extracellulare (ECM)23,24. Alcuni metodi di bioprinting, come quelli che utilizzano ugelli disposti concentricamente, ad esempio coassiale e triassiale25,26, non possono creare tubi biforcati; Tuttavia, strutture complesse possono essere ottenute con metodi di patterning sacrificale27. Nessuno di questi metodi di bioprinting ha dimostrato di consentire la modellazione in vitro ad alto rendimento, un requisito cruciale per la ricerca farmacologica nella scoperta di farmaci. In questo articolo, presentiamo un metodo per fabbricare in modo efficiente canali vascolari endotelializzati con un controllo efficiente delle dimensioni.

Abbiamo stabilito un approccio semplice utilizzando piastre a sei pozzetti disponibili in commercio, combinate con un metodo di patterning sacrificale in cui un bioprinter fabbrica canali vascolari delle dimensioni e dei pattern desiderati all'interno di un idrogel ECM. Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs) sono state seminate per endotelializzare questi canali e valutare la funzionalità dell'endotelio attraverso un test di permeabilità. Questo design consente la perfusione senza pompaggio creando serbatoi di terreno su entrambi i lati del canale e utilizza il flusso guidato dalla gravità con l'aiuto di un bilanciere 2D comunemente usato per imitare la coltura dinamica. Questo approccio elimina la necessità di pompe peristaltiche e facilita la scalabilità di questa piattaforma per applicazioni ad alta produttività. La natura controllata dal computer della tecnologia di bioprinting 3D semplifica anche il processo di fabbricazione, diminuendo così la probabilità di errori durante la produzione. Il modello VOP si dimostra promettente come strumento prezioso per i test farmacologici nella scoperta di farmaci.

Protocollo

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1. Generazione del G-code per il bioprinter

  1. Per generare e visualizzare il percorso di stampa, visitare uno strumento di simulazione G-code online (ad esempio, NCviewer).
  2. Fare clic sull'icona Nuovo file sull'interfaccia per creare un nuovo file G-code.
  3. Genera un percorso di stampa scrivendo manualmente i comandi G-code per il canale sacrificale e la camera di silicio. Utilizzate le quote di una piastra standard a sei pozzetti come riferimento per la creazione della geometria.
    NOTA: Il codice G utilizzato qui si basa sul codice CNC (Computer Numerical Control). Le funzioni di ciascun comando sono fornite nella tabella supplementare S1. Il formato di piastra a sei pozzetti è stato scelto per la sua compatibilità con i lettori di micropiastre e le configurazioni di microscopia commerciali e per la sua capacità di ospitare volumi adeguati di terreno per supportare la maturazione dell'endotelio, riducendo così al minimo la necessità di frequenti cambi di terreno. Questo protocollo di fabbricazione può anche essere adattato per l'uso con altre piastre a pozzetti standard.
  4. Una volta completato il G-code, fai clic sull'icona Salva file sull'interfaccia per scaricare il file con estensione .nc.
    NOTA: Qualsiasi altro algoritmo di generazione di codice G disponibile può essere utilizzato per generare i percorsi di stampa. La geometria del canale vascolare può essere manipolata in questo codice G.

2. Preparazione degli inchiostri sacrificali e della camera al silicone

NOTA: Le fonti di tutti i materiali utilizzati in questo protocollo sono elencate nella Tabella dei materiali.

  1. Combina due tipi di polimeri siliconici, SE1700 e polidimetilsilossano (PDMS), in un rapporto 10:2. Aggiungere l'agente indurente di ciascun polimero in un rapporto di 10:1, polimero all'agente indurente.
  2. Utilizzare un miscelatore planetario per miscelare e degassare accuratamente la miscela di polimeri a 2.000 giri/min.
  3. Con una spatola, trasferire il polimero siliconico miscelato in una siringa monouso da 10 mL. Centrifugare la siringa caricata a 400 × g per 3 minuti a 5 °C per garantire una consistenza uniforme ed evitare bolle durante la stampa.
    NOTA: L'inchiostro della camera deve essere utilizzato entro 2 ore dall'aggiunta degli agenti indurenti per garantire una qualità di stampa ottimale. Conservare la siringa a 5 °C durante la preparazione per la stampa. Questo processo aiuta a rallentare l'indurimento dell'inchiostro, che altrimenti può alterare i parametri di stampa.
  4. Pesare Pluronic F-127 (PF127) per preparare una soluzione madre al 40% (p/v) di PF127 in acqua distillata.
  5. Miscelare la soluzione PF127 in planetaria per 3 min a 400 × g per ottenere omogeneità. Mantenere la miscela omogeneizzata a 4 °C per la completa dissoluzione di PF127.
  6. Preparare una soluzione madre di trombina di 1.000 unità/mL in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS).
    NOTA: Conservare la soluzione madre di trombina in aliquote da 100 μL per evitare ripetuti cicli di gelo-scongelamento. Le aliquote devono essere conservate a -20 °C per non più di 6 mesi.
  7. Prima di stampare, preparare l'inchiostro sacrificale mescolando la trombina a una diluizione 1:10 con PF127 a una concentrazione di lavoro finale del 36% (p/v) per PF127 e di 100 unità/mL per la trombina. Per preparare 1 mL di inchiostro sacrificale, miscelare 100 μL di soluzione madre di trombina con 900 μL di soluzione madre PF127.
    NOTA: Quando si prepara l'inchiostro sacrificale per la stampa di una singola lastra, un volume totale di 1 ml è più che sufficiente.

3. Processo di fabbricazione

  1. Prima di iniziare il processo di fabbricazione, trattare una piastra a sei pozzetti con plasma di ossigeno (O2) a una potenza di 100 watt per 1 minuto.
  2. Seguire la procedura descritta nella sezione 2 per preparare sia gli inchiostri sacrificali che quelli al silicone, assicurandosi che gli inchiostri siano privi di bolle e miscelati in modo omogeneo per una stampa uniforme. Caricare con cautela gli inchiostri nella testina di stampa della biostampante. Impostare la temperatura della testina della biostampante a 37 °C per l'inchiostro sacrificale e a 5 °C per l'inchiostro siliconico.
  3. Collegare un ugello conico a doppia vite da 22 G alla siringa in silicone. Per l'inchiostro sacrificale, scegliere la dimensione dell'ugello in base al diametro del canale desiderato.
    NOTA: Qui abbiamo dimostrato tre dimensioni di ugelli: 18 G, 20 G e 22 G. I parametri di stampa ottimali, tra cui la pressione di stampa e la velocità della testina di stampa, sono descritti nella Tabella 1.
  4. Caricare il codice G desiderato e premere la funzione servo ready sull'interfaccia software della biostampante per 3 s. Posizionare la lastra sul tavolino al punto di partenza del codice G e fare clic su Avvia per avviare il processo di stampa.
    NOTA: Tipicamente, la fabbricazione di una lastra contenente sei camere richiede circa 1 ora e 10 minuti. La fase 3.4, che prevede il caricamento e l'esecuzione del codice G, è soggetta a variazioni a seconda della specifica biostampante utilizzata. Assicurarsi che vengano mantenute le condizioni di sterilità durante l'utilizzo della biostampante per evitare contaminazioni.
  5. Mettere un coperchio sopra la piastra e trasferire la piastra in un incubatore a CO2 umidificato a 37 °C per 72 ore per polimerizzare le camere di silicio.
    NOTA: Sebbene l'indurimento del silicio possa avvenire a una velocità inferiore all'interno dell'incubatore, la piastra non deve essere posizionata all'interno di un forno asciutto.

4. Preparazione dell'idrogel e inclusione del canale

  1. Preparare una provetta conica da 50 mL contenente 20 mL di 1x PBS. Introdurre 0,01 g di litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP) nella provetta conica per ottenere una soluzione LAP allo 0,05% (p/v). Agitare fino a quando la polvere non è completamente sciolta.
    NOTA: Avvolgere il tubo conico in un foglio per evitare l'esposizione alla luce. Conservare la soluzione madre LAP a 4 °C.
  2. Aggiungere 3 g di gelatina metacrilato (GelMA) e 0,2 g di fibrinogeno a 20 ml di soluzione LAP per ottenere una concentrazione finale del 15% di GelMA e dell'1% di fibrinogeno (indicato come GelFib). Porre la miscela in un bagnomaria a 37 °C e mescolare periodicamente a vortice fino a quando la soluzione non è completamente disciolta.
  3. Dopo la fabbricazione come descritto nella Sezione 3, aggiungere 300 μl di GelFib preriscaldato in ciascuna camera di idrogel per incorporare il modello sacrificale. Reticolare rapidamente il GelMA con la luce ultravioletta (UV) a una lunghezza d'onda di 405 nm con un'intensità di 85 mW/cm2 per 120 s. Ripetere questa procedura per tutti gli altri pozzetti.
    NOTA: Il fibrinogeno si lega rapidamente al contatto con il modello sacrificale contenente trombina. Si consiglia di aggiungere idrogel ed eseguire la reticolazione UV individualmente per ogni pozzetto per evitare la gelificazione indesiderata di GelMA a temperatura ambiente. Inoltre, è necessario mantenere le condizioni sterili per prevenire la contaminazione durante il processo di polimerizzazione UV.
  4. Aggiungere 1 mL di DPBS su ciascun lato del canale vascolare in ciascun pozzetto e mantenere la piastra a 4 °C per 15 minuti per liquefare il PF127.
  5. Dopo 15 minuti, aspirare il DPBS e ripetere il passaggio 4.5 3 volte per il lavaggio completo del PF127.
  6. Prima di introdurre le cellule nei canali, perfondere DMEM F12 contenente l'1% di Matrigel per 30 minuti attraverso i canali per migliorare l'adesione delle cellule.

5. Cultura HUVEC

  1. Preriscaldare il terreno di coltura delle cellule endoteliali (ECGM) in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 minuti.
  2. Nel frattempo, recupera una fiala di HUVEC crioconservati dal serbatoio dell'azoto, allenta delicatamente il tappo della fiala e poi stringila nuovamente per rilasciare l'azoto dai fili. Scongelare immediatamente le cellule immergendo il flaconcino in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 minuti, assicurandosi che all'interno del flaconcino rimanga una piccola quantità di ghiaccio. Sciacquare la fiala con etanolo al 70% per evitare contaminazioni.
    NOTA: Indossare occhiali di sicurezza quando si prelevano le cellule dal serbatoio dell'azoto. Durante questo processo, il tappo del flaconcino deve essere tenuto al di sopra del livello dell'acqua.
  3. Preparare una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di ECGM preriscaldato. Con una micropipetta, trasferire con cura le cellule scongelate dalla fiala alla provetta conica. Per assicurarsi che non rimangano cellule, aggiungere 1 mL di terreno fresco preriscaldato al crioviale, sciacquare l'interno e trasferire le cellule rimanenti nella provetta conica.
  4. Centrifugare la provetta conica a 200 × g per 3 minuti per ottenere un pellet cellulare. Scartare il surnatante, risospendere le cellule in 10 mL di terreno fresco, trasferire le cellule in un pallone T75 e collocare il pallone in un incubatore di CO2 umidificato a 37 °C.
    NOTA: Questo passaggio è importante per rimuovere il dimetilsolfossido presente nel mezzo di congelamento nel crioviale attraverso la centrifugazione.
  5. Rinfrescare il terreno a giorni alterni fino a quando le celle raggiungono l'80-90% di confluenza.

6. Endotelizzazione dei canali

  1. Preriscaldare ECGM, DPBS, soluzione neutralizzante della tripsina e acido etilendiamminotetraacetico (TE) di tripsina in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 minuti.
  2. Alla confluenza del 90%, sciacquare le cellule in un pallone T75 con 10 mL di DPBS, aggiungere 1 mL di TE allo 0,25% al pallone e incubarlo per 3 minuti.
  3. Picchiettare delicatamente i lati del pallone e aggiungere 5 mL di soluzione neutralizzante della tripsina per neutralizzare il TE. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL. Utilizzare 5 ml di ECGM fresco per raccogliere le cellule rimanenti e aggiungerle al tubo conico.
  4. Centrifugare la provetta conica a 250 × g per 3 minuti per raccogliere il pellet della cella.
  5. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di ECGM fresco. Contare le cellule con un emocitometro e ripetere il passaggio 6.4 per ottenere un pellet cellulare. Risospendere 3 milioni di cellule in 90 μL di ECGM fresco.
  6. Prima di introdurre la sospensione cellulare nel canale, aspirare brevemente il canale con il vuoto per liberare il lume.
    NOTA: Evitare l'aspirazione prolungata del canale per evitare di danneggiarne l'integrità.
  7. Caricare delicatamente il canale con una sospensione cellulare a una densità di semina di 0,5 milioni di cellule per pozzetto. Utilizzare una micropipetta per aggiungere ~15 μl di questa sospensione per riempire il canale.
    NOTA: La densità di semina può variare a seconda delle dimensioni del canale. Questa densità è ottimizzata per un canale stampato con un ugello da 20 G e un diametro interno di circa 900 μm.
  8. Posizionare la piastra in piano all'interno dell'incubatrice per 2 ore. Successivamente, capovolgere la piastra a 180°, mantenendola in posizione piana per le successive 2 ore.
  9. Dopo 4 ore, lavare il canale con DPBS per rimuovere le cellule non aderenti e morte. Aggiungere 2 mL di ECGM fresco a ciascun pozzetto (1 mL su ciascun lato del canale). Avvia la coltura dinamica su un bilanciere con un angolo di inclinazione di 10° e 5 giri/min posizionando la piastra sul bilanciere con i canali paralleli alla direzione di oscillazione. Rinfrescare il terreno di coltura a giorni alterni.
    NOTA: La coltura dinamica migliora lo scambio del terreno tra i serbatoi e i canali e aiuta le cellule a proliferare durante la notte.

7. Valutazione della maturazione dell'endotelio

  1. Preriscaldare ECGM e DPBS in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 minuti e il reagente Cell Counting Kit-8 (CCK8) a temperatura ambiente.
  2. Preparare una soluzione di lavoro di CCK8 mescolando 100 μL di reagente CCK8 con 1 mL di ECGM fresco per ogni pozzetto. Mentre si lavora per una piastra/6 canali, preparare 600 μL di reagente CCK8 combinandolo con 6 mL di ECGM fresco.
  3. Rimuovere il terreno di coltura mediante aspirazione e sciacquare i canali con DPBS. Aggiungere 1 mL di soluzione di lavoro CCK8 a ciascun pozzetto e lasciare che la piastra rimanga piatta all'interno dell'incubatore per 30 minuti. Successivamente, avvia la coltura dinamica su un bilanciere come descritto nel passaggio 6.9 e continua questo processo per le prossime 3 ore.
  4. Dopo 3 ore, rimuovere il contenuto da ciascun pozzetto inclinando la piastra su un lato e trasferirlo in una nuova piastra a sei pozzetti. Sciacquare i canali con DPBS e aggiungere terreno fresco.
    NOTA: Coprire la piastra con un foglio di alluminio fino alla misurazione dell'assorbanza. Mantenere un volume di reagente costante in tutti i pozzetti per garantire letture uniformi. Durante il pipettaggio, evitare accuratamente l'introduzione di bolle d'aria, che possono compromettere l'accuratezza delle letture della densità ottica.
  5. Dopo aver agitato delicatamente la lastra per 15 s per garantire una miscelazione uniforme dei colori, utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza a 450 nm.
  6. Ripetere questa procedura a intervalli di tempo predefiniti. Calcola la densità ottica media per ogni punto temporale e traccia una curva di crescita nel software grafico. Questa curva indica la maturazione relativa dell'endotelio nel tempo.

8. Saggio di permeabilità

  1. Rimuovi il terreno da un pozzo di interesse.
    NOTA: Per il test di permeabilità, si consiglia di trattare ciascun pozzetto separatamente per evitare che altri canali si secchino, il che potrebbe alterare la loro permeabilità vascolare.
  2. Preparare 6 mL di soluzione 0,1 mg/mL di destrano coniugato FITC sciogliendo destrano FITC 70 kDa in DPBS.
    NOTA: Preparare una soluzione madre da 20 mg/mL di destrano FITC sciogliendo 100 mg di destrano FITC in 5 mL di DPBS. Dopo aver agitato delicatamente la soluzione, aliquotare 500 μl in provette da 1,5 mL per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. Queste aliquote possono essere conservate a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Prima di eseguire il test, diluire la soluzione madre a una concentrazione di lavoro di 0,1 mg/mL.
  3. Posizionare saldamente la piastra sul tavolino del microscopio e regolare l'ingrandimento dell'obiettivo in modalità contrasto di fase per garantire una chiara visibilità della parete del canale nella regione di interesse, insieme al gel situato nelle vicinanze, all'interno del campo visivo.
    NOTA: Per un'efficace valutazione della permeabilità, cercare di massimizzare l'area del gel che circonda la regione di interesse nel campo visivo; Questo aspetto è fondamentale per un monitoraggio accurato del trasporto del destrano.
  4. Dopo aver messo a fuoco l'area desiderata, passare dalla modalità a contrasto di fase a quella a fluorescenza. Nella scheda di acquisizione dell'immagine , aggiungere FITC nel canale widefield e acquisire un'immagine prima di aggiungere la soluzione di destrano, per calcolare l'intensità della fluorescenza di fondo. Quindi, aggiungere 1 mL di soluzione di lavoro di destrano FITC su un lato del canale e lasciare che la soluzione fluisca verso l'altro lato del pozzetto, spinta dalla differenza di pressione idrostatica.
  5. Acquisisci immagini a intervalli di tempo predeterminati, più frequentemente per i canali con elevata permeabilità e meno frequentemente per quelli con minore permeabilità.

9. Misura dell'intensità della fluorescenza in ImageJ

  1. Nel software di analisi delle immagini ImageJ, misurare l'intensità al punto temporale iniziale (It1), l'intensità media osservata al punto temporale successivo (It2) e l'intensità dovuta al rumore di fondo (Ib), come descritto di seguito. Utilizzare l'equazione (1) per calcolare il coefficiente di permeabilità (Pd). T1 e T2 si riferiscono ai punti temporali iniziale e successivo dell'acquisizione dell'immagine.
    figure-protocol-1(1)
    1. Avviare ImageJ e aprire l'immagine acquisita nel punto temporale iniziale.
    2. Impostare la scala in ImageJ. Passare ad Analizza | Imposta scala. Inserire la scala e l'unità di misura note.
    3. Seleziona lo strumento rettangolo e disegna un rettangolo sull'area del gel in cui è richiesta la misurazione dell'intensità della fluorescenza.
    4. Passare ad Analizza | Impostare le misure e assicurarsi che il valore medio del grigio sia selezionato.
      NOTA: Questa opzione misura l'intensità media all'interno dell'area selezionata. Altri parametri possono essere selezionati in base alle esigenze per l'analisi data.
    5. Con l'area ancora selezionata, vai su Analizza | Misura o semplicemente premi M. Attendi che si apra una finestra dei risultati , che mostri l'intensità media della fluorescenza e tutti gli altri parametri selezionati.
    6. Effettua tre misurazioni e calcola il valore medio dell'intensità della fluorescenza in un foglio di calcolo.
    7. Ripetere questa procedura per le immagini acquisite al successivo punto temporale t2, nonché per quelle acquisite prima dell'aggiunta della soluzione di destrano per il calcolo dell'intensità della fluorescenza al punto temporale successivo, per determinare la fluorescenza di fondo.

Risultati

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La piattaforma VOP, caratterizzata da flessibilità nelle dimensioni e nel modello, è stata realizzata con un sistema di bioprinting multi-testa. I canali, sia cavi che in grado di perfondere, sono stati seminati con HUVEC per facilitare l'endotelizzazione e sono stati successivamente valutati con un test di permeabilità (Figura 1A). Per dimostrare la capacità di produzione multiscala di questo metodo, abbiamo stampato tre configurazioni distinte: diritta, biforcata e contorta (Figura 1B). Attraverso un approccio di fabbricazione semplice, è possibile produrre sei canali vascolari cavi e perfusibili incorporati all'interno di una matrice di idrogel all'interno di una piastra standard a sei pozzetti. Questi canali possono quindi essere endotelializzati con HUVEC (Figura 2A). Le cellule si attaccano e proliferano rapidamente per coprire la superficie luminale del canale vascolare (Figura 2B). Le cellule che aderiscono sia alla superficie luminale inferiore che a quella superiore mostrano una distribuzione uniforme all'interno del lume (Figura supplementare S1).

La lastra è stata posta in un incubatore umidificato per 3 giorni per consentire all'inchiostro siliconico di polimerizzare, assicurando al contempo che il modello sacrificale rimanesse privo di essiccazione (Figura 3A). Per valutare il flusso attraverso questi canali, sono state introdotte microsfere verdi, dimostrando che i canali sono effettivamente perfusibili (Video supplementare S1). Il diametro dei canali è stato variato da 558 ± 38 μm a 1094 ± 45 μm modificando la dimensione dell'ugello da 22 G a 18 G durante la stampa del modello sacrificale. Inoltre, la configurazione geometrica dei canali è stata manipolata modificando il codice G del bioprinter (File supplementare 1) per consentire la stampa di modelli contorti e biforcati (Figura 3B).

La durata della reticolazione con UV è stata ottimizzata a 120 s, il che supporta un'efficace proliferazione cellulare (Figura S2 supplementare). Questa durata della reticolazione ha portato a un ambiente fisiologicamente più rilevante che promuove la proliferazione delle cellule endoteliali, probabilmente a causa delle proprietà meccaniche bilanciate e della porosità dell'idrogel, facilitando un migliore legame cellulare e la successiva proliferazione. Gli HUVEC hanno proliferato efficacemente sulla superficie luminale e hanno mostrato una morfologia simile a un ciottolo entro il giorno 5 dopo la semina. La maturazione dell'endotelio è stata valutata con il test CCK8 condotto nei giorni 1, 3 e 5 (Figura 4A, B). La maturazione dell'endotelio è stata verificata mediante immunocolorazione per CD31 5 giorni dopo la semina cellulare, che ha dimostrato la localizzazione di CD31 nelle giunzioni strette (Figura 4D).

Per valutare la funzione barriera dell'endotelio, abbiamo perfuso una soluzione di destrano 70 kDa attraverso i canali il giorno 5 di maturazione. Per il confronto, è stato selezionato un canale di controllo senza endotelio (nudo). Il canale endotelizzato ha mostrato cambiamenti minimi nella fluorescenza all'interno della regione del gel perivascolare nel tempo, suggerendo così che l'endotelio ha mantenuto efficacemente la sua funzione di barriera. Tuttavia, i canali nudi hanno mostrato un aumento della fluorescenza nella regione del gel perivascolare, indicando così una maggiore permeabilità dovuta all'assenza di endotelio (Figura 4C e Figura 4E).

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Figura 1: Preparazione dei canali vascolari stampati e loro configurazioni. (A) Schema di fabbricazione, endotelizzazione e saggio di permeabilità dei canali vascolari stampati. (B) Schema delle tre configurazioni dimostrate in questo metodo: diritta, biforcata e contorta. Abbreviazione: VOPs = recipienti su un piatto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Cronologia di fabbricazione per la stampa del modello sacrificale e della camera di silicio, nonché l'endotelizzazione del canale vascolare. (A) L'illustrazione rappresenta un singolo pozzetto della piastra del pozzetto e AA' si riferisce alla vista lungo il piano della sezione trasversale. (B) Immagini rappresentative delle fasi coinvolte nel processo di fabbricazione. Barre della scala = 5 mm (B1), 200 μm (B2-4). Abbreviazioni: GelFib = 15% di metacrilato di gelatina e 1% di fibrinogeno in soluzione di fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato allo 0,05% p/v; HUVEC = Cellule endoteliali della vena ombelicale umana. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Recipienti su una lastra. (A) Immagine grossolana di recipienti su una lastra dopo la stampa del modello sacrificale e della camera di silicone. (B) Dimostrazione della fabbricazione multiscala di canali vascolari con una varietà di configurazioni e dimensioni, perfusi con microsfere verdi. Barre di scala = 200 μm (canali rettilinei), 1.000 μm (canali contorti e biforcati). Abbreviazioni: ID = diametro interno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Canali vascolari e loro maturazione e permeabilità endoteliale. (A) Immagini al microscopio a fluorescenza dei canali vascolari ai giorni 1, 3 e 5 dopo la semina con HUVEC marcati con proteine fluorescenti verdi, che mostrano la proliferazione e la morfologia dei ciottoli degli HUVEC al giorno 5. (B) La maturazione endoteliale è stata valutata con il test CCK-8 ai giorni 1, 3 e 5 dopo la semina cellulare. (C) Saggio di permeabilità dei canali vascolari endotelializzati (endotelio +) e nudi (endotelio -). (D) Immagini rappresentative della colorazione di CD31 illustrano la localizzazione di CD31 in corrispondenza di giunzioni strette il giorno 5. (E) Quantificazione della permeabilità diffusionale. Barre di scala = 200 μm (A, C, D). Abbreviazioni: HUVECs = Cellule endoteliali della vena ombelicale umana; GFP = proteina fluorescente verde; GFP HUVEC = HUVEC con tag GFP; CCK-8 = kit conteggio cellule 8; DAPI = 4'6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Inchiostro da stampaParametri di stampa
Calibro dell'ugelloTemperatura (°C)Pressione atmosferica (kPa)Velocità della testa (mm/min)
Inchiostro sacrificale183740-48200
20
22
Inchiostro siliconico225100

Tabella 1: Parametri di stampa per gli inchiostri sacrificali e siliconici.

File supplementare 1: script G-Code contenente i comandi per la stampa 3D del modello sacrificale e della camera di silicio all'interno di una piastra a sei pozzetti. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura S1 supplementare: Immagini rappresentative della superficie luminale inferiore e superiore dopo la semina cellulare che mostrano l'attacco GFP-HUVEC sia sul piano focale inferiore che su quello superiore. Barre di scala = 200 μm. Abbreviazioni: UU' = piano focale superiore; LL' = piano focale inferiore. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Proliferazione di GFP-HUVEC in diverse durate di reticolazione con UV (405 nm). Barre di scala = 200 μm. Abbreviazioni: HUVECs = Cellule endoteliali della vena ombelicale umana; GFP = proteina fluorescente verde; GFP HUVEC = HUVEC con tag GFP. Clicca qui per scaricare questo file.

Video supplementare S1: Perfusione con microsfere verdi che mostrano l'effettiva perfusione attraverso i canali rettilinei, contorti e biforcati. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S1: Funzioni dei comandi G-code e M-code. NOTA: Nel codice G, X, Y e Z indicano le coordinate per il movimento lungo l'asse X, l'asse Y e l'asse Z, rispettivamente. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

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Sfruttando la precisione, l'automazione e la natura controllata da computer della tecnologia di bioprinting 3D, abbiamo stabilito un metodo semplificato per la fabbricazione di canali vascolari in piastre standard a sei pozzetti, che sono state scelte per la loro compatibilità con i lettori di micropiastre commerciali e le configurazioni di imaging per microscopi. Il design della piastra può ospitare canali di più dimensioni e un volume sufficiente di fluidi per la crescita di canali più grandi, riducendo al contempo la frequenza necessaria di cambi di fluidi. I futuri adattamenti di questo progetto potrebbero essere adattati ad altre piastre standard disponibili in commercio, aumentando così la produttività sperimentale e diminuendo l'uso di materiali.

Le piattaforme microfluidiche utilizzano spesso un polimero siliconico chiamato PDMS a causa della sua atossicità, permeabilità ai gas e alta trasparenza28. Tuttavia, la bassa fedeltà di forma del PDMS ne limita l'uso nella biostampa basata sulla microestrusione per la fabbricazione di chip con un'elevata fedeltà di forma. SE170029, un altro polimero siliconico, offre una maggiore precisione nella costruzione di camere per la fabbricazione di tessuti, ma la sua elevata viscosità richiede ugelli più grandi e una notevole pressione pneumatica. Abbiamo formulato una miscela di SE1700 e PDMS che può essere utilizzata con ugelli più piccoli, consentendo così la fabbricazione in aree ristrette con elevata precisione e fedeltà delle forme. Altri tipi di polimeri, come il policaprolattone (PCL) o l'acetato di polietilene vinilico (PEVA), possono essere impiegati anche per la stampa in camera considerando la loro elevata fedeltà di forma30.

Fondamentale è anche la trasparenza ottica di GelMA31. A differenza di altri idrogel basati sulla ECM, come il collagene, che diventa opaco dopo la reticolazione, GelMA mantiene la trasparenza, consentendo così l'analisi cellulare in tempo reale all'interno dei canali, anche all'aumentare delle dimensioni del canale. Questo aspetto fornisce un grande vantaggio rispetto ai metodi che richiedono sezioni sottili per l'osservazione quando la dimensione del costrutto è aumentata32. La biodegradabilità di GelMA facilita la sostituzione dell'impalcatura ECM con nuovo tessuto funzionale durante la disintegrazione, fornendo così lo spazio necessario per la crescita del tessuto funzionale di nuova formazione33,34. Inoltre, la sua comprovata bassa citotossicità lo rende altamente adatto per applicazioni di ingegneria tissutale35,36. Le eccellenti caratteristiche meccaniche di GelMA lo rendono un buon candidato per applicazioni nell'ingegneria dei tessuti vascolari37. La sua efficacia nel facilitare l'endotelizzazione dei condotti vascolari con gli HUVEC è stata ben documentata38.

Le cellule utilizzate per l'endotelizzazione in questo studio, le HUVEC, mostrano un alto tasso di successo nell'isolamento e sono un modello eccezionale per esaminare un'ampia gamma di malattie cardiovascolari e metaboliche39. Tuttavia, questo approccio può essere adattato per adattarsi a diversi tipi di cellule endoteliali, comprese quelle derivate dalle arterie o direttamente dai pazienti. Questa adattabilità consente la creazione di modelli di tessuto vascolare specifici per il paziente, facilitando la valutazione delle risposte individuali a farmaci specifici.

Questo protocollo prevede alcuni passaggi critici da tenere a mente per i lettori. In primo luogo, il trattamento al plasma è fondamentale per modificare le caratteristiche superficiali della piastra, in particolare per migliorare l'idrofilia, perché la maggior parte delle piastre a pozzetti commerciali sono idrofobiche. Il trattamento al plasma introduce gruppi funzionali polari sulla superficie, migliorando così la capacità di legame con la camera di silicio e l'idrogel. In secondo luogo, il controllo della temperatura è fondamentale perché l'inchiostro sacrificale si liquefa a temperature più basse e l'inchiostro siliconico richiede temperature più basse per prevenire l'indurimento prematuro, che può impedire l'estrusione dell'inchiostro attraverso l'ugello. In terzo luogo, la rimozione completa di tutte le tracce di PF127 è fondamentale perché qualsiasi residuo di PF127 può influenzare negativamente i processi cellulari, ad esempio interferendo con l'adesione cellulare40. In quarto luogo, durante la coltura cellulare, se le cellule crescono fino a una confluenza superiore al 90%, possono sperimentare stress a causa della competizione per lo spazio e i nutrienti. Questo stress può provocare un comportamento cellulare alterato, una diminuzione della vitalità cellulare e modifiche al microambiente cellulare. Per mantenere la salute delle cellule e una corretta proliferazione, si raccomanda di mantenere le colture al di sotto della confluenza del 90%. In quinto luogo, è importante mantenere la piastra piatta all'interno dell'incubatrice prima e dopo l'inversione per ottenere un'adesione cellulare uniforme all'interno del canale e, in ultima analisi, un'endotelizzazione uniforme. Infine, mantenere costanti il tempo di esposizione, l'intensità del laser di eccitazione e la messa a fuoco del microscopio sono fondamentali durante l'acquisizione dell'immagine, perché le variazioni di questi parametri potrebbero modificare l'intensità del segnale di emissione, influenzando così potenzialmente l'accuratezza dei risultati.

Il nostro approccio consente la creazione di canali in più configurazioni, come i modelli rettilinei, biforcati e contorti qui dimostrati. Questa adattabilità è essenziale per replicare le diverse geometrie della rete vascolare nel corpo umano e supera le capacità dei metodi tradizionali, come la colata di idrogel attorno a uno stampo o le tecniche di bioprinting basate su ugelli concentrici utilizzate per strutture tubolari 30,41,42. Tuttavia, una limitazione di questo metodo è che non garantisce la circolarità dei canali perché il modello sacrificale è disposto su una superficie piana.

Il vantaggio di costruire canali di più dimensioni è la chiave per superare i limiti delle piattaforme microfluidiche, che sono spesso limitate ai microcanali. Questa restrizione può essere uno svantaggio nei saggi biochimici convenzionali. Ad esempio, per ottenere materiale sufficiente per i saggi standard di espressione proteica come il western blotting, è necessario combinare i risultati di diversi dispositivi microfluidici. Inoltre, quando vengono creati canali cavi, l'idrogel deve mantenere una rigidità sufficiente per sopportare il processo di rimozione dell'ago. Il nostro approccio utilizza un materiale sacrificale termoreversibile, che diventa liquido quando la temperatura viene diminuita, facilitando così questo processo senza danneggiare l'integrità del gel. Inoltre, in questo metodo possono essere utilizzati anche altri materiali gelificanti termoreversibili, come la gelatina43.

Questo approccio consente una facile personalizzazione delle strutture tissutali sulla piastra, fornendo così uno strumento promettente per i test farmacologici nella scoperta di farmaci. Questo metodo può facilitare lo screening dei farmaci valutando i loro effetti sulla permeabilità vascolare, un fattore chiave nello sviluppo di terapie per le malattie associate alla disfunzione vascolare. Il nostro modello può essere utilizzato per studiare la permeabilità vascolare in condizioni specifiche, come l'infiammazione, e per sviluppare strategie per la normalizzazione vascolare, che è rilevante per il trattamento di varie malattie che coinvolgono una permeabilità vascolare anormale44, per far progredire la comprensione di questo processo e per sviluppare potenziali applicazioni cliniche45.

Per valutare la permeabilità vascolare, abbiamo perfuso 70 kDa destrano attraverso il canale vascolare. Tipicamente, un endotelio vascolare sano funge da barriera efficace alle molecole di destrano di questo peso molecolare46. Tuttavia, in presenza di infiammazione, si verifica la rottura delle giunzioni strette, consentendo a queste molecole di fuoriuscire, aumentando così la permeabilità vascolare30. Inoltre, il destrano marcato con fluorescenza viene utilizzato per valutare la distribuzione dei farmaci all'interno dei tessuti ingegnerizzati47. Sebbene il flusso bidirezionale e la dinamica di tracimazione a controllo limitato all'interno del canale siano limitazioni di questo modello, prevediamo che gli utenti finali saranno in grado di adattare il sistema in base alle loro esigenze utilizzando bilancieri personalizzati per controllare la dinamica del flusso all'interno dei canali. Questo adattamento può includere l'implementazione del flusso unidirezionale senza pompa48.

In futuro, questo metodo di fabbricazione potrebbe essere ampliato per costruire tessuti complessi. Posizionando con precisione altri tipi di cellule vicino ai canali vascolari, è stato possibile creare tessuti perfusibili e vascolarizzati, superando così una sfida importante nella biostampa di tessuti volumetrici. Riteniamo inoltre che questo metodo possa essere adattato per simulare altri tipi di tessuti cavi e perfusibili, come i vasi linfatici e l'intestino, in modo ad alto rendimento per una varietà di applicazioni biomediche.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziate dal governo coreano (Ministero della Scienza e delle TIC, MSIT) [No. NRF-2019R1C1C1009606; n. 2020R1A5A8018367; e n. RS-2024-00423107]. Questa ricerca è stata supportata dal Programma di Sviluppo delle Tecnologie Bio e Mediche delle sovvenzioni NRF finanziate dal MSIT [No. NRF-2022M3A9E4017151 e n. NRF-2022M3A9E4082654]. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Innovazione Tecnologica [n. 20015148] e dal Progetto Alchimista [n. 20012378] finanziato dal Ministero del Commercio, dell'Industria e dell'Energia (MOTIE, Corea). Questo lavoro è stato sostenuto anche dal Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture and Forestry (IPET) attraverso l'Agriculture and Food Convergence Technologies Program for Research Manpower development, finanziato dal Ministero dell'Agricoltura, dell'Alimentazione e degli Affari Rurali (MAFRA) [No. RS-2024-00397026].

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pipetta sierologica da 10 mLSPL SPL91010
Siringa da 10 mL Shinchang Medical
15 mL provetta conicaSPL50015
Bioprinter 3D T& R Biofab3DX-Printer
Piastra a 6 pozzetti SPL37206
Cabine di sicurezza biologicaCHC LABPCHC-777A2-04, 
Microscopi invertiti in campo chiaro KitLeicaDMi1
(CCK8)GlpBioGK10001
(CCK8)Pallone per colture cellulari GlpBioGK10001
75TSPL70075
Corning Matrigel Matrice a membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR), senza LDEV, 10 mLCorning354230
Acqua
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO, grado di coltura cellulareSigma aldrichD2438
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a KitDOWDC-184
DOWSIL SE 1700 trasparente con C 1,1 KG Kit.DOW2924404
D-PBS - 1xWelgeneLB001-01
Terreno di crescita delle cellule endoteliali MV 2 (Pronto all'uso)PromocellC-22022
Eppendorf Micro pipetta(1000,200,100,20,10)eppendorf
Alcool etilico 99,9%DuksanD5
ExcelMicrosoft
Fibrinogeno da plasma bovinoSigma AldrichF8630-1G
FITC destrano 70 kDaSigma Aldrich46945-100MG-F
Perle fluorescenti (1.0 μ m, verde)Sigma AldrichL1030-1ML
GelMA-polvere (Gelatina metacrilato) 50 gMateriali 3D 20JT29
Gibco, Terreno di congelamento per colture cellulari di recupero, 50 mLGibco
HUVECs (Human Umbillical Vein Endothelial Cells)Software Promocell
ImageJNIH
ThermoSCIENTIFICForma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubatore
Invitrogen, Kit di vitalità/citotossicità vivo/morto (per cellule di mammifero)Thermo FisherL3224
Litio fenile (2,4,6-trimetilbenzoil) fosfato in polvere Tokoyo Chemical Industry CO.85073-19-4 
Marienfeld Superior, coperchio della camera di conteggioMarienfeld Superior
Marienfeld Superior, emocitometro, camera di conteggio delle celluleMarienfeld SuperiorHSU-0650030
MicrocentrifugaeppendorfCentrifuge 5920 R
NCViewer.com
Serbatoio di azotoWORTHINGTON INDUSTRIESLS750
Laser UV OmnicureEXCELITASSERIES 1500
Parafilm MamcorPM-996
Soluzione di penicillina-streptomicina (100x)GenDEPOTCA005-010
Miscelatore planetarioTHINKY CORPORATION, giapponeARE-310
Macchina per il trattamento al plasmaFEMTO SCIENCECUTE-1MPR
Pluronic F-127Sigma aldrichP2443-250G
Tampone preconfezionato, (P2007-1) 10x PBSBiosesangPR4007-100-00
Armadio per la conservazione dei reagentiZIO FILTER TECHSC2-30F-1306D1-BC
Microscopio per imaging di cellule vive in tempo realeCarl ZEISS
SAMSUNGRT50K6035SL
ROCKER 2D digitaleIKA4003000
Scoop-SpatolaCacheBySL-SCO7001-EA
sigma, tripsina-EDTA solizione, 0,25%Sigma aldrichT4049-100ML
Sodio Dodecil Solfato (SDS)Thermo Fisher scientific151-21-3
Siringa Cilindro Punta TappoFISNAR3051806
TallyCounter Control Company  C23-147-050
Ugello conico (18 G)MushashiTPND-18G-U
Ugello conico (22 G)MushashiTPND-22G-U
Ugello conico 20 GMusashiTPND-20G-U
Trombina da plasma bovinoSigma AldrichT7326-1KU
Timer, ETL SL a 4 canali. Tim3005
Soluzione di Trypan Blue 0,4%Gibco15250061
Soluzione neutralizzante della tripsinaPromocellC-41120
UG Barattolo di unguento UG da 24 mLYamayuNo. 3-53
UG 58 mL Barattolo di unguento UGYamayuNo. 3-55
BagnomariaDAIHAN ScientificWB-11
Macchina per pesiSartoriusbce2241-1skr
per il conteggio delle cellule Kit per il conteggio delle cellule distillata Incubatore Frigorifero

Riferimenti

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