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Articolo metodologico

MiR-15a esosomico derivato dalla lacrima come nuovo strumento diagnostico per la retinopatia diabetica

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DOI:

10.3791/66687

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30 dicembre 2025

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1UM Eye Research Centre (UMERC), Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya, 2Department of Ophthalmology, Universiti Malaya Medical Centre, 3Department of Anaesthesiology and Department of Pathology, Johns Hopkins School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive un protocollo per la raccolta e la rilevazione di miR-15a dalle lacerazioni come nuovo strumento diagnostico per la retinopatia diabetica.

Abstract

La retinopatia diabetica (DR) è una delle principali complicazioni del diabete mellito, che colpisce una percentuale significativa della popolazione diabetica. La diagnosi e l'intervento precoce sono fondamentali per prevenire una perdita irreversibile della vista. I metodi diagnostici attuali, sebbene efficaci, presentano dei limiti. Il miRNA, un piccolo RNA non codificante che inibisce la stabilità e/o la traduzione di un mRNA legandosi alle regioni 3'-non tradotte (3'-UTR) degli mRNA target, è stato sempre più riconosciuto come significativamente associato al diabete e può essere ottenuto dalle lacerazioni. Questo studio ha indagato il potenziale miR-15a esosomale derivato dal liquido lacrimale come nuovo marcatore diagnostico per la DR. Sono stati prelevati campioni lacrimali da 135 pazienti diabetici (36 con retinopatia diabetica [DR] e 50 senza DR) e 49 controlli sani. Gli esosomi sono stati isolati e i livelli di espressione di miR-15a esosomico sono stati misurati tramite PCR digitale a gocce (ddPCR). I risultati hanno mostrato che l'espressione esosomica di miR-15a è stata alterata nei pazienti diabetici e con DR rispetto agli individui sani. Questi risultati indicano che il miR-15a esosomale derivato dal liquido lacrimale potrebbe avere un ruolo nei meccanismi molecolari alla base del diabete e nelle sue complicazioni. Inoltre, ha potenziale come biomarcatore diagnostico non invasivo e affidabile per la retinopatia diabetica, offrendo alta sensibilità e specificità.

Introduzione

La retinopatia diabetica (DR) è una delle complicazioni microvascolari più evidenti del diabete, minacciando la vista di milioni di persone in tutto il mondo. La prevalenza globale della DR dai dati demografici dell'IDP Atlas 2019 è stata stimata al 22,7% dell'intera popolazione diabetica a livello mondiale, con il numero di nuovi casi in continua crescita, in particolare nei paesi sviluppati e in viadi sviluppo 1. Clinicamente, la DR è caratterizzata da DR in fase iniziale o retinopatia diabetica non proliferativa (NPDR), DR in stadio avanzato o retinopatia diabetica proliferativa (PDR), e la presenza di edema maculare. L'aumento della permeabilità vascolare e l'ostruzione dei capillari sono due cambiamenti patologici comuni osservati nella NPDR, mentre una neovascolarizzazione anomala dell'iride, della macula, del disco ottico o della retina si osserva nel caso dellaPDR 2,3. La progressione verso la PDR, che potrebbe potenzialmente causare emorragie vitree e distacco di retina, può causare un significativo deficitvisivo 3. In tutti i casi, i cambiamenti patologici possono essere rilevati tramite funduscopia o esame fotografico del fondo da parte di oculistiqualificati. Utilizzando il metodo standard della fotografia del fondo di fondo, la retinopatia diabetica può essere rilevata con sensibilità del 78%-96% e specificità86%-97% 5. Tuttavia, questo metodo rileva solo una volta che si sono verificati danni alla retina. Esiste una necessità insoddisfatta di una diagnosi precoce della DR prima dell'insorgenza di segni retinici clinicamente visibili, come emorragie da blot, microaneurismi, essudati e proliferazione di nuovi vasi.

L'avanzamento degli strumenti molecolari portò alla scoperta degli esosomi come potenziale strumento diagnostico per varie malattie, tra cui il cancro e le malattiecardiovascolari 6,7. Gli esosomi sono particelle nanodimensionate legate da una membrana a doppio strato lipidico secreta dalla maggior parte delle cellule nel loro spazio vescicole extracellulari (EV). Questi esosomi possono essere trasportati tramite biofluidi come sangue, lacrime, saliva e urina, rendendoli facilmente accessibili per procedure diagnostiche non invasive o minimamenteinvasive 8. Portano vari marcatori cellulari di origine che includono proteine, lipidi e acidi nucleici. Di particolare interesse sono i piccoli RNA non codificanti trasportati all'interno dei veicoli elettrici. Sebbene questi RNA non siano codificati per proteine, svolgono ruoli fondamentali nella regolazione genica e sono stati implicati in molti processi fisiologici e patologici, inclusi i β pancreatici, che sono di grande importanza nello sviluppo deldiabete 9,10.

In particolare, è stato dimostrato che miR-15a ha una forte associazione con lo sviluppo del diabete, principalmente attraverso la regolazione della produzione di insulina e delle funzioni delle cellule betapancreatiche 11. Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato che miR-15a è alterato nel plasma della retinopatia diabetica. Inoltre, è stato dimostrato che il miR-15a viene anche secreto dalle cellule beta pancreatiche, e viaggia attraverso il flusso sanguigno fino allaretina 12. Il liquido lacrimale è considerato un fluido facilmente reperibile, facilmente reperibile dall'occhio in modo non invasivo edeconomico 13. Contiene una miscela di varie proteine, lipidi, elettroliti e altre molecole, che riflette lo stato fisiologico della superficie oculare e dei tessuti circostanti, inclusa laretina 14. Un numero maggiore di miRNA è stato rilevato nel liquido lacrimale rispetto a quella in siero e nella soluzione dell'umoreacquoso 15,16. La composizione della lacrima cambia in risposta a varie condizioni sistemiche, incluso ildiabete 17. Infatti, l'analisi del liquido lacrimale ha dimostrato un potenziale promettente per il monitoraggio e la diagnosi di altre malattie non legate agli occhi come la sclerosi multipla e il cancro alseno 18,19. Con il legame diretto della retinopatia diabetica con l'occhio, sarebbe più rilevante cercare potenziali proprietà diagnostiche del liquido lacrimale in questa malattia. Sono stati osservati cambiamenti nei livelli di IL-1RA, IL-8, IL-6 e TNF-α nei fluidi lacrimali dei pazienti con retinopatia diabetica, che variano anch'essi in base alla gravità dellamalattia. Rispetto all'esame tradizionale per la funduscopia, l'analisi del liquido lacrimale per la retinopatia diabetica offre potenziali vantaggi in termini di accessibilità, non invasività e specificità, permettendo una diagnosi precoce prima dell'insorgenza dellamalattia 22.

Pertanto, l'obiettivo principale di questo studio è indagare il potenziale del miR-15a esosomico derivato dal liquido lacrimale come nuovo marcatore diagnostico per la retinopatia diabetica tramite isolamento e quantificazione dei miRNA dai fluidi lacrimali della popolazione diabetica con retinopatia. Con questo, esisterebbe un nuovo metodo di rilevamento della retinopatia diabetica tramite lo screening del liquido lacrimale, rilevabile anche prima dell'insorgenza delle complicazioni retiniche, consentendo misure preventive o terapeutiche precoce.

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Protocollo

Lo studio è stato condotto con l'approvazione del Comitato Etico della Ricerca Medica dell'Università del Centro Medico Malaya (Numero di riferimento: 20165-2446). Il consenso scritto di tutti i soggetti umani è stato ottenuto prima del reclutamento. In totale, sono stati inclusi 135 soggetti tra i pazienti che frequentavano la clinica di oftalmologia presso l'Universiti Malaya Medical Centre (UMMC), Kuala Lumpur. I criteri di inclusione includevano pazienti che ricevevano servizi sotto UMMC e avevano un'età compresa tra i 20 e gli 80 anni. I pazienti sottoposti a trattamento attivo con insulina, con una storia di trattamento laser o anti-VEGF negli ultimi 3 mesi, o che assumevano regolarmente antipiastrine o anticoagulanti, sono stati esclusi dallo studio. I soggetti sono stati poi divisi in tre gruppi: (1) controllo sano (Controllo), (2) diabetico senza retinopatia (DM No DR) e (3) diabetico con retinopatia (DR). Un riassunto del protocollo è fornito nella Figura 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

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Figura 1: Panoramica del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione dei materiali    

  1. Disponi un set di medicazione sterile di base contenente due pinze, sei palline di cotone, quattro garze, un vassoio e una borsa per i rischi biologici.
  2. Versa 5 mL di soluzione di irrigazione al cloruro di sodio allo 0,9% w/v in una teglia.
  3. Apri una confezione di salviette per le palpebre e mettila sul campo sterile.
  4. Prepara un tubetto contenente 250 μL di soluzione conservante.
  5. Piega una striscia di Schirmer a livello del cuneo mentre è ancora nel suo imballaggio prima di posizionare la striscia sterile sul campo sterile.
  6. Indossa i guanti chirurgici in modo asettico.
  7. Usando una pinza sterile, inumidisce i batuffoli di cotone con soluzione di irrigazione al cloruro di sodio sterile allo 0,9% w/v.

2. Preparazione dei soggetti umani    

  1. Lascia che il soggetto si sieda comodamente e chiedi di chiudere gli occhi.
  2. Asciuga la pelle periorbitale quattro volte usando palline di cotone imbevute in una soluzione irrigativa.
  3. Asciuga la pelle periorbitale con una salvietta per le palpebre.

3. Raccolta del liquido lacrimale umano

  1. Raccogliere i fluidi lacrimali utilizzando la striscia di Schirmers posizionata sul fornice temporale inferiore.
  2. Quando si posiziona la striscia parzialmente piegata sull'occhio destro, chiedi al soggetto di guardare a sinistra. Abbassa la palpebra inferiore per esporre il fornice inferiore.
  3. Utilizzando una coppia di pinze sterili, posiziona una striscia di Schirmer sui due terzi esterni del fornice congiuntivale inferiore. Evita che la striscia tocchi la pelle per evitare che il campione contamini con sudore o altri materiali sulla pelle.
  4. Metti una garza sotto la striscia per evitare il contatto con la pelle.
  5. Lascia che le lacrime vengano assorbite nella striscia fino al limite dei 20 mm o al massimo 5 minuti, a seconda di quale caso venga il primo.
  6. Se il livello di 20 mm non viene raggiunto, documentare il livello delle lacerazioni basandosi sulle marcature per consentire la standardizzazione del volume del fluido lacrimale.
  7. Utilizzando una coppia di pinze sterili, rimuovi con cura la striscia di Schirmer e inserisci la striscia in un tubo contenente 1x soluzione salina fosfato tamponante (PBS).
  8. Metti il tubo in una cella frigorifero per il trasporto al laboratorio.
  9. Pulisci la superficie periorbitale rimuovendo eventuali residui sulla pelle.

4. Pre-trattamento dei campioni di lacrima    

  1. Vortex, il tubo contenente la striscia di Schirmer immerso in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente.
  2. Agita il tubo su un dondolo per 5 minuti a temperatura ambiente.
  3. Centrifuga il tubo a 2000 x g per 15 minuti a 4 °C.
  4. Trasferisci la soluzione in un nuovo tube, etichetta e mantienilo a -80 °C fino al processo a valle.
  5. Scarta la striscia rimanente.

5. Isolamento dell'esosoma

NOTA: L'isolamento dell'RNA viene eseguito utilizzando un kit disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei Materiali).

  1. Scongela la soluzione lacrimale sul ghiaccio per 10 minuti.
  2. Bilancia la colonna di rotazione per 15 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso.
  3. Rimuovi l'uscita inferiore della colonna e posizionala sulla piastra di raccolta dei rifiuti fornita.
  4. Rimuovi il tappetino di sigillatura superiore e lascia che il buffer di stoccaggio passi attraverso la colonna tramite forza gravitazionale.
  5. Aggiungi 250 μL di PBS e lascia che passi attraverso la colonna.
  6. Ripeti il passo 5.5.
  7. Applicare un campione da 110 μL in cima a ogni colonna e lasciare che il campione entri nella colonna.
  8. Trasferire la colonna su una piastra di raccolta del campione fornita.
  9. Aggiungi 100 μL di PBS e lascia che passi attraverso la colonna nella piastra di raccolta del campione.
  10. Trasferire la colonna sulla piastra di raccolta rifiuti.
  11. Aggiungi 4x PBS da 200 μL alla colonna e lascia che entri nella colonna per rimuovere la frazione di proteine libere dal primo carico.
  12. Aggiungi 110 μL di campione nella colonna. Permette di entrare nella colonna.
  13. Posiziona la colonna su un piatto di raccolta campioni. Aggiungi 100 μL di PBS e lascia che passi attraverso la colonna.
  14. Centrifuga brevemente la piastra di raccolta del campione a 100 x g per 30 secondi. Gli esosomi isolati sono ora pronti per l'isolamento dell'RNA.

6. Isolamento dell'RNA

NOTA: L'isolamento dell'RNA viene eseguito utilizzando un kit disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei Materiali).

  1. Soggetto 200 μL degli esosomi isolati all'isolamento dell'RNA.
  2. Aggiungere 60 μL di buffer di lisi agli esosomi isolati. Vortice per 5 secondi.
  3. Incubare a temperatura ambiente per 3 minuti.
  4. Aggiungi 20 μL di tampone inibitore di precipitazione, fai il vortice per 20 secondi e incuba a temperatura ambiente per 3 minuti.
  5. Centrifuga a 12.000 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
  6. Trasferisci il sovrantato trasparente e incolore in un nuovo tubo.
  7. Aggiungi 1 volume di isopropanolo.
  8. Vortice per 5 secondi e trasferisci la soluzione alla mini colonna di spin fornita nel kit.
  9. Centrifuga a temperatura ambiente per 15 secondi a 8000 x g. Scartare il flusso attraverso.
  10. Lavare la colonna con 700 μL di tampone di lavaggio RWT.
  11. Centrifuga per 15 secondi a 8000 x g. Scartare il flowthrough.
  12. Lava la colonna con 500 μL di tampone di lavaggio RPE.
  13. Centrifuga per 15 secondi a 8000 x g. Scartare il flowthrough.
  14. Aggiungi 500 μL di etanolo all'80% alla mini colonna di spin del campione.
  15. Centrifuga per 2 minuti a 8000 x g. Scartare il flusso attraverso e il tubo di raccolta.
  16. Metti la mini colonna spin in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL.
  17. Centrifuga colonna e tubo a 18.000 x g per 5 minuti. Scartare il flusso attraverso e il tubo di raccolta.
  18. Inserire la mini colonna di spin in un nuovo tubo da 1,5 mL e aggiungere 15 μL di acqua priva di RNasi al centro della membrana della colonna di spin.
  19. Incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
  20. Centrifugare a 18.000 x g per 1 minuto per eluire l'RNA. L'RNA è pronto per il trattamento a valle.
  21. Eseguire analisi di tracciamento delle nanoparticelle per il controllo qualità e la verifica della resa dell'RNA.

7. Sintesi del cDNA

  1. Eseguire la sintesi del cDNA utilizzando kit commerciali seguendo i protocolli del produttore (vedi Tabella dei Materiali).
  2. Prepara il master mixture secondo la Tabella 1 in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
  3. Mescola la soluzione pipettando su e giù.
  4. Pipetta 5,1 μL del master mix in tubi PCR da 0,1 μL.
  5. Aggiungere 9,9 μL di campione al tubo assegnato contenente il master mix.
  6. Metti i tubi PCR in un termociclatore e fai funzionare secondo la Tabella 2.
    NOTA: Il cDNA è pronto per ulteriori analisi.
ComponenteVolume/reazione
Buffer RT 10x1,5 μL
Mix dNTP 100M0,15 μL
Inibitore dell'RNAsi (200U/μL)0,19 μL
Enzima RT multiscrizione (50U/μl)1 μl
Primer RT 20x0,75 μL
Acqua libera di RNAsi1,51 μL
Esempio9,9 μL
Volume totale15 μL

Tabella 1: Preparazione del master mix PCR utilizzato per la sintesi del cDNA dall'RNA isolato.

PassoTemperaturaDurata
Trascrizione inversa16 °C30 min
42 °C30 min
Fermati85 °C5 min
Fermati4 °C

Tabella 2: Condizioni di termociclo per la sintesi del cDNA.

8. PCR digitale a gocce

NOTA: La PCR digitale a goccie (ddPCR) viene eseguita utilizzando kit commerciali seguendo i protocolli del produttore (vedi Tabella dei Materiali).

  1. Preparare il master mix per ddPCR in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL secondo la Tabella 3.
  2. Pipetta 19,8 μL di master mix in tubi PCR da 0,1 μL. Aggiungi 2,2 μL di campioni e mescola bene pipettando la miscela su e giù per 10 volte.
  3. Trasferire 20 μL della miscela campione nella corsia campionaria della cartuccia ddPCR.
  4. Aggiungi 50 μL di olio nella corsia dell'olio della cartuccia.
  5. Fissa una guarnizione alla cartuccia usando il gancio sulla placca.
  6. Inserisci la cartuccia nella macchina per la generazione delle gocce. Un suono di clic indica un inserimento corretto della cartuccia nella macchina per la generazione delle gocce.
  7. Trasferire con cura tutte le gocce generate nei pozzi di una piastra a 96 pozzi. Aggiungi almeno un pozzo senza controllo template come un controllo negativo.
  8. Sigilla la piastra usando una lamina perforabile in una macchina sigillatrice (vedi Tabella dei Materiali).
  9. Metti la piastra in un termociclatore e fai funzionare secondo la Tabella 4.
  10. Trasferisci la piastra nella macchina lettore di gocce per contare le gocce positive e negative.
  11. Quantifica il numero di copia/mL usando il numero di copia/valore di 20 μL generato dalla corsa.
ComponenteVolume/reazione
2x ddPCR Supermix per sonde (Senza dUTP)10 μL
Primer 20x / sonda1 μL
Esempio7 μL
Acqua libera di RNAsi2 μL
Volume totale20 μL

Tabella 3: Preparazione del master mix PCR utilizzato per la ddPCR.

PassoTemperaturaDurataRampaCiclo
Attivazione enzimatica95 °C10 min~2 °C/ s per ogni gradino1
Denaturazione94 °C30 s40
Ricottura60 °C1 minuto40
Disattivazione enzimatica98 °C10 min1
Fermati4 °CN/AN/A

Tabella 4: Condizioni di termociclo per la ddPCR.

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Risultati

Curva standard
È stata creata una curva standard per determinare il volume esatto di lacrime raccolte da ogni paziente. Fondamentalmente, volumi diversi di conservanti con intervalli compresi tra 3 μL e 25 μL sono stati esposti alle strisce di Schirmer. E la distanza dell'area umida sulla Schirmer fu osservata. La procedura è stata ripetuta tre volte per ciascuna procedura e la lettura media è stata calcolata. È stata generata una curva standard del volume delle lacri...

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Discussione

L'esame della funduscopia, la tomografia di coerenza ottica e l'angiografia con fluoresceina sono le tecniche di rilevamento attualmente disponibili per la rilevazione della retinopatia diabetica. Le tre tecniche vengono spesso utilizzate insieme per fornire una valutazione completa di varie malattie retiniche e coroide. La funduscopia è un esame clinico che viene eseguito di routine durante la valutazione della retinopatia diabetica. Questo metodo è eseguito da oculisti qualificati ed è...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata dall'Alcon Research Institute (IF011-2020) e dal FOM UMSC Care Postdoctoral Research Grant 2021.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,9% w/v di cloruro di sodioAin Medicare Sdn BhdGB16165967618
1x Soluzione salina tampone di fosfatoThermo Fisher Scientific10010-023
Biosistemi applicati  Kit di trascrizione inversa microRNA TaqManBiosistemi applicati4366596
ddPCR Supermix per Sonde (Nessun dUTP)Laboratori BioRad1863024
ddPCR Piastre a 96 pozziLaboratori BioRad12001925
Cartucce DG8Laboratori BioRad1864008
Guarnizioni DG8Laboratori BioRad1863009
Olio per la generazione di gocce per sondeLaboratori BioRad1863005
Kit di isolamento degli esosomi Exospin-96Sistemi di guida cellulareEX07-96
MiRNeasy Kit Avanzato Sero/PlasmaQiagen  217204
Sigillante per piastre PCR PX1Laboratori BioRad1814000
Sistema PCR digitale a gocce QX100Laboratori BioRadQX100
QXDx Generatore di Gocce Laboratori BioRad12001049
Striscia di SchirmerOptitechSCH-100
T100 Thermal CyclerLaboratori BioRad1861096
Saggio MicroRNA Taqman MTOMED 20 (ID saggio: 000389)Biosistemi applicati4440887Sequenza bersaglio: UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG

Riferimenti

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