Isolamento, espansione e differenziazione dei progenitori fibro-adipogenici dal modello murino spinoso

Sommario

Questo protocollo delinea l'isolamento di progenitori fibro-adipogenici (FAP) scheletrici e cardiaci da topi spinosi (Acomys) tramite dissociazione enzimatica e smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. I FAP ottenuti da questo protocollo possono essere efficacemente espansi e differenziati a miofibroblasti e adipociti.

Abstract

Grazie al suo eccezionale programma di riparazione, il topo spinoso è un modello di ricerca emergente per la medicina rigenerativa. I progenitori fibro-adipogenici sono cellule residenti nei tessuti che sono in grado di differenziarsi in adipociti, fibroblasti e condrociti. I progenitori fibro-adipogenici sono fondamentali per orchestrare la rigenerazione dei tessuti in quanto sono responsabili del rimodellamento della matrice extracellulare dopo una lesione. Questo studio si concentra sullo studio del ruolo specifico dei progenitori fibro-adipogenici nella riparazione cardiaca del topo spinoso e nella rigenerazione del muscolo scheletrico. A tal fine, è stato ottimizzato un protocollo per la purificazione di progenitori fibro-adipogenici spinosi di topo mediante citometria a flusso da muscolo scheletrico e cardiaco enzimaticamente dissociato. La popolazione ottenuta da questo protocollo è in grado di espandersi in vitro, e può essere differenziata in miofibroblasti e adipociti. Questo protocollo offre uno strumento prezioso ai ricercatori per esaminare le proprietà distintive del topo spinoso e per confrontarle con il Mus musculus. Ciò fornirà informazioni che potrebbero far progredire la comprensione dei meccanismi rigenerativi in questo intrigante modello.

Introduzione

Inizialmente riconosciuto per la sua pelle eccezionalmente fragile e la notevole capacità di riparare le lesioni cutanee, il topo spinoso ha dimostrato una capacità rigenerativa superiore in vari sistemi di organi, come muscoloscheletrico, renale, sistema nervoso centrale e cardiovascolare, rispetto al Mus musculus ^1,2.

I progenitori fibro-adipogenici (FAP) sono un sottoinsieme di cellule stromali che risiedono in vari tessuti, tra cui il muscolo scheletrico e cardiaco. Queste cellule possiedono una capacità unica di impegnarsi in linee fibrogeniche e adipogeniche in vivo e in vitro ^3,4. I FAP svolgono un ruolo cruciale nella rigenerazione tissutale modulando la matrice extracellulare e supportando le funzioni di altri tipi di cellule coinvolte nel processo di riparazione. Nel muscolo scheletrico, i FAP si attivano in risposta a una lesione e facilitano la differenziazione delle cellule staminali muscolari e la miogenesi ^5,6. Nella lesione ischemica del cuore, le FAP depongono tessuto cicatriziale per mantenere l'integrità del miocardio. A differenza dei muscoli, i FAP cardiaci si attivano cronicamente e contribuiscono al rimodellamento patologico ^7,8.

Studi precedenti hanno dimostrato che la matrice extracellulare spinosa del topo ha composizione, struttura e proprietà diverse che supportano la rigenerazione rispetto a Mus musculus ^9,10. Nelle lesioni muscolari e cardiache, è stato notato che i FAP contribuiscono a una guarigione superiore nel topo spinoso 11,12,13. Comprendere il comportamento e il controllo regolatorio dei FAP e dello stroma spinosi del topo può far luce sul meccanismo alla base delle loro capacità rigenerative. Sebbene i FAP siano ampiamente studiati in altri modelli animali, come nel mus musculus^14,15, attualmente non esistono protocolli pubblicati per isolare i FAP spinosi del topo. Lo sviluppo di un tale protocollo colmerebbe una lacuna significativa nel campo e consentirebbe ai ricercatori di esaminare i meccanismi cellulari e molecolari alla base del potenziale rigenerativo del topo spinoso.

Questo protocollo descrive un protocollo robusto e riproducibile per isolare, espandere e differenziare i FAP del muscolo scheletrico e cardiaco dal topo spinoso. Il protocollo qui descritto produce sospensioni di singole cellule di alta qualità adatte alla selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Utilizzando rh-TGFβ1 o un terreno compatibile disponibile in commercio, due metodi ampiamente utilizzati per differenziare i FAP mus musculus ¹⁶, i FAP spinosi selezionati mantengono la loro capacità di differenziarsi lungo il lignaggio fibrogenico e il lignaggio adipogenico, rispettivamente (Figura 1).

Protocollo

Tutte le procedure di mantenimento e sperimentazione degli animali sono state condotte in conformità con l'approvazione del Comitato per la cura degli animali dell'Università della British Columbia e i regolamenti dell'Università della British Columbia. Gli animali sono stati alloggiati in una struttura chiusa priva di agenti patogeni in condizioni standard (ciclo luce-buio 12:12, 21-23 °C e livello di umidità del 40%-60%) e hanno ricevuto una dieta ricca di proteine per topi e acqua ad libitum. Per questo studio sono stati utilizzati topi adulti (da 4 a 6 mesi, 50-60 g) femmine e maschi di Acomys dimidiatus . I dettagli di tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione della soluzione e del tampone

1. Preparare 1x tampone fosfato soluzione salina (PBS).
2. Preparare PBS-EDTA miscelando 4 mL di 0,5 M EDTA (2 mM) e 996 mL di 1x PBS, pH = 7,4.
3. Preparare 250 mM di CaCl₂ aggiungendo 2,7745 g di CaCl₂ a 100 mL di acqua priva di nucleasi.
4. Preparare il tampone per la digestione: Mescolare 50 μg/mL di liberasi, 2,5 mM di CaCl₂ e il 5% di siero fetale bovino (FBS) in DMEM/F12.
5. Preparare il tampone FACS miscelando 488 mL di 1x PBS, 2 mL di EDTA 0,5M e 10 mL di FBS.
6. Preparare il tampone di vitalità mescolando il tampone FACS con lo ioduro di propidio (PI; 1 μg/mL).
7. Preparare i terreni di base mescolando DMEM/F12 con il 5% di FBS e l'1% (v/v) di penna/streptococco.
8. Preparare i terreni di proliferazione mescolando DMEM/F12 con il 10% di FBS, l'1% (v/v) di penna/streptococco e 2,5 ng/mL di bFGF.
9. Preparare i terreni fibrogenici mescolando terreni basici e 10 ng/mL di rh-TGFβ1,
10. Preparare terreni adipogenici (1x) mescolando DMEM/F12 con l'1% di penna/streptococco e un integratore di differenziazione adipogenica di topo 10x disponibile in commercio.
11. Preparare il 4% di PFA aggiungendo il 4% di paraformaldeide (p/v) a 1x PBS.
12. Preparare lo 0,3% di PBS-Triton mescolando 498,5 mL di 1x PBS e 1,5 mL di TritonX-100.
13. Preparare il tampone di blocco dell'asino mescolando il 5% (v/v) di siero d'asina, l'1% di BSA (p/v) e lo 0,3% di PBS-Tritone.
14. Preparare il tampone di blocco Donkey + MOM mescolando 2,5 ml di tampone di blocco Donkey e 2 gocce di blocco MOM.
15. Preparare la soluzione di colorazione DAPI mescolando 600 nM di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in 1x PBS.

2. Raccolta dei tessuti

1. Sopprimere l'animale seguendo le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali. Per i topi spinosi, si raccomanda l'isoflurano seguito da CO₂ (20% del volume della gabbia/min) e lussazione spinale per garantire la morte.
2. Posizionare il topo sul palco di dissezione in posizione supina e spruzzare accuratamente con etanolo al 70% per prevenire la contaminazione con il pelo del topo.
3. Praticare un'incisione verticale di 2-3 cm sulla linea mediana ventrale ed esporre la gabbia toracica e il muscolo addominale. Tagliare il muscolo nel processo xifoideo con le forbici per tessuti ed esporre il diaframma. Tagliare il diaframma e la gabbia toracica su entrambi i lati. Usa un emostatico per bloccare e staccare le costole tagliate.
4. Intacca l'atrio destro con le forbici per fazzoletti, posiziona un ago da 23 G attaccato a una siringa da 20 ml all'apice del cuore e perfondilo iniettando lentamente 20 ml di pbs-EDTA da 2 mM.
5. Asportare il cuore, sciacquare 1x PBS freddo in una capsula di Petri da 60 mm con ghiaccio, rimuovere gli atri e pulire il sangue il più possibile.
6. Rimuovere la pelle sopra l'articolazione del ginocchio. Usa una pinza fine per rimuovere la fascia e isola il muscolo quadricipite con le forbici usando il femore come guida. Mettere in una capsula di Petri separata con 1x PBS freddo.
7. Ripetere il passaggio 2.6 per l'altra gamba.

3. Digestione dei tessuti

1. Aggiungere 2 ml di tampone digestivo a una fiala di trasporto da 5 ml per il cuore e 4 ml di tampone digestivo a una provetta da centrifuga da 15 ml per due muscoli quadricipiti.
2. Tritare il fazzoletto con le forbici per fazzoletti sul coperchio della capsula di Petri in³ pezzi più piccoli di 1 mm.
3. Aggiungere il tessuto macinato alle rispettive provette di digestione. Vortice per 2 s a bassa velocità per mescolare.
4. Incubare a 37 °C con rotazione delicata e agitazione.
5. Dopo 20 minuti, togliere le provette dal rotatore e lasciare che i pezzi di tessuto si depositino. Togliere il surnatante con una pipetta P1000 in 20 mL di tampone FACS ghiacciato in provette da centrifuga da 50 mL.
6. Rabboccare le provette di digestione con 2 mL e 4 mL di tampone di digestione per la digestione del cuore e dei muscoli e riposizionarle a 37 °C ruotando delicatamente e agitando.
7. Ripetere i passaggi da 3.5 a 3.6 un'altra volta dopo altri 20 minuti. Inserire il surnatante nella rispettiva provetta da centrifuga da 50 mL dal passaggio 3.5.
8. Interrompere la digestione dopo 60 minuti estinguendo il tampone di digestione con un tampone FACS ghiacciato.
9. Filtrare la sospensione di digestione e il surnatante attraverso un filtro cellulare da 40 μm sopra provette da centrifuga da 50 mL. Rabboccare fino a 40 ml con tampone FACS.
10. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 8 minuti a 4 °C. Decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 mL di tampone di lisi ACK. Incubare con ghiaccio per 5 minuti e rabboccare fino a 40 mL con tampone FACS.
11. Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C. Decantare il surnatante.
12. Risospendere in 0,5 mL di tampone FACS, pipettando verso l'alto e verso il basso per garantire che le cellule siano disperse in modo uniforme.
13. Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 40 μm su provette a fondo tondo in polistirene da 5 mL con tappo a filtro.

4. Colorazione per la selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS)

1. Per i controlli a colore singolo e a fluorescenza meno uno (FMO), preparare 30 μL di tampone di colorazione (anticorpi diluiti in tampone FACS) a una concentrazione di lavoro 2x in provette da centrifuga da 1,5 mL pre-marcate. Fare riferimento alla Tabella 1 per l'impostazione del tampone di colorazione degli anticorpi.
2. Prepara separatamente i colori singoli e i controlli FMO per muscoli e cuore.
3. Trasferire 30 μl di tampone di colorazione monocolore e di controllo FMO su una piastra a 96 pozzetti. Rabboccare con 20 μl di tampone FACS.
4. Per la colorazione FACS del campione, preparare 0,5 mL di tampone di colorazione (anticorpo diluito in tampone FACS) a 2 volte la concentrazione di lavoro in provette da centrifuga da 1,5 mL.
5. Aggiungere 10 μl di sospensione cellulare ai pozzetti di controllo monocolore e FMO. Aggiungere il tampone di colorazione al resto della sospensione cellulare e risospendere.
6. Incubare a 4 °C, al riparo dalla luce per 30 min.
7. Rabboccare i pozzetti con 100 μL di tampone FACS e la provetta del campione con 2 mL di tampone FACS.
8. Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C e rimuovere il surnatante.
9. Ripetere i passaggi 4.7 e 4.8.
10. Risospendere il pellet di cella nel tampone di vitalità. 100 μl per i controlli a colore singolo e FMO, 1 mL per i campioni di smistamento FACS.
11. Preparare le provette di raccolta aggiungendo 300 μl di terreno di proliferazione in provette da centrifuga da 1,7 mL.

5. Smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza

1. Strategia di gating: utilizzare FSC vs. SSC (registro) per rimuovere i detriti. Utilizzare FSC-H vs. FSC-A per le canottiere gate. Usa CD31 vs. PI per il gate su cellule vitali e negative al lignaggio. Utilizzare PDGFRα per il gate per i FAP (Figura 2).
2. Smistare in provette di raccolta precedentemente preparate.

6. Coltura tissutale

1. Centrifugare le celle raccolte a 800 x g per 10 minuti a 4 °C.
2. Rimuovere il surnatante con una pipetta P1000. Fare attenzione a non disturbare il pellet della cella.
3. Risospendere il pellet in terreno di coltura (250 μL/pozzetto) e seminare a 25k cellule/pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti.
4. Coltura in incubatore (37 °C, 5% CO₂). Cambiare i terreni ogni 3 giorni fino a quando le celle non raggiungono l'80% di confluenza.

7. Differenziamento fibrogenico

1. Una volta che le cellule sono pronte per essere trattate, posizionare il terreno di base e 1x DPBS in un bagno caldo o a temperatura ambiente prima di utilizzarle.
2. Aspirare i terreni di coltura.
3. Risciacquare due volte con 200 μl di 1x DPBS.
4. Risciacquare una volta con 200 μl di terreno basico.
5. Aggiungere 250 μl di terreno fibrogenico o basico ai rispettivi pozzetti.
6. Rimettere le cellule nell'incubatore (37 °C, 5% CO₂).
7. Interrompere la differenziazione dopo 48 ore.

8. Differenziazione adipogenica

1. Una volta che le cellule sono pronte per essere trattate, posizionare i terreni di base, i terreni adipogenici e 1x DPBS in un bagno caldo o a temperatura ambiente prima di utilizzarli.
2. Aspirare i terreni di coltura.
3. Risciacquare due volte con 200 μl di 1x DPBS.
4. Risciacquare una volta con 200 μl di terreno basico.
5. Aggiungere 400 μl di terreno adipogenico o basico ai rispettivi pozzetti.
6. Riportare all'incubatrice (37°C, 5% CO₂).
7. Ogni 2 giorni, rimuovere 200 μL di terreno con una pipetta dai pozzetti e aggiungere 200 μL di terreno adipogenico o basico fresco.
8. Interrompere la differenziazione il 6^{° giorno per} le FAP del muscolo scheletrico e il 14^° giorno per le FAP cardiache.

9. Immunocolorazione

1. Arrestare il test di differenziazione aspirando il terreno e risciacquando due volte con 250 μl di 1x PBS. Eseguire tutti i lavaggi con l'ago da 18 G collegato alla siringa da 3 ml per evitare il distacco delle cellule.
2. Aggiungere 250 μl di PFA al 4% per pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 7 minuti.
3. Rimuovere il PFA e risciacquare 3 volte per 5 minuti ogni volta con 250 μl di 1x PBS.
4. All'ultimo lavaggio, aspirare 1x PBS e aggiungere 250 μl di tampone bloccante Donkey + MOM.
5. Incubare a temperatura ambiente per 60 min.
6. Preparare la soluzione di colorazione primaria dell'anticorpo nel tampone bloccante Donkey (anti-SMA e anti-perilipina) per un volume finale di 100 μl per pozzetto.
7. Aspirare i pozzetti di colorazione. Lascia il buffer di blocco Donkey + MOM nel pozzetto di controllo, se applicabile.
8. Aggiungere la soluzione colorante primaria degli anticorpi nei rispettivi pozzetti.
9. Incubare a 4 °C per una notte.
10. Il giorno successivo, lavare 3 volte per 5 minuti ogni volta con 1x PBS.
11. Preparare la soluzione di colorazione secondaria degli anticorpi nel tampone bloccante Donkey con un volume finale di 100 μl per pozzetto.
12. Aspirare l'ultimo lavaggio e aggiungere la soluzione colorante secondaria di anticorpi in tutti i pozzetti.
13. Incubare a temperatura ambiente per 45 minuti (i campioni devono essere protetti dalla luce da questo punto in poi).
14. Lavare 3 volte per 5 minuti ogni volta con 1x PBS.
15. Aspirare l'ultimo lavaggio e aggiungere 250 μl di soluzione colorante DAPI.
16. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
17. Rimuovere la soluzione colorante DAPI e lavare una volta per 5 minuti con 1x PBS.
18. Aggiungere 100 μl di Fluoromount-G in ogni pozzetto.
19. Sigillare la piastra con il coperchio e la pellicola di paraffina per ridurre al minimo l'evaporazione. Conservare a 4 °C, al riparo dalla luce fino all'imaging.
20. Immagine con un microscopio (Figura 3 e Figura 4).
    NOTA: Il siero d'asino viene utilizzato nel tampone di blocco come blocco specie-specifico contro gli anticorpi secondari allevati dall'asino che vengono utilizzati in questo protocollo. Il reagente bloccante top-on-mouse viene utilizzato contro l'anticorpo primario anti-SMA che viene sollevato nel topo.

Risultati

Lo schema di questo protocollo per isolare e coltivare il muscolo scheletrico e le FAP cardiache è riassunto nella Figura 1. Per la raccolta dei tessuti, il fegato che cambia colore dal rosso scuro al giallo pallido è solitamente indicativo di una perfusione riuscita. Con le fasce di età specificate del topo spinoso, il peso cardiaco è in genere di circa 200 mg, mentre il muscolo quadricipite è di circa 350 mg.

Durante ogni cambio del tampone di digestione nei passaggi 3.5-3.7, il tampone di digestione nelle provette di digestione appare opaco quando le cellule vengono rilasciate dal tessuto. Al termine della digestione, la soluzione deve essere un impasto relativamente omogeneo con alcuni pezzi di tessuto rimanenti. Assicurati di terminare la digestione prima che tutti i tessuti siano completamente digeriti per evitare una digestione eccessiva, che avrà un impatto negativo sulla vitalità delle cellule e sui risultati della coltura.

I diagrammi di flusso previsti per il FACS sono mostrati nella Figura 2. Si prevede che i FAP rappresentino circa il 2% delle cellule vive e delle cellule LIN-. La percentuale di eventi PI+ è un indicatore della qualità della preparazione del campione e deve essere inferiore al 10%. In questo studio, si ottengono tipicamente 150k FAP per cuore (solo ventricoli) e 100k FAP da due muscoli quadricipiti.

Una volta nella piastra, le cellule si attaccano tipicamente entro 72 ore, raggiungono l'80% di confluenza entro 5 giorni e mostrano la tipica morfologia dei fibroblasti con proiezioni (Figura 5).

Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo e tempo approssimativo richiesto per ogni fase. Prelievo dei tessuti: 10 minuti per topo. Digestione dei tessuti: 1,5-2 h. Colorazione cellulare: 45 min-75 min. Smistamento cellulare attivato da fluorescenza: 2 h. Espansione dei progenitori fibro-adipogenici (FAP): 4 giorni. Differenziazione dei FAP: 48 ore per il differenziamento fibrogenico, 6 giorni per il differenziamento adipogenico per i FAP del muscolo scheletrico e 14 giorni per i FAP cardiaci. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Grafici FACS rappresentativi per l'isolamento FAP del muscolo scheletrico (in alto) e cardiaco (in basso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Differenziamento FAP del muscolo scheletrico spinoso del topo. (A) Controllo della differenziazione fibrogenica. (B) Differenziamento fibrogenico. (C) Controllo della differenziazione adipogenica. (D) Differenziamento adipogenico. Perilipina (verde), SMA (magenta), DAPI (blu), barra della scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Differenziamento cardiaco di FAP nel topo spinoso. (A) Controllo del differenziamento fibrogenico. (B) Differenziamento fibrogenico. (C) Controllo della differenziazione adipogenica. (D) Differenziamento adipogenico. Perilipina (verde), SMA (magenta), DAPI (blu), barra della scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini in campo chiaro di FAP del muscolo scheletrico (A) e del cuore (B) del topo spinoso dopo 5 giorni di coltura, prima della differenziazione. Barra di scala = 360 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Controlli	CD31 SC	PDGFRα SC	CD31 FMO	PDGFRα FMO	Campione
Anticorpo CD31	+	-	-	+	+
Anticorpo PDGFRα	-	+	+	-	+

Tabella 1: Guida schematica per l'impostazione di cocktail di colorazione anticorpale per controlli e campioni. SC = controllo a colore singolo, FMO = fluorescenza meno un controllo, + = con l'anticorpo corrispondente, - = senza l'anticorpo corrispondente.

Discussione

I tessuti spinosi del topo sono più sensibili agli stress nella dissociazione tissutale e ci sono diversi aspetti di questo protocollo volti a ridurre al minimo lo stress per migliorare la vitalità cellulare. La tecnica di dissociazione enzimatica seriale viene impiegata per la preparazione del campione per abbassare la concentrazione dell'enzima richiesto. Man mano che la digestione enzimatica procede, l'attività enzimatica diminuisce. Sostituendolo con enzimi freschi, è possibile ottenere un'attività enzimatica costante durante l'intera digestione e si evitano alte concentrazioni dell'enzima. Inoltre, si evita di cambiare il tampone di digestione per digerire eccessivamente le cellule già rilasciate nella soluzione. In secondo luogo, il tampone di lisi ACK viene utilizzato per rimuovere i globuli rossi. Sebbene il cuore sia dissanguato e perfuso, contiene ancora globuli rossi in quanto è un organo altamente vascolarizzato. Rimuovendo i globuli rossi contaminanti, il tempo necessario per la FACS è ridotto al minimo per evitare la degradazione cellulare. Infine, è importante lavorare in modo rapido e diligente dal passaggio 2.1 al passaggio 6.4 e seguire le migliori pratiche per lavorare con le cellule, come il pipettaggio delicato e il mantenimento del ghiaccio il più possibile. Alcuni dettagli sono difficili da mostrare anche nel formato audiovisivo e possono richiedere un certo livello di esperienza.

Nelle colture cellulari, la densità di semina iniziale è fondamentale per un'espansione cellulare ottimale. Le FAP nel piatto comunicano in modo paracrino e stimolano la crescita attraverso fattori di crescita secrenti. In condizioni di bassa densità di semina, le cellule non ricevono segnali sufficienti per la crescita e non riusciranno ad espandersi o richiederanno ulteriore tempo di coltura per raggiungere livelli di confluenza appropriati per le applicazioni a valle. Questo è anche il razionale per cambiare solo metà del mezzo durante ogni cambiamento del media nella differenziazione adipogenica. È importante lasciare alcuni terreni condizionati che contengano i fattori di crescita dei pre-adipociti che sono fondamentali per la loro differenziazione.

Durante l'immunocolorazione, è importante essere delicati quando si aggiungono o si rimuovono i tamponi per ridurre al minimo il distacco delle cellule. In particolare, nel passaggio 9.1, le cellule sono le più inclini a staccarsi prima della fissazione. Si consiglia l'aspirazione manuale, ad esempio con una pipetta o un ago e una siringa, ma si sconsiglia l'uso di potenti aspiratori a vuoto.

Una limitazione di questo protocollo è che il PDGFRα è un marcatore generale dei FAP e sono necessari più marcatori per distinguere i sottotipi unici di FAP¹⁷. Sottotipi come i progenitori DPP4+ come le FAP e le FAP adipogeniche CD10+ sono stati implicati sia nella malattia che nel contesto omeostatico 18,19,20. È probabile che esistano anche sottoinsiemi di FAP nel topo spinoso. Possono esistere in proporzioni diverse, esibire un comportamento cellulare diverso o avere funzioni fisiologiche diverse rispetto ai corrispondenti sottogruppi di FAP mus musculus. Sarà necessaria un'ulteriore ottimizzazione dei marcatori specifici del sottotipo di FAP nel topo spinoso per esaminare i dettagli dei FAP del topo spinoso.

In sintesi, questo protocollo descrive in dettaglio un metodo robusto e riproducibile per isolare, coltivare e differenziare i FAP muscolari scheletrici e cardiaci dal topo spinoso. Il topo spinoso sta prendendo piede come nuovo modello animale iper-rigenerativo. I FAP e lo stroma sono altamente implicati nel mantenimento dell'omeostasi muscolare e cardiaca e contribuiscono alla disfunzione d'organo in diversi modelli di malattia cronica ^5,7. La caratterizzazione dei FAP di topo spinoso può chiarire il meccanismo alla base della loro notevole capacità rigenerativa e aprire la strada a nuove strategie nella medicina rigenerativa.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,5 M	EDTA Invitrogen	15575 038
Provette per microcentrifuga da 1,7 mL	VWR	87003-294
15  mL provetta da centrifuga	Falcon	352096
1x Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)	Gibco	14190-144
siringa da 20 ml	BD	309661
4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Invitrogen	D3571
40  μ filtro cellulare m	Falcon	352340
piastra per coltura tissutale a fondo piatto a 48 pozzetti	Falcon	53078
	Falcon	352063
provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mL con tappo per filtro cellulare	Siringa Falcon	352235
5 mL	BD	309646
50  provetta da centrifuga mL	Falcon	352070
Piastra di Petri da 60 mm	Falcon	353002
96 pozzetti Piastra per coltura tissutale con fondo a V	Corning	3894
Acomys dimidiatus topi (topi spinosi)			gentilmente donata dal Dr. Ashley W. Seifert (Università del Kentucky).
Tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio (ACK)	Gibco	A10492-01
Anti-perilipina (1:100)	Sigma	P1873
Anti-SMA (1:100)	Invitrogen	14-9760-82
APC PDGFRa (1:800)	Abcam	ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G	BD	305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G	BD	305145
Albumina sierica bovina	Sigma	A7906-100g
BV605 CD31 (1:500)	BD biosciences	744359
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Centrifuga	Eppendorf	5810R
DMEM/F12	Gibco	11320033
Asino anti-topo Alexa 555 (1:1000)	Invitrogen	A31570
Asino anti-coniglio Alexa 647 (1:1000)	Invitrogen	A31573
Siero d'asino	Sigma	S30-100ML
Selezionatore FACS - MoFlo Astrios 5 laser	Coltro	Beckman B52102
Siero fetale bovino	Gemini	100-500
Forbici fini	FST	14058-11
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Pinze	FST	11051-10
Emostatico	FST	91308-12
Proteina ricombinante basica FGF umana (bFGF)	Gibco	13256029
Proteina ricombinante TGF beta 1 umana (TGFb1)	eBiosciences	14-8348-62
Incubatore - Heracell 160i CO2	ThermoFisher	51033557
Microscopio invertito - Revolve	ECHO	n/a
Liberase	Roche	5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplemento	STEMCELL	technologies 5507
Reagente bloccante topo su topo (MOM)	Vector Laboratories	MKB-2213
Paraformaldeide	Sigma	P1648-500g
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140– 122
PicoLab Dieta del topo 20	LabDiet	3005750-220
Ioduro di propidio (PI)	Invitrogen	P3566
Fiala di trasporto 5mL tubo	Caplugs Evergreen	222-3005-080
Triton X-100	Sigma	9036-19-5