Articolo metodologico

Modellazione dell'infezione vaginale ascendente, della nascita pretermine e della morbilità neonatale nei topi

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DOI:

10.3791/66723

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10 ottobre 2025

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1EGA Institute for Women's Health, University College London, 2Department of Women and Children's Health, St Thomas' Hospital, King's College London

In questo articolo

Sommario

Il parto pretermine (parto < 37 settimane) è un problema urgente di salute globale con opzioni di prevenzione e trattamento non ottimali. Presentiamo un modello murino di parto pretermine indotto da infezione batterica vaginale ascendente e delineiamo come analizzare la morbilità e la mortalità neonatale risultanti.

Abstract

La nascita pretermine continua a essere una delle cause primarie di mortalità e morbilità neonatale a livello globale, con terapie preventive limitate. Vi è un imperativo bisogno di
modelli animali rilevanti e riproducibili per la traduzione di interventi innovativi
per diventare realtà. Esistono vari modelli murini di parto pretermine. Tuttavia, non ricapitolano le morbilità neonatali umane, comprese le alterazioni neuropatologiche e
lesioni polmonari, che sono sequele caratteristiche dell'infezione ascendente e della nascita pretermine. Abbiamo caratterizzato un modello che, per quanto ne sappiamo, è l'unico che imita lo scenario umano in cui queste morbilità neonatali sono presenti in seguito all'induzione di un parto pretermine da parte di un batterio vivo che risale dalla vagina. Questo articolo dimostra la somministrazione intravaginale di un ceppo bioluminescente di Escherichia coli e descrive in dettaglio la valutazione degli esiti neuropatologici e del danno polmonare utilizzando tecniche di immunoistochimica e istologia.

Introduzione

La nascita pretermine (PTB; parto < 37 settimane) è il principale fattore che contribuisce alla mortalità neonatale in tutto il mondo 1,2. Rappresentando l'11% di tutte le nascite, è un grave problema di salute globale con un'eziologia complessa che è scarsamente compresa, rendendo difficile prevedere e prevenire 3,4,5. I sopravvissuti neonatali al PTB possono manifestare esiti avversi sullo sviluppo neurologico, tra cui paralisi cerebrale, disturbi respiratori, come la displasia broncopolmonare (BPD) e disturbi gastrointestinali come l'enterocolite necrotizzante (NEC)6,7,8. Pertanto, vi è un urgente bisogno di modelli animali riproducibili e clinicamente rilevanti per affrontare i percorsi biologici che contribuiscono al PTB e sviluppare interventi innovativi.

Ci sono una serie di possibili meccanismi alla base del PTB spontaneo, come la senescenza deciduale, una rottura della tolleranza materno-fetale, lo stress, la breve lunghezza cervicale o il danno cervicale9. Tuttavia, è stato riportato che almeno il 40% dei PTB spontanei è associato a un'infezione microbica10,11. I microbi che salgono dal canale vaginale attraverso la cervice fino all'utero sono ipotizzati e ampiamente accettati come una via comune di infezione a causa della correlazione tra i microbi isolati dal liquido amniotico e quelli residenti nel microbiota vaginale 12,13,14. I microrganismi spesso associati al parto pretermine includono specie di Mycoplasma, Ureaplasma, Fusobacterium e Streptococcus, e la maggior parte dei casi sono polimicrobici15,16.

I topi sono spesso utilizzati per modellare il PTB, con l'approccio più comune che consiste nella somministrazione della tossina batterica lipopolisaccaride (LPS), che può essere somministrata per via intrauterina, intraperitoneale o intra-amniotica per indurre i livelli di infiammazione necessari per iniziare il parto17. Tuttavia, l'LPS non modella l'infezione microbica viva e, soprattutto, gli esiti neonatali non possono essere misurati in questi modelli poiché l'LPS induce la morte fetale18. Negli ultimi anni, sono stati sviluppati modelli animali di infezione batterica vaginale ascendente, ma ricapitolare sia la nascita pretermine che gli esiti neonatali associati è stata una sfida 19,20,21,22,23,24.

Il nostro gruppo ha stabilito un nuovo modello di infezione batterica vaginale ascendente, parto pretermine e morbilità neonatale che ricapitola la fisiopatologia del PTB25 umano. Qui, dimostriamo come valutare la neuropatologia neonatale e il danno polmonare nei cuccioli esposti a infezione vaginale ascendente materna con un ceppo patogeno di Escherichia coli (E. coli) che è stato collegato alla meningite neonatale umana. Questo modello offre un'opportunità unica per esplorare la fisiopatologia dell'infezione ascendente, oltre a fornire i mezzi per valutare l'efficacia degli interventi di travaglio pretermine nel migliorare gli esiti neonatali.

Protocollo

Le procedure sono state condotte sotto una licenza del Ministero dell'Interno del Regno Unito (PAD4E6357) in conformità con l'Animal Scientific Procedures Act (1986) e le linee guida ARRIVE. La temperatura (19-23 °C), l'umidità (~55%) e i cicli luce/buio di 12 ore sono stati strettamente controllati. Topi femmina vergine C57BL/6 Tyrc-2J (di età compresa tra 6 e 12 settimane) sono stati accoppiati durante la notte per 16-18 ore. L'evidenza del tappo copulatorio è stata assegnata come giorno embrionale (E) 0,5.

E. coli patogeno O18:K1 (A192PP)26, un ceppo di A192 (DSM. No. 10719)27, è stato modificato per contenere l'operone lux (luxCDABE), originato dal simbionte nematode Photorhabdus Luminescens ATCC29999 (ceppo Hb), e comprendente una cassetta di resistenza alla kanamicina (Km2)28. Questo ceppo è classificato come Hazard Group 2 dal Comitato consultivo del governo britannico sui patogeni pericolosi (ACDP). Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati e seguire le linee guida locali durante la manipolazione e lo smaltimento degli agenti biologici.

1. Modello murino di infezione batterica vaginale ascendente

  1. Preparazione di colture di E. coli
    1. Preparare il brodo Luria-Bertani (LB) sciogliendo la polvere in acqua distillata (dH2O) fino a ottenere una soluzione al 20% e in autoclave. Una volta che il LB si è raffreddato a temperatura ambiente, aggiungere 50 μg/mL di kanamicina. Conservare a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
    2. Preparare una soluzione di gel pluronico F127 al 20% sciogliendo il solido in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Vortice per mescolare e agitare a 4 °C durante la notte.
    3. Aggiungere 10 ml di brodo LB trattato con antibiotici in un contenitore universale sterile da 30 ml. Rimuovere una scorta di Glicerina congelata di E. coli dalla conservazione a -80 °C. Utilizzando un puntale per pipetta sterile, raschiare il brodo di glicerolo congelato di E. coli per ricoprire leggermente l'estremità del puntale ed espellere il puntale direttamente nel brodo LB. Fissare il contenitore universale con parafilm, etichettarlo come a rischio biologico e posizionarlo in un agitatore orbitale per una notte (200 giri/min) a 37 °C.
    4. La mattina seguente, diluire la coltura batterica 1:100 (0,1 mL di coltura + 9,9 mL di brodo LB fresco) e rimetterla nell'agitatore orbitale per 1,5-3 h (200 rpm a 37 °C), controllando regolarmente la crescita della coltura misurando l'assorbanza a 600 nm. Pipettare 100 μl della coltura in duplicato in una piastra trasparente a fondo piatto a 96 pozzetti. Misurare l'assorbanza su uno spettrofotometro con la correzione della lunghezza del percorso attivata. Un OD600 compreso tra 0,5 e 0,7 indica la fase mediologaritmica della crescita.
    5. Quando si raggiungeOD 600 0,5-0,7 (~108-9 unità formanti colonie [CFU]), rimuovere 100 μL dalla coltura batterica e diluire in 900 μL di PBS sterile. Centrifugare a 14.000 × g per 1 min per lavare il pellet batterico e rimuovere il brodo LB. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet batterico in PBS sterile e diluire 1:10.000 in PBS sterile (a 102-3 CFU).
    6. Disinfettare tutti i puntali e i contenitori esposti ai batteri prima dello smaltimento.
  2. Anestesia
    1. Su E16.5, anestetizzare topi gravidi mediante inalazione di isoflurano (5% per induzione, 1,5% per il mantenimento in ossigeno). Trasferire il flusso di anestesia e poi l'animale sul cono del naso, mettendo la femmina in posizione prona. Confermare l'anestesia attraverso l'assenza di un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi e mantenere l'isoflurano alla percentuale minima richiesta per la procedura.
      ATTENZIONE: L'isoflurano è irritante per gli occhi e la pelle e tossico per il sistema nervoso centrale. Indossare DPI adeguati. Utilizzare sempre un sistema di lavaggio.
    2. Somministrare 20 μl di E. coli in fase mediologaritmica (1 × 10,2-3 CFU risospesi in PBS sterile) o PBS sterile (controllo del veicolo) nella vagina utilizzando un puntale per pipetta sterile da 200 μl (Figura 1). Utilizzando un puntale per pipetta sterile fresco da 200 μl, erogare 20 μl di gel pluronico al 20% F127 nella vagina per prevenire la fuoriuscita di batteri. Usando una garza sterile, tamponare la polvere di chinino sull'introito per dissuadere i topi dal pulire la sospensione batterica. Registrare la data e l'ora del trattamento.
      NOTA: Le CFU utilizzate si basavano su esperimenti di titolazione per ottenere il fenotipo desiderato (parto pretermine con cuccioli vivi). I CFU possono essere determinati eseguendo diluizioni seriali e placcatura su piastre di agar LB29.
    3. Mettere in gabbia singolarmente gli animali in gabbie ventilate individualmente (IVC) e consentire loro di riprendersi dall'anestesia prima di rimettere la gabbia nella stanza di attesa; Contrassegnare chiaramente la gabbia come un pericolo biologico. Monitorare gli animali fino a quando il loro comportamento normale non è ripreso.
      NOTA: Questa procedura non dovrebbe richiedere più di 5 minuti e gli animali dovrebbero riprendersi rapidamente (entro 2-5 minuti).
  3. Misurazione degli esiti gestazionali
    1. Installa le telecamere a circuito chiuso collegando una telecamera all'esterno di ogni gabbia per monitorare i topi alla ricerca di segni di parto e parto di cuccioli. Registrare il tempo impiegato fino al parto come numero di ore dal momento della somministrazione intravaginale di E. coli o PBS (passaggio 1.2.2) alla nascita del primo cucciolo.
    2. Registra il numero di cuccioli vivi/morti al momento del parto e calcola una percentuale di sopravvivenza per cucciolata. Osservare quotidianamente la madre e i cuccioli, registrando la sopravvivenza dei cuccioli fino a 7 giorni dopo la nascita e garantendo il recupero delle madri. Prendi altre misure, come il peso e la lunghezza del cucciolo, durante questo periodo.
      NOTA: I segnali del parto includono un aumento della toelettatura, la rotazione in cerchio e lo stretching e il calci fuori dalle zampe posteriori. Poiché si tratta di un'infezione batterica viva, le madri svilupperanno i sintomi nel tempo (di solito 24 ore dopo il trattamento). La femmina dovrebbe riprendersi dall'infezione, ma se mostra ancora sintomi di infezione dopo il parto, non ha costruito un nido o nutrito i suoi cuccioli entro il primo giorno, allora sacrifica umanamente gli animali usando i metodi della Tabella 1 (come l'esposizione a CO2 in una concentrazione crescente e la conferma della morte per lussazione cervicale).
  4. Imaging a bioluminescenza
    1. Dopo l'inoculazione batterica, eseguire l'imaging delle femmine a 24 e 48 ore per monitorare la diffusione dell'infezione, come descritto di seguito. Immagina i cuccioli il giorno postnatale (P)0 fino a P14 senza bisogno di anestesia.
    2. Dopo aver aperto il software di imaging, fare clic su Inizializza e attendere che la fotocamera raggiunga la temperatura di esercizio (la barra della temperatura diventerà verde e si bloccherà). Selezionare la casella per l'imaging luminescente e verificare che il filtro di eccitazione sia impostato su Blocca e che il filtro di emissione sia impostato su Apri.
    3. Anestetizzare le femmine adulte mediante inalazione di isoflurano (5% per induzione, 1,5% per il mantenimento in ossigeno). Posizionare gli animali in posizione supina nella macchina per l'imaging a bioluminescenza (con un tavolino riscaldato) mantenendo l'anestesia ai topi. Selezionare Tempo di esposizione Auto o impostare manualmente il tempo di esposizione (intervallo di esposizione: 1 min - 5 min). Dopo l'imaging, rimetti gli animali nelle loro gabbie per riprendersi dall'anestesia prima di riportarli nella stanza di attesa.
    4. Per misurare quantitativamente la radianza del fotone, selezionare le regioni di interesse (ROI) sulle immagini del mouse e registrare i fotoni al secondo per centimetro quadrato per steradiante (fotoni∙(secondo-cm2)-1∙sr-1).

2. Analisi dei tessuti fetali e neonatali

  1. Prelievo di tessuti perinatali
    1. Su E18.5, sacrificare la diga per esposizione all'aumento della concentrazione di CO2 e confermare la morte per lussazione cervicale ed eseguire una mini laparotomia per rimuovere l'utero; Quindi, fai un'incisione nell'utero usando le forbici.
    2. Se si raccoglie il liquido amniotico, praticare una piccola incisione nelle membrane e raccogliere il liquido utilizzando una pipetta Pasteur o una siringa senza ago.
    3. Usando una pinza, con una mano tieni l'esterno dell'utero nel punto in cui è attaccata la placenta e, con una pinza curva nell'altra mano, stacca delicatamente la placenta dalla parete uterina interna separando i tessuti, guidando attentamente il feto, con le membrane e la placenta attaccate, fuori dall'utero. Ancora una volta, con il forcipe in ogni mano, tieni delicatamente premuta la placenta e afferra e strappa le membrane nel punto in cui incontrano la placenta (assicurati che queste si stacchino in modo pulito).
    4. Ora che i tessuti sono separati, raccogli i tessuti gestazionali necessari (ad esempio, utero, placenta, membrane fetali, cervice e vagina) e seziona i tessuti fetali (ad esempio, cervello, polmoni e intestino).
    5. Congelare immediatamente i fazzoletti su ghiaccio secco o in azoto liquido e/o fissare i fazzoletti in paraformaldeide (PFA; 4% in PBS).
    6. Conservare il fazzoletto congelato a -80 °C e fissare i fazzoletti per 24-48 ore; quindi, conservare in saccarosio al 30% a 4 °C.
      ATTENZIONE: Il PFA è infiammabile e può causare irritazione agli occhi, alla pelle e alle vie respiratorie. Preparare la soluzione al 4% in una cabina di biosicurezza e indossare DPI adeguati durante la manipolazione.
  2. Prelievo di tessuti postnatali
    1. Su P7, anestetizzare i cuccioli usando isoflurano (5% per induzione, 1,5% per il mantenimento in ossigeno).
    2. Eseguire il dissanguamento e la perfusione tissutale incidendo l'atrio destro e iniettare 10 ml di PBS nel ventricolo sinistro. Decapitare la carcassa e rimuovere il cervello e i polmoni usando forbici e pinze sterili. Processare e conservare i tessuti come descritto sopra.
      NOTA: Il tessuto materno e fetale congelato può essere analizzato per l'infiammazione e altri mediatori mediante qPCR, ELISA e western blot. I protocolli per queste tecniche sono prontamente disponibili presso i produttori di reagenti o in altre pubblicazioni 25,30,31.
  3. Criosezione del cervello fetale e neonatale
    1. Usando una lama, rimuovere il cervelletto per creare una superficie piana e congelare il tessuto su ghiaccio secco. Montare il tessuto congelato sul portacampioni utilizzando il composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) e coprire il tessuto con un sottile strato di OCT. Lasciare congelare (1-2 min).
    2. Utilizzando un criostato impostato a -20 °C, assicurarsi che la leva sia bloccata e caricare il portacampioni. Regolare con precisione la posizione del tessuto e bloccarla in posizione. Tagliare il tessuto e iniziare a raccogliere sezioni di tessuto su microvetrini dalla fusione del corpo calloso, congelando immediatamente le sezioni su ghiaccio secco. Tagliare 50 sezioni seriali da 40 μm di ciascun tessuto.
      ATTENZIONE: Fare attenzione alla lama affilata.
    3. Conservare le sezioni congelate su microvetrini a -80 °C.
  4. Immunoistochimica
    NOTA: Il protocollo seguente può essere utilizzato per identificare gli astrociti (proteina acida fibrillare gliale; GFAP), microglia (fattore infiammatorio 1 dell'allotrapianto; IBA-1) e neutrofili (membro della famiglia G dell'antigene linfocitario 6; Ly6G). Le informazioni sugli anticorpi sono disponibili in Tabella 1.
    1. Selezionare cinque sezioni per cervello, a 400 μm di distanza, che consentiranno la valutazione di diverse regioni cerebrali a profondità variabili del cervello. Reidratare le sezioni congelate con una goccia di dH2O e stendere e dispiegare il fazzoletto utilizzando due spazzole sottili. Asciugare il fazzoletto sotto un ventilatore per 20-30 minuti. Usando una penna idrofobica (PAP), disegna con cura intorno al tessuto senza toccarlo.
    2. Il giorno 1, preparare il 4% di formaldeide (FA) aggiungendo 5,4 mL di formaldeide in 50 mL di tampone fosfato (PB) 0,1 M per una cuvetta da 50 mL (capacità di 15 vetrini). Immergere i vetrini in FA per 5 minuti per fissare le criosezioni, consentendo l'adesione ai vetrini, e per immobilizzare gli antigeni.
      ATTENZIONE: La FA è infiammabile e può causare irritazione agli occhi, alla pelle e alle vie respiratorie. Preparare una soluzione al 4% in una cabina di biosicurezza e indossare DPI adeguati durante la manipolazione.
    3. Preparare il siero di albumina bovina allo 0,1% (BSA) aggiungendo 0,4 g di BSA a 400 ml di PB 0,1 M. Lavare le sezioni 2 volte immergendole in 0,1 M PB, seguito da un lavaggio in BSA (~3 s per lavaggio). Memorizza le diapositive in
      cuvette contenenti BSA fino al momento del bisogno.
    4. Preparare le camere di umidità bagnando della carta velina con dH2O e posizionarle nella camera, drenando l'acqua in eccesso.
    5. Preparare il 5% di siero di capra (50 μL di siero di capra in 1 mL di 0,1 M PB). Asciugare accuratamente il vetrino attorno alla sezione di tessuto con carta velina, assicurandosi che il bordo della penna PAP sia intatto, quindi applicare 50 μl di soluzione per sezione di tessuto. Incubare nella camera di umidità per 30 min.
    6. Rimuovere il siero picchiettando il vetrino su carta velina pulita e aggiungere l'anticorpo primario diluito in BSA (gli anticorpi e le diluizioni sono presentati nella Tabella 1). Incubare per una notte a 4 oC.
    7. Il giorno 2, incubare l'anticorpo secondario nel siero di topo (vedere Tabella 1) per 30 minuti a 37 oC e aggiungere a BSA (diluizione 1:100) (ad es. 5 ml di BSA + 100 μl di siero di topo + 50 μl di anticorpo secondario).
    8. Lavare i vetrini 2 volte immergendoli (~3 s) in BSA e poi una volta in 0,1 M PB. Tenere i vetrini in cuvette contenenti BSA e tamponare il bordo attorno a ciascuna sezione di tessuto. Applicare 50 μl della soluzione di anticorpi secondari per sezione di tessuto e incubare per 1 ora nella camera di umidità.
    9. Preparare il complesso avidina biotina (ABC) (diluizione 0,1%) aggiungendo 10 μL di A e 10 μL di B in 1 mL di 0,1 M PB. Immergere (~3 s) i vetrini 2 volte in BSA e una volta in 0,1 M PB, quindi posizionare i vetrini in una cuvetta contenente 0,1 M PB. Asciugare i vetrini, applicare 50 μl di soluzione ABC per vetrino e incubare per 1 ora nella camera di umidità.
    10. Preparare la soluzione di diaminobenzidina (DAB). Pesare 25 mg di DAB per cuvetta, sciogliere in 50 mL di 10 mM PB e filtrare con carta da filtro n. 4.
      ATTENZIONE: Il DAB è un pericolo per la salute con possibile mutagenicità e cancerogenicità delle cellule germinali. Indossare DPI adeguati e smaltirli in modo sicuro.
    11. Lavare i vetrini 3 x 3 s con 10 mM di PB e metterli in cuvette contenenti 10 mM di PB. Aggiungere perossido di idrogeno (H2O2) alla soluzione DAB prima di versare immediatamente la soluzione in cuvette fresche (16,7 μl di H2O2 per cuvetta). Spostare i vetrini nelle cuvette DAB e lasciarli agire per ~3 minuti (massimo 5 minuti), controllando costantemente l'intensità della colorazione al microscopio.
      ATTENZIONE: H2O2 può irritare gli occhi, la pelle e la gola. Indossare DPI adeguati.
    12. Lavare i vetrini (3 s) una volta ogni 10 mM PB e 2x in dH2O e lasciare asciugare i vetrini. Immergere i vetrini asciutti 3 volte nello xilene. Applicare una goccia di mezzo di montaggio DPX su un vetrino coprioggetti e posizionarlo sulla sezione di tessuto, facendo attenzione a evitare bolle d'aria.
      ATTENZIONE: Lo xilene e il DPX sono infiammabili e possono causare irritazione agli occhi, alla pelle e alle vie respiratorie. Maneggiare in una cabina di biosicurezza e indossare sempre i guanti durante la manipolazione.
  5. Colorazione Nissl
    1. Il giorno 1, reidratare e distribuire il tessuto in dH2O. Preparare il 4% di FA aggiungendo 5,4 mL di FA in 50 mL di 0,1 M PB e utilizzare immediatamente. Incubare i vetrini in FA al 4% per una notte.
    2. Il giorno 2, spostare i vetrini dal 4% di FA al 70% di etanolo (EtOH) e incubare durante la notte.
    3. Preparare la colorazione di Nissl sciogliendo 4 g di Cresyl Violet in 40 mL di 100% EtOH in una provetta conica chiusa da 50 mL. Capovolgere per 15 minuti, aggiungere la soluzione a 360 ml di dH2O caldo e mescolare su una piastra per mescolare per 20 minuti. Filtrare la soluzione prima dell'uso.
    4. Il giorno 3, seguire la procedura di colorazione descritta nella Tabella 2 e applicare un vetrino coprioggetti alle sezioni di tessuto con DPX.
  6. Marcatura terminale del nick end della desossinucleotidil transferasi dUTP (TUNEL)
    1. Reidratare e stendere il tessuto in dH2O, quindi incubare i vetrini in FA al 4% per 5 minuti. Spostare i vetrini in una soluzione di H2O2 e metanolo (CH3OH) (1:10) e incubare per 15 minuti. Lavare i vetrini per 2 x 3 s in 0,1 M PB e posizionarli in cuvette contenenti 0,1 M PB.
    2. Preparare la soluzione TUNEL con ghiaccio secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere la soluzione ai vetrini (50 μl per sezione di tessuto) e incubare in una camera di umidità a 37 oC per 2 ore.
    3. Dopo 1 ora di incubazione, preparare la soluzione ABC come descritto al punto 2.4.9 e incubare a temperatura ambiente.
    4. Dopo 2 ore, spostare i vetrini nella soluzione TUNEL STOP (300 mM di NaCl, 30 mM di citrato di sodio) per 10 minuti e immergere i vetrini per lavare 3 x 3 s in una soluzione di 10 mM di PBS. Incubare i vetrini in soluzione ABC per 1 ora.
    5. Preparare il solfato di cobalto (1,55 g di CoSO4 anidro in 100 mL di dH2O) e il cloruro di nichel esaidrato (2,38 g di NiCl2·6H2O in 100 mL di dH2O). Preparare la soluzione DAB Co-Ni (10 mM PB + 25 mg di DAB + 1 mL/100 mL di Co + 1 mL/100 mL di Ni). Filtrare la soluzione sottovuoto e tenerla al buio. Immediatamente prima di versare la soluzione DAB nelle cuvette, aggiungere 16,7 μl di H2O2 per cuvetta da 50 mL.
    6. Dopo 1 ora, spostare i vetrini nelle cuvette DAB e incubare per ~3 minuti a temperatura ambiente, controllando costantemente l'intensità della colorazione. Arrestare la reazione spostando i vetrini su cuvette contenenti 10 mM PB. Lavare immergendo 2 x 3 s in dH2O e lasciare asciugare le sezioni di tessuto prima di scivolare con DPX.
  7. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)
    1. Reidratare e stendere il tessuto in dH2O e lasciare asciugare le sezioni all'aria.
    2. Immergere i vetrini nell'ematossilina per 2 minuti.
      ATTENZIONE: L'ematossilina può causare irritazione agli occhi e alla pelle. Indossare DPI adeguati.
    3. Sciacquare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per 5 minuti, decolorarli in alcool acido per 1 s e sciacquare con acqua del rubinetto.
    4. Controcolorante in eosina allo 0,5% (1,5 g disciolti in 300 mL di EtOH al 95%) per 30 s.
      ATTENZIONE: L'eosina è infiammabile e può causare irritazione agli occhi e alla pelle. Preparare le soluzioni in una cabina di biosicurezza e indossare DPI adeguati.
    5. Disidratare le sezioni di tessuto in un gradiente di EtOH: 50%, 70%, 95% e infine 100% EtOH, ciascuna per 3 minuti. Spostare i vetrini nello xilene per 2 x 5 minuti. Vetrino coprioggetti con DPX.

3. Valutazioni istologiche e immunoistochimiche per la neuropatologia e il danno polmonare

NOTA: Le valutazioni possono essere eseguite sulle seguenti regioni: corteccia, corteccia piriforme, capsula esterna, striato, ippocampo e talamo (Figura 2). Per i cervelli E18.5, può essere incluso anche il corpo calloso poiché la differenziazione delle cellule non è ancora completa e le cellule gliali non sono migrate in tutte le regioni cerebrali. Il valutatore dovrebbe essere all'oscuro dei gruppi di trattamento.

  1. Morte cellulare TUNEL+
    1. Utilizzando un microscopio convenzionale, contare le cellule positive per la colorazione TUNEL bilateralmente con un ingrandimento di 20x in tutte le regioni del cervello (Figura 2).
    2. Valuta tre campi ottici selezionati casualmente per regione del cervello e calcola il numero medio di cellule per regione del cervello.
  2. Valutazione morfologica di Nissl
    1. Acquisisci immagini di interi tessuti utilizzando una fotocamera a colori con ingrandimento 1x e salvale come file TIFF o in un altro formato desiderato. Importare le immagini in ImageJ per ulteriori analisi.
    2. Delineare le regioni cerebrali di interesse (ad esempio, corteccia e ippocampo) e misurare utilizzando lo strumento a mano libera (Figura 2).
    3. Per ottenere la misurazione del tessuto, applicare la formula: (mm2 × 400 μm) = volume × 100 (rivisto32).
  3. Indice di ramificazione microgliale
    1. Utilizzando un microscopio con una griglia quadrata di 0,049 mm x 0,049 mm, con un ingrandimento di 40x contare il numero di corpi cellulari IBA-1+ all'interno della griglia (C) e il numero medio di rami che attraversano le linee della griglia (B). Eseguire questa operazione in tre campi selezionati casualmente (vedere la Figura 3) per ciascuna regione del cervello mostrata nella Figura 2.
    2. Utilizzare la formula (B2/ C) per calcolare l'indice di ramificazione microgliale.
  4. Luminosità ottica per l'intensità della colorazione GFAP
    1. Utilizzando il software di riferimento (Tabella dei materiali) e una fotocamera a colori con ingrandimento 40x, è possibile acquisire tre campi selezionati casualmente per ogni regione del cervello (Figura 2). Premere Ctrl+H per ottenere un istogramma che mostra la media e la deviazione standard (SD). Registra i valori medi e SD in un foglio di calcolo. Acquisire un'immagine di controllo solo del vetro circostante (cioè nessun tessuto) e registrare i valori medi e SD come prima
    2. Utilizzare la seguente formula per calcolare i valori di luminosità ottica (OLV) in un foglio di calcolo:
      OLV = (media del vetro − deviazione standard del vetro) − (media di [media per immagine − deviazione standard per immagine])
      NOTA: Ad esempio:
      Vetro circostante
      Media ± SD = 143,5 ± 8,56
      Regione del cervello (ad esempio, corteccia)
      1. 136,7 ± 10,6
      2. 140,6 ± 10,4
      3. 137,4 ± 11,3
      OLV = (143,5 - 8,56) - (media di [136,7 - 10,6], [140,6 - 10,4], [137,4 - 11,3])
      OLV = 134,94 - 127,47
      OLV = 7,47
    3. Calcola la media di ogni valore per regione, per animale e poi per gruppo sperimentale.
  5. Valutazioni della morfologia polmonare
    1. Acquisisci sezioni H&E con un ingrandimento di 40x (tre campi ottici per vetrino, misura gli spazi aerei per campo), salva come TIFF (o equivalente) e importa le immagini in ImageJ. Selezionare casualmente i campi rappresentativi dell'intera sezione polmonare.
    2. Utilizzando lo strumento a mano libera, delineare gli spazi aerei e registrare la misurazione (Figura 4A). Trova la media di tre spazi aerei per campo, quindi tra i tre campi per sezione e, infine, tra le tre sezioni per campione.
  6. Afflusso di neutrofili nei polmoni
    1. Acquisisci immagini campione utilizzando una fotocamera a colori con ingrandimento 40x, tre volte per sezione di tessuto polmonare, e salva il file originale come file TIFF o in un altro formato desiderato. Importa le immagini in ImageJ e conta manualmente i singoli neutrofili in tre campi dello stesso polmone. Calcola la media dei neutrofili per polmone.

Risultati

Questo protocollo presenta un modello murino di infezione vaginale ascendente e descrive i metodi per valutare la neuropatologia neonatale e gli esiti respiratori. La procedura per indurre l'infezione vaginale ascendente dovrebbe essere rapida (entro 5 minuti) e i topi dovrebbero riprendersi entro un paio di minuti. Le dighe hanno sviluppato i sintomi dell'infezione dopo circa 24 ore25. Ciò include movimenti lenti, piloerezione e una postura curva. Il tempo medio approssimativo di consegna nei topi infetti è stato di 40,3 ore dopo la somministrazione di E. coli (media del gruppo di controllo PBS 52,7 ore), verificandosi su E18,5 rispetto alla somministrazione a termine del gruppo di controllo PBS su E19,531. La percentuale di cuccioli nati vivi per cucciolata si è ridotta (dal 100% al 71,4%) con l'infezione, così come la loro sopravvivenza nei 7 giorni successivi alla nascita (Figura 5)25. Quando vengono utilizzati batteri bioluminescenti, l'imaging può tracciare la diffusione dell'infezione nelle madri e nei cuccioli. I batteri sono stati osservati nell'utero, nelle membrane fetali, nella placenta e in alcuni feti entro 18 ore dalla somministrazione (Figura 6) e i mediatori dell'infiammazione, misurati mediante qPCR ed ELISA, erano sovraregolati in questi tessuti, così come nei tessuti perinatali del cucciolo, come il cervello, i polmoni e l'intestino 25,29,31.

Una serie di valutazioni neuropatologiche, come la valutazione della morfologia, della morte cellulare, dell'attivazione microgliale e dell'attivazione degli astrociti, è stata eseguita sui feti e sui neonati utilizzando l'istologia e l'immunoistochimica 25,31,33. Può essere valutato anche il tessuto polmonare (Figura 4 e Figura 7). La colorazione positiva per TUNEL suggerisce la degradazione del DNA, uno stadio successivo della morte cellulare34. Vediamo un aumento significativo della colorazione TUNEL nella corteccia, nella corteccia piriforme, nella capsula esterna, nell'ippocampo e nel talamo nel cervello dei cuccioli esposti all'infezione da E. coli durante la gravidanza (Figura 8A, B)31. Le microglia marcate con IBA-1, le cellule immunitarie residenti nel cervello, possono essere classificate in base al loro stato morfologico, per cui la ramificazione suggerisce un fenotipo a riposo, mentre le cellule attivate e fagocitiche diventano ameboidi o di forma arrotondata35. Pertanto, piuttosto che quantificare le cellule microgliali, presentiamo una strategia per valutare il loro fenotipo come indicazione del loro stato. Vediamo un aumento della ramificazione di IBA1+ nella corteccia esterna e nello striato dei cuccioli di E. coli, rispetto al gruppo PBS (Figura 8C, D)31. Gli astrociti reattivi marcati con GFAP, che possono essere associati a infiammazione e danno neurologico, sono stati aumentati nella corteccia piriforme e nella capsula esterna nei cuccioli di E. coli (Figura 8E,F)31,36,37. La colorazione Nissl consente la valutazione di grossolani cambiamenti morfologici nella struttura del cervello; Il cresil violetto è un colorante istologico standard per i neuroni e marcare sia i granuli di RNA nucleare extra che i nuclei cellulari. Nel gruppo di E. coli, vediamo uno spessore ridotto della corteccia (Figura 9)31. Allo stesso modo, l'H&E, che colorano rispettivamente il nucleo e il citoplasma delle cellule, consente di valutare la morfologia polmonare (Figura 4)31. Vediamo un aumento degli spazi aerei nei topi esposti a E. coli, nonché un aumento del numero di neutrofili Ly6G+, un'indicazione di infiammazione (Figura 7)31.

Per l'analisi dei dati, il tempo di consegna è stato analizzato mediante un t-test non accoppiato se i dati erano distribuiti normalmente. Per i dati percentuali per i cuccioli nati vivi, è stata prima necessaria una trasformazione della radice quadrata arcsine per trasformare una distribuzione di proporzioni (limitata dall'intervallo da 0 a 1) in una distribuzione normale, che è uno dei requisiti per poter eseguire un t-test. La sopravvivenza dei cuccioli è stata analizzata mediante un test Log-rank (Mantel-Cox). Per l'istologia e l'immunoistochimica, sono stati utilizzati il test U di Mann-Whitney o i test t multipli con correzione di Welsh, a seconda del tipo di dati e se sono stati distribuiti normalmente. Per una potenza statistica sufficiente, si consiglia di utilizzare un minimo di cinque dighe per gruppo di trattamento.

figure-results-1
Figura 1: Somministrazione intravaginale di Escherichia coli e tempistica del trattamento per indurre la nascita pretermine e la morbilità neonatale nei topi. (A) E. coli [1], seguito da gel pluronico F127 al 20% [2], viene somministrato nella vagina del topo utilizzando un puntale di pipetta sterile da 200 μl. La polvere di chinino viene aggiunta all'introito [3]. (B) E. coli viene consegnato in vagina il giorno embrionale 16.5. I tessuti, come i polmoni e il cervello, possono essere raccolti durante il periodo fetale o neonatale. Abbreviazione: EN = giorno embrionale N; PN = giorno postnatale N; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Regioni cerebrali valutate per la neuropatologia. Un esempio di colorazione di Nissl del cervello di un cucciolo neonatale e le regioni che potrebbero essere valutate per la neuropatologia. Tutte le regioni del cervello possono essere valutate per TUNEL, IBA-1 e GFAP. Abbiamo scelto di valutare la morfologia della corteccia e dell'ippocampo utilizzando Nissl. Ingrandimento: 1x. Barra della scala = 1,5 mm. Abbreviazioni: TUNEL = marcatura terminale del nick end della desossinucleotidiltransferasi dUTP; IBA-1 = fattore infiammatorio 1 dell'allotrapianto; GFAP = proteina acida fibrillare gliale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Valutazione positiva dell'indice di colorazione e ramificazione IBA-1. Per quantificare l'indice di ramificazione delle cellule IBA-1+ , contare il numero di corpi cellulari all'interno della griglia e il numero medio di rami che attraversano le linee della griglia orizzontale e verticale. Abbreviazione: IBA-1 = fattore infiammatorio 1 dell'allotrapianto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Misurazioni dello spazio aereo nei polmoni dei cuccioli (colorazione H&E). (A) Delineare gli spazi aerei e misurare utilizzando lo strumento a mano libera in ImageJ. (B) L'area media dello spazio aereo è aumentata nei cuccioli esposti a E. coli rispetto al PBS. (C) Immagini rappresentative H&E di polmoni di cuccioli esposti a PBS ed E. coli in utero. Ingrandimento: 40x. Barra della scala = 59,5 μm. Abbreviazioni: H = ematossilina; E = eosina. n = 2 da 4 cucciolate. *P < 0,05. Questa figura è stata adattata da Boyle et al.31. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: Effetti di E. coli intravaginali sul tempo di parto e sulla sopravvivenza dei cuccioli. (A) Il tempo alla consegna è ridotto in presenza di E. coli. (B) La percentuale di cuccioli nati vivi è significativamente ridotta e (C) la sopravvivenza dei cuccioli è ridotta nei cuccioli esposti a E. coli. Tempo di consegna: n = 8-10 cucciolate per gruppo; cuccioli nati vivi: n = 10-17 cucciolate per gruppo; Sopravvivenza dei cuccioli: n = 10-12 cucciolate per gruppo. *p < 0,05, ***p < 0,001. Questa figura è stata adattata da Boyle et al.31. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 6: Imaging a bioluminescenza per monitorare la diffusione di E. coli . (A) E . coli bioluminescente sale dalla vagina alle corna uterine entro 48 ore. (B) Le corna uterine sezionate mostrano un'infezione da E. coli entro 18 ore, (C) così come la placenta e le membrane fetali. Questa figura è stata adattata da Suff et al.25 e Boyle et al.31. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Colorazione con Ly6G per neutrofili nei polmoni fetali. (A) Colorazione per Ly6G (positivo: punte di freccia), per valutare l'afflusso di neutrofili, in feti esposti a PBS ed E. coli . (B) Il numero medio di cellule Ly6G+ è significativamente aumentato nei feti di E. coli . Ingrandimento: 40x. Barra della scala = 59,5 μm. n = 10 da 5 cucciolate per gruppo. *P < 0,05. Abbreviazioni: Ly6G = Complesso dell'antigene linfocitario 6 locus G6D. Questa figura è stata adattata da Boyle et al.31. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Esempi di colorazione TUNEL, IBA1 e GFAP. (A) Colorazione TUNEL per la morte cellulare nel cervello del cucciolo postnatale esposto a PBS o E. coli. (B) Il numero medio di cellule TUNEL+ è aumentato nella corteccia, nella corteccia piriforme, nella capsula esterna, nell'ippocampo e nel talamo. (C) Immunoistochimica IBA1 per microglia nei gruppi PBS ed E. coli . (D) L'indice di ramificazione, come misura dell'attivazione della microglia, è aumentato nella capsula esterna e nello striato nei cuccioli di E. coli . (E) colorazione GFAP per gli astrociti, (F) che è aumentata nella corteccia piriforme e nella capsula esterna nei cuccioli di E. coli . Barra di scala = 59,5 μm. Abbreviazioni: GFAP = proteina acida fibrillare gliale; TUNEL = marcatura terminale del nick end della desossinucleotidil transferasi dUTP; Pyr = Corteccia piriforme; EC = capsula esterna; Str = striato; Anca = ippocampo; thal = talamo; totale = tutte le regioni; CA = cornu ammonis; OLV = valori di luminosità ottica. Analisi immunoistochimiche: n = 5-7 da 5 cucciolate per gruppo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, n.s. - non significativo. Questa figura è stata adattata da Boyle et al.31. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-9
Figura 9: Esempio di colorazione di Nissl positiva e negativa e valutazioni morfologiche. (A) Colorazione di Nissl del cervello del cucciolo postnatale per valutare la struttura e la morfologia dei tessuti. (B) Non vi è alcun impatto sulla larghezza del cervello, ma (C) lo spessore corticale è ridotto nei cuccioli esposti a E. coli. (D) Non c'è differenza nel volume dell'ippocampo. Ingrandimento: 1x. Barra della scala = 1,5 mm. n = 5-7 da 5 cucciolate per gruppo. **p < 0,01. Questa figura è stata adattata da Boyle et al.31. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Anticorpi primariDiluizioneAnticorpo secondario/DiluizioneDiluizione
Coniglio anti-GFAP1:6000Capra anti-coniglio1:100
Coniglio anti-IBA11:1000Capra anti-ratto1:100
Mouse anti-Ly6G1:1000Capra anti-coniglio1:100

Tabella 1: Anticorpi per l'immunoistochimica.

PassoReagenteTempo (min)
1Colorazione NISSL10
2Acqua distillata fresca2
3Acqua distillata fresca2
470% EtOH2
590% EtOH2
696% EtOH2
796% di EtOH con 3-5 gocce di acido acetico glaciale2-5 (CONTROLLARE COSTANTEMENTE)
8100% EtOH2
9Isopropanolo2
10Xilene2
11Xilene2
12Xilene2

Tabella 2: Procedura di Nissl.

Discussione

Qui, descriviamo l'induzione di un nuovo modello murino di parto pretermine e morbilità neonatale attraverso l'ascensione vaginale batterica. Abbiamo scelto E. coli K1 in quanto è una causa comune di sepsi neonatale e meningite ed è trasmesso verticalmente dalla madre al feto 38,39,40. La chiave del successo di questo modello è l'uso del gel termosensibile Pluronic, che impedisce la fuoriuscita della sospensione batterica dalla vagina, consentendo all'infezione di stabilirsi e risalire all'utero. Poiché questo modello utilizza batteri vivi derivati da un isolato di setticemia, è fondamentale monitorare attentamente le dighe27. Se gli animali si rifiutano di muoversi o di mangiare o non si prendono cura dei loro cuccioli (ad esempio, trascurano la nidificazione e l'alimentazione), devono essere sacrificati in modo umano immediatamente.

Nella maggior parte dei casi, i sintomi associati all'infezione si dissipano entro 24 ore dal parto. È inoltre essenziale essere consapevoli del fatto che diversi sierotipi di E. coli e di altri ceppi di batteri avranno effetti variabili sulla durata gestazionale, sull'entità dell'infezione/infiammazione e sull'esito neonatale. Suggeriamo di eseguire esperimenti preliminari di dose con diverse CFU quando si utilizzano nuovi sierotipi/ceppi batterici per determinare la concentrazione minima necessaria per il fenotipo desiderato e di stabilire rigorosi endpoint umani per prevenire la sofferenza. Estrema cautela deve essere usata quando si somministra un agente patogeno vivo; consentire alla letteratura di guidare l'uso appropriato di questi organismi nella modellazione dell'infezione ascendente.

Anche il ceppo di topo è importante, poiché il loro sistema immunitario differisce. Ad esempio, la temporizzazione e i CFU utilizzati in questo modello non hanno gli stessi risultati quando eseguiti nei topi C57BL/6. Abbiamo scelto di utilizzare i topi C57BL/6 Tyrc-2J poiché gli esperimenti sul decorso temporale hanno mostrato un'infezione significativamente maggiore in questo ceppo rispetto a CD-1, BALB/c e C57BL/6. Inoltre, ci sono prove di segnali bioluminescenti di estinzione della pelliccia nera, che è un utile risultato misurabile in questo modello29. Il giorno gestazionale ottimale per la somministrazione batterica può anche differire a seconda dell'agente patogeno e del ceppo di topo. C'è un'enorme eterogeneità nei modelli preclinici di PTB; Pertanto, è importante considerare queste variabili al fine di sviluppare risultati riproducibili17.

Un'altra considerazione è il periodo di tempo in cui gli animali sono esposti all'anestesia. Poiché un'esposizione eccessiva durante la gravidanza è associata a neurotossicità nei cuccioli, è essenziale mantenere il tempo trascorso sotto anestesia al minimo (es. massimo 5 minuti) e includere sempre controlli esposti allo stesso ambiente e trattati con una sostanza veicolare 41,42,43. Ulteriori gruppi di controllo utili per questo modello includono la somministrazione intravaginale non trattata di solo gel pluronico e solo l'anestesia.

L'immunoistochimica è ampiamente utilizzata come strumento sperimentale per identificare diverse proteine e cellule e può essere utilizzata per caratterizzare la struttura e la connettività nel cervello. Qui, descriviamo come analizzare le cellule chiave del sistema nervoso centrale associate alla neuroinfiammazione e al danno neurologico. Presentiamo anche metodi per valutare l'apoptosi cellulare e le colorazioni istologiche utili per misurare la morfologia cerebrale e polmonare. Considerazioni importanti per garantire il successo di questi protocolli iniziano con l'uso attento della penna PAP; se la PAP pen tocca il tessuto, la colorazione fallirà, ma se il parametro è troppo largo, le sezioni potrebbero asciugarsi durante la notte. Allo stesso modo, la camera di umidità deve essere mantenuta umida per evitare di seccare le sezioni.

Quando si esegue la colorazione di Nissl, la fase dell'acido acetico glaciale è la più critica; Le sezioni devono essere controllate costantemente. Quando le strutture principali del cervello diventano visibili, le sezioni devono essere spostate immediatamente in EtOH per fermare la reazione. Abbiamo scelto di valutare la corteccia e l'ippocampo, poiché lo spessore corticale ridotto e il volume dell'ippocampo sono stati riportati nei neonati prematuri umani e in altri modelli animali, ma altre regioni potrebbero essere valutate per i cambiamenti morfologici 44,45,46,47. Particolare attenzione deve essere prestata anche allo sviluppo della colorazione DAB. Questo dovrebbe essere cronometrato e mantenuto coerente tra gli esperimenti.

L'analisi dei dati è il limite più comune dell'immunoistochimica a causa della difficoltà di quantificare i risultati, che sono spesso considerati soggettivi. Sebbene l'analisi GFAP venga eseguita utilizzando misurazioni della luminosità ottica assistite da computer, una colorazione incoerente può influire su queste misurazioni. Inoltre, le valutazioni della morfologia cerebrale e polmonare comportano misurazioni manuali a mano libera basate sul giudizio dell'osservatore. Per evitare incoerenze, ripetiamo queste valutazioni due volte e in un breve periodo di tempo. Per ridurre ulteriormente qualsiasi pregiudizio, è importante che il valutatore sia all'oscuro dei gruppi di trattamento. Anche una bassa immunoreattività può essere un fattore limitante. La mancanza di segnale potrebbe suggerire che l'antigene di interesse è assente o potrebbe essere dovuto a un errore del protocollo. Per risolvere questo problema, includiamo un campione di tessuto che può fungere da controllo positivo, ove possibile, e ripetiamo la procedura di colorazione quando osserviamo un segnale basso o assente per assicurarci che questo non sia il risultato di un errore sperimentale.

Oltre ai protocolli descritti, le analisi immunologiche dei tessuti materni, fetali e neonatali possono essere eseguite mediante qPCR ed ELISA. Abbiamo osservato un aumento dei livelli di mRNA e proteine infiammatorie negli animali esposti all'infezione 25,31,48. Ipotizziamo che la neuropatologia neonatale che dimostriamo istologicamente potrebbe essere il risultato di un'infiammazione fetale del cervello, del polmone e dell'intestino25,31. Altre valutazioni neuropatologiche che abbiamo eseguito includono la proteina basica della mielina (MBP) per studiare la mielinizzazione e NeuN per colorare i nuclei neuronali25,31. Oltre a ciò, altri marcatori possono essere valutati per i neutrofili e la microglia per comprendere meglio il fenotipo e il comportamento di queste cellule dopo l'esposizione all'infezione in utero49,50. Inoltre, potrebbero essere eseguiti test comportamentali per determinare l'impatto a lungo termine sulla prole.

Questo modello non è privo di limitazioni. Ad esempio, vediamo variazioni nella patologia sia tra le cucciolate che all'interno di esse. Questo potrebbe essere il risultato dell'utilizzo di un batterio vivo, in cui la diffusione dell'infezione non può essere controllata. Di conseguenza, il modello e la portata dell'infezione ascendente nelle corna uterine variano e sono spesso asimmetrici. Un'altra limitazione è la patogenicità dell'E. coli, che a volte può far sì che le madri si ammalino troppo per prendersi cura dei loro cuccioli. I topi non sono nemmeno il miglior modello di danno polmonare, a causa dell'alveologenesi che avviene dopo la nascita, piuttosto che in prenatale, come negli esseri umani51. Non siamo riusciti a gonfiare i nostri tessuti polmonari quando sono stati raccolti i campioni, il che avrebbe potuto influire sui nostri risultati. Tuttavia, i nostri risultati sono coerenti con i cambiamenti osservati nei modelli animali neonatali di BPD52,53.

Questo modello ricapitola la condizione umana postulata in base alla quale l'infezione batterica sale dalla vagina all'utero, stimolando il parto precoce. Dopo la nostra pubblicazione iniziale di questo modello, altri hanno replicato o prodotto modelli simili, sottolineando ulteriormente la riproducibilità e la rilevanza di questa metodologia19,54. Fondamentalmente, questo modello mostra le morbilità comuni sperimentate dai neonati prematuri, dove altri modelli hanno fallito. Ciò potrebbe essere dovuto all'uso di un ceppo batterico specificamente associato alla sepsi neonatale. L'LPS, che è più comunemente usato per indurre il travaglio pretermine nei modelli animali, è letale per i cuccioli, quindi gli esiti neonatali non possono essere misurati18. Anche altri modelli di infezione ascendente hanno faticato a produrre cuccioli sopravvissuti o a dimostrare la morbilità neonatale 19,20,21,22,23,24,55,56. Modelli animali clinicamente rilevanti, come quello che descriviamo, sono fondamentali per comprendere la fisiopatologia della nascita pretermine e per sviluppare interventi innovativi che miglioreranno gli esiti neonatali.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno divulgazioni rilevanti.

Ringraziamenti

Escherichia coli K1 A192PP-luxABCDE è stato gentilmente donato dal professor Peter Taylor, University College London. La Figura 1 e la Figura 3 sono state create nel BioRender.com. Questa ricerca è stata supportata dalla Wellcome Clinical Research Career Development Fellowship 222970/Z/21/Z (N.S.), Action Medical Research e dalla sovvenzione Borne GN2647 (N.S., S.N.W. e D.P.); e Benessere delle donne sovvenzione RG2365 (A.K.B., N.S., M.H., S.N.W. e D.P.).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anti-GFAP, coniglioTecnologie AgilentZ033429-2
Anti-IBA1, rabbit Wako019-19741
Anti-Ly6G, mouseBioLegend127601
Fotocamera AVT-Horn 184 3CCDSony
Biotina-16-DUTPMerck11093070910
Coperture rettangolari in vetro borosilicatoFisherScientific12363128
Acetato di violetta cresylThermoFisher Scientific405760100
Criostato CM1900Leica
Cuvette di vetro  MerckBR472700
Diaminobenzidina (DAB)Generon40480004-3
Pinza dissezionante, acciaio inox, 10 cm, seghettata, curvaWorld Precision Instruments Ltd15915
Pinza dissezionale, acciaio inossidabile, 10 cm, seghettata, drittaWorld Precision Instruments Ltd15914
Forbici dissezionali, lunghe 10 cm, dritteWorld Precision Instruments Ltd14393
DPX Merck100579
EosinaSigma-AldrichHT110116
Soluzione formaldeide al 4% tamponataMerck100496
Anticorpo Anti-Coniglio IgG (H+L), BiotinilatoLaboratori VectorBP-9100-50
Anticorpo Anti-IgG di Capra (H+L), BiotinilatoLaboratori VectorBA-9400-1.5
GraphPad Prism v.8 GraphPad Software
H2O2Sigma-Aldrich7722-84-1
EmatossilinaSigma-AldrichMHS16
ImageJIstituti Nazionali di Salute
Isoflurano (IsoFlo)Zoetis50019100
Sistema di imaging in vivo IVIS Lumina II/Software per immagini vivePerkin Elmer/Revvity
MicrodiapositiveVWRISO8037/I
Optimas 6.51 Media Cybernetics Inc.
ParaformaldeideSigma-Aldrich158127
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e nbsp;Thermo Fisher Scientific (Tecnologie della Vita)14190094
Pluronic F-127 Sigma-AldrichP2443
ChininoForniture per laboratorio scientificoQ0132
ReadyProbes Barriera idrofobica Pap PenThermo Fisher Scientific R3777
Idrossido di sodioHoneywellS8045
Fosfato di sodio monobasico anidroFisherScientificBP329-1
SucrosioMerckS9378
Terminal transferase Merck3333574001
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, PeroxidasiLaboratori VectorPK-4000
Xileni (grado istologico) Sigma-Aldrich534056

Riferimenti

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