Sviluppo di un elettrodo per elettromiografia epimisiale a basso costo: un flusso di lavoro semplificato per la fabbricazione e il collaudo

Summary

Il nostro scopo era quello di fornire una guida aggiornata e facile da seguire sulla fabbricazione e il collaudo degli elettrodi per elettromiografia epimisiaca. A tal fine, forniamo istruzioni per l'approvvigionamento dei materiali e una panoramica dettagliata del processo di fabbricazione e test.

Abstract

L'elettromiografia (EMG) è un prezioso strumento diagnostico per rilevare le anomalie neuromuscolari. Gli elettrodi epimisiali impiantabili sono comunemente usati per misurare i segnali EMG nei modelli preclinici. Sebbene esistano risorse classiche che descrivono i principi della fabbricazione di elettrodi epimisiali, c'è una scarsità di informazioni illustrative che traducono la teoria degli elettrodi in pratica. Per rimediare a questo problema, forniamo una guida aggiornata e facile da seguire sulla fabbricazione e il test di un elettrodo epimisiale a basso costo.

Gli elettrodi sono stati realizzati piegando e inserendo due lamine di platino-iridio in una base di silicone pretagliata per formare le superfici di contatto. Successivamente, i fili di acciaio inossidabile rivestiti sono stati saldati su ciascuna superficie di contatto per formare i cavi degli elettrodi. Infine, è stata utilizzata una miscela di silicone per sigillare l'elettrodo. Sono stati condotti test ex vivo per confrontare il nostro elettrodo fabbricato su misura con un elettrodo standard del settore in un bagno salino, dove sono stati riscontrati alti livelli di concordanza del segnale (seno [correlazione intraclasse - ICC= 0,993], quadrato [ICC = 0,995], triangolo [ICC = 0,958]) e sincronia temporale (seno [r = 0,987], quadrato [r = 0,990], triangolo [r = 0,931]) in tutte le forme d'onda. Bassi livelli di impedenza degli elettrodi sono stati quantificati anche tramite spettroscopia di impedenza elettrochimica.

È stata inoltre condotta una valutazione delle prestazioni in vivo in cui il muscolo vasto laterale di un ratto è stato strumentato chirurgicamente con l'elettrodo fabbricato su misura e la segnalazione è stata acquisita durante la camminata in salita e in discesa. Come previsto, il picco di attività EMG è stato significativamente inferiore durante la camminata in discesa (0,008 ± 0,005 mV) rispetto alla salita (0,031 ± 0,180 mV, p = 0,005), supportando la validità del dispositivo. L'affidabilità e la biocompatibilità del dispositivo sono state supportate anche da una segnalazione costante durante la camminata a livello a 14 giorni e 56 giorni dopo l'impianto (0,01 ± 0,007 mV, 0,012 ± 0,007 mV rispettivamente; p > 0,05) e dall'assenza di infiammazione istologica. Collettivamente, forniamo un flusso di lavoro aggiornato per la fabbricazione e il collaudo di elettrodi epimisici a basso costo.

Introduction

L'elettromiografia (EMG) è un potente strumento per studiare l'attività elettrica del muscolo. Le registrazioni EMG possono essere particolarmente utili nei modelli animali preclinici per valutare l'efficacia degli interventi per il trattamento della disfunzione neuromuscolare. In questi modelli, gli elettrodi biocompatibili impiantabili sono comunemente usati per valutare l'interfaccia neurofisiologica tra motoneuroni e fibre muscolari. Questi elettrodi impiantabili possono fornire misurazioni localizzate dell'eccitazione muscolare e possono essere diversi in termini di configurazione, forma e materiale, con il design ottimale dettato in ultima analisi dalla posizione e dall'uso previsto.

Nonostante la loro idoneità per valutare l'eccitazione muscolare nei modelli preclinici, l'uso di elettrodi epimisiali può essere limitato dal costo. Di conseguenza, molti ricercatori utilizzano elettrodi epimisici fabbricati su misura che vengono prodotti internamente. Sebbene esistano risorse che descrivono in dettaglio le considerazioni fondamentali della fabbricazione, del test e dell'uso degli elettrodi ^1,2, è necessaria una guida didattica aggiornata che descriva in dettaglio l'approvvigionamento, la fabbricazione e la convalida degli elettrodi epimisici utilizzando metodi moderni. Sulla base dei lavori fondamentali di Loeb e Gans³ e di altri nella teoria degli elettrodi, presentiamo istruzioni moderne sull'approvvigionamento e la fabbricazione di elettrodi epimisici a basso costo e testiamo le loro prestazioni in una serie di esperimenti ex vivo e in vivo. L'obiettivo è quello di offrire una guida di facile utilizzo per gli altri membri della comunità scientifica per reperire, fabbricare e testare internamente elettrodi epimisici a basso costo per uso animale, consentendo la più ampia quantificazione dell'eccitazione muscolare nei modelli preclinici.

In questo protocollo, forniamo una guida didattica per l'approvvigionamento, la fabbricazione e il test di elettrodi epimisiali per uso animale nel moderno laboratorio di elettrofisiologia. I parametri dell'elettrodo scelti per la fabbricazione, come la forma, le dimensioni, l'area della superficie di contatto, la distanza tra gli elettrodi, la lunghezza dell'elettrocatetere e così via, sono stati selezionati per soddisfare le nostre esigenze sperimentali ed erano paragonabili a un elettrodo epimisiale standard del settore disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali). Incoraggiamo altri gruppi a modificare questi parametri in base alle loro esigenze, oltre a selezionare un elettrodo standard del settore affidabile che corrisponda al loro caso d'uso.

Nel tentativo di dare ai lettori un'idea relativamente rapida delle prestazioni dell'elettrodo, forniamo anche un esempio di un protocollo di test ex vivo con l'opzione di misurare l'impedenza dell'elettrodo. Inoltre, forniamo un esempio di valutazione delle prestazioni degli elettrodi in vivo. L'esperimento ex vivo ha confrontato l'elettrodo fabbricato su misura con uno standard industriale in un bagno salino per imitare condizioni fisiologiche stabili. L'impedenza è stata valutata anche ex vivo tramite spettroscopia di impedenza elettrochimica (EIS). L'esperimento in vivo consisteva nell'impianto chirurgico dell'elettrodo fabbricato su misura nel muscolo vasto laterale (VL) di una femmina di ratto Long Evans di 16 settimane (HsdBlu: LE, Envigo) per misurare il segnale EMG durante condizioni note per suscitare un segnale alto o basso (camminata in salita, in discesa). Per valutare l'affidabilità dell'elettrodo fabbricato su misura, la segnalazione EMG è stata acquisita durante la camminata a livello dopo il completo recupero chirurgico e prima del sacrificio (rispettivamente 14 giorni e 56 giorni dopo l'impianto). La colorazione con ematossilina-eosina (H&E) è stata condotta sul muscolo strumentato per valutare la biocompatibilità dell'elettrodo fabbricato su misura.

Protocol

La procedura in vivo è stata condotta sotto l'approvazione dell'Institutional Animal Care & Use Committee dell'Università del Michigan (IACUC approval #PRO00010765) e in conformità con le linee guida del National Institutes of Health sulla cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Approvvigionamento e fabbricazione di elettrodi

NOTA: La Figura 1 fornisce un riepilogo di alto livello di tutte le fasi chiave della fabbricazione con un collegamento QR che fornisce ulteriori istruzioni visive.

1. Procuratevi materiali biocompatibili per elettrodi direttamente dal produttore per la fabbricazione. Vedere la tabella dei materiali, che contiene tutti i componenti degli elettrodi e i dettagli sull'approvvigionamento.
   NOTA: Assicurarsi che la base in silicone, il sigillante siliconico e le lamine di contatto in platino-iridio siano biocompatibili per evitare una risposta immunitaria avversa e consentire l'impianto cronico. Per supportare i vantaggi economici della fabbricazione interna, presentiamo un'analisi dettagliata dei costi dell'elettrodo epimisiale realizzato su misura rispetto allo standard del settore (Tabella dei materiali).
2. Preparare la maschera di taglio e piegatura (File supplementare 1, File supplementare 2). Utilizza un software di stampa 3D selezionato per progettare maschere di taglio e piegatura per la produzione in batch di elettrodi epimisiali identici.
   1. Progettare la dima di taglio in modo da garantire perforazioni di dimensioni e spaziature costanti della base in silicone per un'area di contatto e una distanza tra gli elettrodi uguali su tutti gli elettrodi.
   2. Crea la dima di piegatura per piegare le superfici di contatto platino-iridio e semplificare il posizionamento delle lamine nella base in silicone.
      NOTA: Vengono forniti file Gcode; Modificare le dimensioni e le specifiche della dima di taglio e piegatura in base alle esigenze sperimentali.
3. Forare la base in silicone. Posizionare la base in silicone sulla maschera di taglio e fissarla con del nastro adesivo. Forare il silicone utilizzando le guide nella maschera di taglio utilizzando un coltello X-acto per il posizionamento delle lamine di contatto.
4. Inserire le lamine nella base in silicone per formare le superfici di contatto. Piegare le lamine di contatto biocompatibili e pretagliate in platino-iridio (1,25 mm x 5 mm) a forma di U utilizzando la maschera di piegatura. Quindi, guidare i bracci delle lamine piegate nelle fessure perforate nella base in silicone per costruire le superfici di contatto dell'elettrodo. In questo modo, inserire tutte e 12 le lamine nella base in silicone; Lasciare una singola colonna aperta tra gli elettrodi per garantire una spaziatura adeguata.
   NOTA: Questa configurazione consentirà la fabbricazione di 6 elettrodi epimisiali bipolari; La modifica della maschera di taglio può espandere la capacità, se necessario.
5. Rimuovere la base in silicone dalla maschera di taglio. Posiziona un pezzo di nastro chirurgico sulle superfici di contatto per tenere le lamine in posizione. Quindi, rimuovere la base in silicone dalla maschera di taglio, capovolgerla in modo che i bracci della pellicola a forma di U siano esposti e piegare un braccio della lamina a forma di U a filo con la base in silicone.
6. Collegare i cavi degli elettrodi. Preparare un filo di acciaio inossidabile rivestito di perfluoroalcossi (PFA) tagliandolo alla lunghezza desiderata. Quindi, denudare un'estremità del filo di acciaio inossidabile di ~ 1 cm utilizzando un accendino disponibile in commercio. Posizionare l'estremità denudata del filo di acciaio inossidabile all'interno del braccio aperto della pellicola. Saldare il filo di acciaio inossidabile al braccio della lamina utilizzando una saldatrice Micro TIG (larghezza dell'impulso = 0, energia di saldatura = 25).
7. Ispezionare l'interfaccia piombo-lamina. Testare il collegamento in lamina di filo applicando tensione al filo di acciaio inossidabile. Se la connessione regge, piegare il braccio della pellicola verso il basso a filo con la base in silicone e rimuovere il nastro che delimita il foglio di silicone.
   NOTA: Applicare una tensione rappresentativa della tensione applicata nel caso d'uso specificato.
8. Sigillare l'elettrodo. Per ottenere una consistenza più sottile, mescolare 1 g di silicone liquido biocompatibile con 0,75 ml di toluene. Prelevare la miscela con una siringa a punta smussata da 18 G e applicarla sul lato saldato di ciascun elettrodo per sigillare la parte posteriore degli elettrodi.
   ATTENZIONE: Il toluene è infiammabile, può essere fatale se ingerito o entra nelle vie respiratorie e provoca irritazione della pelle. Lavorare sotto la cappa aspirante e tenerli lontani da fiamme libere.
9. Separare il lotto in singoli elettrodi. Lasciare agire il silicone-toluene per 72 ore prima di maneggiare l'elettrodo. Quindi, usa le forbici per tagliare la base in silicone in singoli elettrodi con una dimensione di 10 x 5 mm.
   NOTA: Le dimensioni dell'elettrodo dipendono dalle dimensioni della maschera di taglio e dal caso d'uso specifico. Autoclavare e/o pulire gli elettrodi in un bagno ad ultrasuoni.

Figura 1. Fasi per la fabbricazione degli elettrodi. (A) Perforare la base in silicone. (B) Formare lamine a forma di U utilizzando la dima di piegatura. (C) Inserire le lamine a forma di U nella base in silicone perforato. (D) La base in silicone contiene 12 lamine per formare 6 elettrodi bipolari. (E) Applicare del nastro chirurgico alla base per fissare le lamine durante la rimozione dalla maschera di taglio. (F) Rimuovere la base in silicone dalla maschera di taglio. (G) Denudare il filo di acciaio inossidabile rivestito in PFA e saldarlo al braccio verticale utilizzando una saldatrice Micro TIG. (H) Allineare i fili denudati, applicare il sigillante siliconico-toluene e lasciare solidificare. (I) Dividere la base in silicone in singoli elettrodi e pulirla in un bagno a ultrasuoni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Test ex vivo

1. Collegare gli elettrodi a un dispositivo di registrazione. Fissare ciascun filo conduttore dell'elettrodo a un canale su una scheda di interfaccia dell'elettrodo (EIB). Ripetere questo passaggio (utilizzando lo stesso EIB) per un elettrodo standard del settore selezionato per il confronto. Collegare l'EIB a una piattaforma di acquisizione dati tramite un sistema di cavi magnetici legati.
   NOTA: L'elettrodo standard del settore può essere qualsiasi elettrodo ritenuto affidabile e adatto alle esigenze sperimentali.
2. Mettere a terra la BEI. Denudare un'estremità di un acciaio inossidabile rivestito in PFA e saldare a punti a una fonte di messa a terra (ad esempio, una vite in acciaio inossidabile). Fissare il cavo di terra alla stessa scheda di interfaccia dell'elettrodo nella posizione di "terra" designata.
3. Prepara il bagno salino. Riempire un becher di vetro (250 mL) con 180 mL di soluzione salina fisiologica (soluzione salina sterile allo 0,9%)⁴. Immergere gli elettrodi epimisici fabbricati su misura e standard del settore nel bagno salino e fissarli in una posizione stabile. Quindi, immergere la fonte di messa a terra nel bagno salino e fissarne la posizione. Infine, immergere e fissare due elettrodi ad ago stimolanti nel bagno salino e collegare gli elettrodi stimolanti al generatore di segnale.
4. Utilizzare un generatore di segnali per valutare l'accordo del segnale e la sincronia temporale. Utilizzare un generatore di segnali per erogare forme d'onda ripetute a una tensione e frequenza selezionate (0,1 V e 5 Hz) nel bagno salino tramite gli elettrodi stimolanti (Figura 2). Fornisci varie forme d'onda (sinusoidale, quadrata e triangolare) per confrontare i segnali registrati tra l'elettrodo epimisiale fabbricato su misura rispetto allo standard del settore.
5. Valuta le prestazioni in modo informale e visivo in tempo reale per valutare il grado di variazione dei segnali tra gli elettrodi. Eseguire correlazioni intra-classe (ICC) e correlazioni di Pearson per valutare rispettivamente l'accordo del segnale e la sincronia temporale.
   NOTA: Ai fini della nostra analisi, sono stati acquisiti 8.000 campioni a 4.000 Hz e filtrati in tempo reale con un filtro Butterworth passa-alto e passa-basso (passa-alto = 75 Hz; passa-basso = 2 kHz).
6. Misurare l'impedenza dell'elettrodo. Per misurare l'impedenza dell'elettrodo, raccogliere l'EIS sugli elettrodi fabbricati su misura (ad esempio, 10 elettrodi) su frequenze 10 Hz-31 kHz⁵ con un potenziostato utilizzando la procedura descritta di seguito da Richie et al.⁶. Vedere Sarolic et al. per ulteriori informazioni sulla misurazione dell'impedenza degli elettrodi su elettrodi bipolari⁷.
7. Seguendo la procedura di Richie et al., immergere l'elettrodo epimisiale di 1 mm in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Utilizzare un cloruro d'argento-argento (Ag|AgCl) e un'asta in acciaio inox come controelettrodo per completare il circuito.
8. Sospendi l'Ag|L'elettrodo di riferimento AgCl e l'asta in acciaio inossidabile nel PBS 1x utilizzando un morsetto a bicchiere. Collegare l'elettrodo di riferimento al riferimento del sistema di impedenza in uso e collegarlo all'ingresso del controelettrodo del sistema di impedenza in uso.
9. Utilizzare un potenziostato per eseguire una scansione di impedenza a 1 kHz. Impostare su una frequenza di scansione di 1 kHz a 0,01 V_rms in una singola forma d'onda sinusoidale. Durante i primi 5 secondi della scansione, impostare il potenziostato su 0 V per stabilizzare il segnale registrato. Utilizzare il software associato al potenziostato per registrare le misurazioni.

Figura 2: Test ex vivo : bagno salino contenente l'elettrodo fabbricato su misura, elettrodi standard industriali, due elettrodi stimolanti e una sorgente di terra. L'accordo del segnale e la sincronia temporale sono state valutate erogando onde sinusoidali, quadrate e triangolari nel bagno salino dal generatore di segnale e registrando le forme d'onda rilevate dai rispettivi elettrodi utilizzando una piattaforma di acquisizione dati. NOTA: La spettroscopia di impedenza elettrochimica non è raffigurata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Test in vivo

NOTA: La procedura di test in vivo descrive il nostro caso d'uso sperimentale. Si raccomanda di testare in vivo gli elettrodi epimisici fabbricati su misura in modo che corrispondano alle condizioni sperimentali previste dall'utente.

1. Rivedere le informazioni chirurgiche; Consultare le informazioni per i chirurghi che stanno imparando il processo di impianto di elettrodi di registrazione neurale cronica utilizzando le seguenti risorse ^8,9.
   NOTA: Dato che l'obiettivo del nostro manoscritto è la fabbricazione e il test degli elettrodi, qui forniamo solo una breve panoramica delle tecniche chirurgiche utilizzate nel nostro laboratorio per i test degli elettrodi in vivo .
2. Selezionare un ratto da strumentare (ad esempio, una femmina di ratto Long Evans a 16 settimane di età). Sottoporre il ratto a un periodo di acclimatazione di laboratorio di 1 settimana prima dell'acclimatazione al tapis roulant. Dopo l'acclimatazione in laboratorio, esporre gradualmente il ratto a un tapis roulant per roditori a velocità crescenti fino a 16 m/min.
3. Preparare l'EIB collegando prima un elettrodo epimisiale fabbricato su misura all'EIB fissando ciascun elettrodo a un canale sull'EIB. Per mettere a terra l'EIB, denudare un'estremità di un filo di acciaio inossidabile rivestito in PFA e saldare a punti su una messa a terra selezionata (ad es. vite in acciaio inossidabile). Quindi, fissare il cavo di terra allo stesso EIB nella posizione di "terra" designata.
   NOTA: Per proteggere l'elettrodo durante la strumentazione, avvolgerlo con una copertura protettiva (ad es. parafilm).
4. Disinfettare tutti gli strumenti chirurgici e l'area chirurgica prima di iniziare. Utilizzare forniture chirurgiche sigillate e asettiche e sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici che non sono in confezione sterile. Crea un campo chirurgico sterile utilizzando un telo chirurgico.
5. Anestetizzare l'animale utilizzando una camera di induzione con isoflurano al 3-5% e 1 L/min di ossigeno e mantenere il sistema attraverso un cono nasale con isoflurano al 2% e 500 ml di ossigeno durante la preparazione del ratto. Dopo aver raggiunto il piano chirurgico dell'anestesia, valutare tramite pizzicamento delle dita, applicare un unguento oculare, monitorare la frequenza respiratoria (70-110 respiri/min) e valutare la temperatura interna utilizzando una sonda rettale.
6. Quindi, radere il sito chirurgico con un tagliaunghie per animali e rimuovere i detriti dal sito chirurgico. Una volta rasata l'area chirurgica, disinfettare il sito chirurgico con clorexidina, alcol isopropilico e iodio povidone strofinando dal centro verso l'esterno dell'area chirurgica. Somministrare analgesici appropriati e approvati e fornire calore per mantenere la temperatura corporea interna (37,5-38,5 °C). Dopo la preparazione, posizionare il ratto in un quadro stereotassico e stabilire il campo sterile.
7. Per una corretta preparazione chirurgica del chirurgo, lavare accuratamente le mani con sapone e/o un disinfettante (clorexidina). Indossa DPI adeguati: maschera, guanti sterili e un camice/top monouso. Indossare nuovi guanti sterili se la tecnica asettica viene violata per qualsiasi motivo.
8. Per instrumentare il VL destro, utilizzare un bisturi per praticare un'incisione di 3-5 cm sulla porzione anterolaterale dell'arto posteriore destro e utilizzare la dissezione smussata per identificare il muscolo VL.
9. Praticare un'incisione sul piano sagittale di 1 cm lungo la sutura coronale ed esporre il cranio. Usando un paio di pinze sottili, crea un tunnel sottocutaneo dall'arto posteriore destro alla base del cranio. Usa la pinza per afferrare l'elettrodo e instradare l'elettrodo verso il VL.
10. Utilizzare un trapano per ossa per creare un foro nella calvaria (assicurarsi che le specifiche del trapano corrispondano a quelle della vite di messa a terra). Fissare la vite di messa a terra e fissare l'EIB al cranio utilizzando del cemento dentale.
    NOTA: Piccole quantità di perossido di idrogeno possono essere applicate per aumentare la porosità del cranio e migliorare l'aderenza del cemento dentale.
11. Dopo aver identificato il muscolo VL, impiantare l'elettrodo epimisiale fabbricato su misura impiantato in linea con le fibre muscolari utilizzando un monofilamento 4-0 non assorbibile. Chiudere l'incisione utilizzando clip per ferite o sutura.
12. Dopo la chiusura, rimuovere l'animale dall'anestesia e riporlo individualmente in una gabbia per animali pulita e asciutta. Consenti al ratto di riprendersi su un tappetino riscaldato e monitora la temperatura e la frequenza respiratoria del ratto ogni 15 minuti fino a quando l'animale non è deambulante. Trattare il dolore post-chirurgico somministrando un analgesico approvato nei giorni successivi alla strumentazione.
    NOTA: il ratto deve essere alloggiato individualmente fino a quando non si riprende completamente.
13. Dopo un periodo di 14 giorni, eseguire il test degli elettrodi in vivo per valutare la validità dell'elettrodo epimisiale fabbricato su misura per catturare le alterazioni fisiologiche dell'attività muscolare. Posiziona il ratto strumentato su un tapis roulant per roditori ed esponilo in modo casuale a condizioni di camminata in salita e in discesa che provocano un aumento o una riduzione della segnalazione VL EMG (inclinazione di 16°, declino di 16° a 16 metri/minuto). Raccogli dati longitudinali (ad esempio, 14 giorni e 56 giorni dopo la strumentazione) per garantire l'affidabilità nel tempo.
    NOTA: Le valutazioni di 14 e 56 giorni sono state selezionate in quanto un periodo di 14 giorni consente il completo recupero chirurgico e quello di 56 giorni supera la nostra tempistica sperimentale. Incoraggiamo gli altri a testare le prestazioni e l'affidabilità degli elettrodi utilizzando un lasso di tempo che replichi la loro sequenza temporale sperimentale prima dell'uso. La velocità (16 m/min) e le condizioni di camminata (16° di inclinazione, 16° di discesa) sono state selezionate per corrispondere alle condizioni stabilite di aumento e diminuzione dell'eccitazione VL in questo modello¹⁰.
14. Modificare i parametri di acquisizione in base alle esigenze sperimentali. Acquisisci la segnalazione EMG durante la camminata a una velocità di 2.000 Hz utilizzando la piattaforma di acquisizione dati e sincronizza con un sistema di acquisizione del movimento.
    NOTA: Se si utilizza un dispositivo di acquisizione diverso, raccogliere EMG e motion capture secondo le istruzioni del produttore e per soddisfare le esigenze sperimentali.
15. Estrai 25 secondi di dati sull'andatura da ogni condizione di camminata ed esportali in uno script Python personalizzato per un'ulteriore elaborazione e analisi del segnale. Regolazione della linea di base (zero), rettifica e uniformazione utilizzando un algoritmo quadratico medio radice con una larghezza del contenitore di 50 ms. Applica un algoritmo di rilevamento dei picchi per selezionare i picchi RMS-EMG da utilizzare per le successive analisi dei dati.
    NOTA: Abbiamo brevemente descritto i metodi per pre-elaborare e analizzare i dati EMG, poiché questo passaggio varia notevolmente a causa dei linguaggi di programmazione e del software e dell'hardware di acquisizione EMG. Incoraggiamo gli autori a consultare le seguenti risorse per ulteriori informazioni 3,11,12,13.

4. Test di biocompatibilità

1. Dopo la fine delle raccolte EMG longitudinali (o in un momento selezionato), sopprimere il ratto utilizzando metodi appropriati e approvati (ad esempio, asfissia con CO₂ seguita da toracotomia bilaterale).
2. Dopo l'eutanasia, estrarre i muscoli VL bilaterali creando un'incisione sugli arti posteriori destro e sinistro anterolaterale. Congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C.
   NOTA: Fare attenzione a mantenere l'elettrodo in posizione sul muscolo strumentato (ad esempio, il VL destro) durante l'estrazione. In alternativa, contrassegnare la regione del sottoelettrodo o estrarre solo il muscolo dalla regione del sottoelettrodo. Questo non si applica al muscolo controlaterale/di controllo.
3. Utilizzare un criostato per tagliare sezioni trasversali muscolari seriali (7 μm) dalla regione direttamente sotto l'interfaccia elettrodo-fasciale. Tagliare sezioni dal ventre muscolare del VL controlaterale per fungere da controllo. Vedi Kumar et al. per i dettagli sulla criosezione¹⁴.
4. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E); vedi Wang et al. per i dettagli riguardanti la colorazione H&E sulle sezioni trasversali del muscolo scheletrico¹⁵.
5. Esaminare le sezioni colorate (strumentate e di controllo) utilizzando un microscopio ottico con ingrandimento 20x. Analizza i cambiamenti istologici alla cieca dell'origine dei campioni. Valutare la salute dei tessuti valutata utilizzando le seguenti caratteristiche patologiche: infiltrazione di cellule immunitarie, accumulo mionucleare interno, fibrogenesi e frammentazione del sarcolemma.

5. Analisi statistiche suggerite

1. Per valutare le prestazioni dell'elettrodo epimisale realizzato su misura rispetto allo standard del settore, importare i dati ex vivo in un pacchetto statistico selezionato. Applicare i seguenti test statistici ai dati ex vivo raccolti dagli elettrodi standard industriali e fabbricati su misura (ad esempio, 8.000 campioni rappresentativi dalle forme d'onda sinusoidale, triangolare e quadra). Imposta il livello alfa a priori a p ≤ 0,05.
   1. Per testare il livello di concordanza del segnale tra gli elettrodi, utilizzare le correlazioni intraclasse (ICC) e i grafici di Bland-Altman. Calcola le stime ICC e i loro intervalli di confidenza al 95% sulla base di un modello a effetti casuali a 2 vie a punteggio singolo (k = 2), accordo assoluto.
   2. Per testare il grado di covarianza della registrazione delle forme d'onda nel tempo, nota anche come sincronia temporale, eseguire la correlazione di Pearson sui valori raccolti con gli elettrodi standard industriali e fabbricati su misura.
   3. Confrontare l'impedenza media dell'elettrodo per entrambe le superfici di contatto (misurata a 1 kHz) da elettrodi selezionati e fabbricati su misura (ad esempio, 10 elettrodi) con l'impedenza dell'elettrodo standard del settore.
      NOTA: I valori di impedenza dell'elettrodo variano in base al caso d'uso e ai materiali utilizzati durante la fabbricazione dell'elettrodo.
2. Per valutare la qualità delle registrazioni in vivo , importare i dati raccolti durante la camminata sul tapis roulant in un pacchetto statistico selezionato.
   1. Per valutare la validità dell'elettrodo fabbricato su misura durante i test in vivo (in cui l'andatura del ratto è stata perturbata attraverso la camminata in salita e in discesa per indurre alterazioni fisiologiche nell'attività muscolare), eseguire il t-test di Welch per confrontare i valori medi di picco per le condizioni di camminata in salita e in discesa.
      NOTA: I lettori sono incoraggiati a eseguire ulteriori test e analisi (ad esempio, valutazioni del rapporto segnale/rumore (SNR); vedere Delysys Fundamental Concepts in EMG Signal Acquisition) che non sono presentati qui per brevità¹⁶.
   2. Per valutare l'affidabilità della segnalazione dell'elettrodo nel tempo, valutare i dati longitudinali raccolti in condizioni costanti (camminata livellata a 16 m/min a intervalli di 14 e 56 giorni dopo l'impianto) tramite test t accoppiati.

Results

Prestazioni ex vivo
Gli ICC hanno rivelato alti livelli di accordo tra gli elettrodi fabbricati su misura e quelli standard del settore in tutte le forme d'onda (seno [ICC = 0,993], quadrato [ICC = 0,995], triangolo [ICC = 0,958]; p < 0,001). I grafici di Bland-Altman hanno anche rivelato un alto grado di accordo del segnale tra gli elettrodi. I grafici di Bland Altman e le correlazioni di Pearson sono riassunte nella Figura 3 con forti correlazioni positive tra gli elettrodi fabbricati su misura e quelli standard del settore. Le correlazioni di Pearson hanno rivelato alti livelli di sincronia temporale tra l'elettrodo fabbricato su misura e lo standard industriale in tutte le forme d'onda (seno [r = 0,987], quadrato [r = 0,990], triangolo [r = 0,931]).

Figura 3: Risultati dei test ex vivo . Dati grezzi da elettrodi personalizzati e standard del settore per un'onda sinusoidale ripetuta (A), un'onda quadra (D) e un'onda triangolare (G) a 0,1 V e 5 Hz. (B,E,H) Correlazione tra le misure di tensione per gli elettrodi personalizzati e MicroProbe per 8.000 campioni delle rispettive forme d'onda. (C,F,I) Grafico di Bland Altman che valuta la differenza percentuale tra l'elettrodo personalizzato e quello MicroProbe attraverso i valori medi delle rispettive forme d'onda. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nella Figura 4 è mostrato uno spettro di impedenza rappresentativo per un elettrodo epimisiale fabbricato su misura. Sebbene le misure di impedenza siano state raccolte da 10 Hz a 31 kHz, i risultati sono riportati a 1 kHz, che è una frequenza rilevante per l'acquisizione EMG. Lo standard industriale (elettrodo di riferimento) aveva un'impedenza di 2 kΩ. Per confronto, l'impedenza media di 10 elettrodi epimisiali fabbricati su misura era di 3,61 ± 7,95 kΩ e di 1,63 ± 1,59 kΩ a 1 kHz per le superfici di contatto 1 e 2, rispettivamente.

Figura 4: Impedenza. Grafico dell'ampiezza di Bode che rappresenta il valore di impedenza in Ohm (Ω) a ~ 1 kHz per un elettrodo epimisiale rappresentativo fabbricato su misura. I canali 1 e 2 riguardano rispettivamente le superfici di contatto 1 e 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Prestazioni in vivo (video supplementare S1)
L'elettrodo realizzato su misura ha catturato efficacemente le fluttuazioni fisiologiche dell'attività VL EMG indotta durante varie condizioni di camminata su tapis roulant. In particolare, il picco medio di attività EMG è risultato essere significativamente più basso durante la camminata in discesa (0,008 ± 0,005 mV) rispetto alla salita (0,031 ± 0,180 mV, p = 0,005), in accordo con i risultati precedenti¹⁰. Inoltre, un t-test accoppiato ha rivelato che i valori di ampiezza EMG di picco a 14 giorni (0,01 ± 0,007 mV) non mostravano una differenza significativa rispetto a quelli a 56 giorni (0,012 ± 0,007 mV, p > 0,05), supportando l'affidabilità a lungo termine del dispositivo (Figura 5). Valori di magnitudo EMG significativamente diversi nelle stesse condizioni di registrazione possono essere indicativi di danni o guasti all'elettrodo.

Figura 5: Affidabilità dell'elettrodo in vivo . Boxplot di Tukey dell'ampiezza EMG di picco (mV) del vasto laterale durante la camminata su tapis roulant in piano (16 m/min) a 14 giorni (T14) e 56 giorni (T56) dopo la strumentazione. Abbreviazioni: EMG = elettromiografia; ns = non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Biocompatibilità
H&E non ha rivelato alcuna evidenza di infiammazione nel muscolo di controllo (Figura 6, pannello di sinistra) rispetto al muscolo strumentato (Figura 6, pannello di destra). Ciò non includeva alcuna chiara evidenza di infiltrazione di cellule immunitarie, accumulo mionucleare interno, fibrogenesi e/o frammentazione del sarcolemma tra sezioni trasversali estratte dal muscolo di controllo o strumentato.

Figura 6: Biocompatibilità. Confronto istologico dei muscoli del vasto laterale di controllo (a sinistra) e strumentati (a destra) colorati con ematossilina ed eosina (40x). Barre di scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Catch_tray.gcode. Modello di stampa 3D del vassoio di raccolta, progettato come parte della maschera di piegatura per raccogliere le lamine piegate dalla maschera di piegatura. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Cutting_jig.gcode. Modello di stampa 3D della dima di taglio, che contiene fessure uniformemente distanziate come guida per perforare costantemente la base in silicone. La dima di taglio è configurata per il posizionamento di venti lamine per formare dieci elettrodi epimisiali bipolari. Tuttavia, attualmente utilizziamo la maschera di taglio per produrre un lotto di sei elettrodi bipolari, poiché suggeriamo di lasciare uno spazio tra gli elettrodi. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Folding_jig.gcode. Modello di stampa 3D della maschera di piegatura, che consente di piegare più facilmente le lamine di platino-iridio per formare la forma a U desiderata. La piegatura delle lamine può essere eseguita anche manualmente, se necessario. Clicca qui per scaricare questo file.

Video supplementare S1: Test in vivo . Segnalazione EMG del VL durante la deambulazione in declino (-16°) su un tapis roulant motorizzato a 16 m/min utilizzando l'elettrodo EMG epimisiale fabbricato su misura. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Il nostro obiettivo era quello di semplificare il processo di fabbricazione EMG, consentendo una più ampia adozione e implementazione di design di elettrodi epimisiali, promuovendo così l'accessibilità e facendo progredire la ricerca neuromuscolare. A tal fine, presentiamo una guida di facile utilizzo per l'approvvigionamento, la fabbricazione e il test di elettrodi epimisici a basso costo in-house. Nella speranza di supportare altri gruppi di ricerca, forniamo anche modelli di stampa 3D supplementari per facilitare la produzione di elettrodi epimisici interni per i loro sforzi di ricerca.

I ricercatori che stanno valutando l'adozione di queste tecniche di fabbricazione dovrebbero considerare quanto segue: 1) i parametri dell'elettrodo specificati in questo flusso di lavoro (forma, dimensioni, superficie di contatto, distanza tra gli elettrodi, lunghezza del cavo, ecc.) sono stati selezionati per adattarsi al nostro modello sperimentale e dovranno essere modificati per diversi casi d'uso, 2) la saldatura dei fili di piombo alle lamine di contatto è un passaggio cruciale che richiede pratica per un'esecuzione di successo; La regolazione dell'ampiezza dell'impulso e dell'energia di saldatura durante la saldatura può migliorare il successo, 3) è essenziale applicare tensione ai fili conduttori e valutare le prestazioni dell'interfaccia dopo la saldatura per testare la connessione della superficie di contatto tra piombo e contatto, 4) la fase finale di fabbricazione prevede il rivestimento e la sigillatura dell'elettrodo con silicone, un processo semplice ma cruciale per prestazioni ottimali dell'elettrodo. Il rivestimento in silicone deve essere sottile e relativamente liscio per evitare irritazioni al tessuto dermico durante l'impianto, ma un rivestimento eccessivamente sottile può compromettere le prestazioni dell'elettrodo. Si consiglia ai ricercatori di modificare il rapporto silicone-toluene in base alle loro specifiche per ottenere uno strato di sigillante siliconico robusto ma sottile e liscio.

Quando si valutano le prestazioni degli elettrodi, gli altri dovrebbero notare quanto segue: 1) abbiamo fornito un esempio di valutazione in vivo , ma incoraggiamo il lettore a utilizzare una procedura di test in vivo che imiti il caso d'uso previsto del loro elettrodo epimisiale fabbricato su misura, 2) anche il nostro protocollo di test in vivo non consentiva spazialmente l'impianto simultaneo degli elettrodi fabbricati su misura e standard del settore. Pertanto, l'accordo del segnale tra gli elettrodi non poteva essere misurato in vivo e, pertanto, non è stato valutato, 3) inoltre, la nostra configurazione di test in vivo non ha permesso la valutazione dell'impedenza dell'elettrodo dopo l'impianto, 4) è importante considerare che i nostri dati sono stati testati ex vivo a livelli di tensione relativamente bassi (<1 V) a causa delle nostre esigenze sperimentali. Pertanto, i ricercatori che prendono in considerazione l'onboarding di questi elettrodi potrebbero voler testare la loro utilità a tensioni più elevate. Queste sono considerazioni che altri possono prendere in considerazione quando testano i propri elettrodi epimisiali.

Lavori precedenti hanno evidenziato il potenziale degli elettrodi di registrazione multicanale e ad alta densità per decodificare in modo più accurato l'attività dei motoneuroni 17,18,19,20. Incoraggiamo coloro che sono interessati allo sviluppo e all'utilizzo di elettrodi epimisici multicanale a utilizzare ed espandere le risorse didattiche che forniamo qui. Oltre a fungere da elettrodi di registrazione, gli elettrodi epimisici sono comunemente usati come elettrodi stimolanti negli esperimenti di neurostimolazione 21,22,23 e di controllo delle protesi^24,25. Per coloro che sono interessati a utilizzare gli elettrodi epimisali per questi scopi, li incoraggiamo a sviluppare il nostro lavoro e testare la capacità di stimolazione dei propri elettrodi epimitali fabbricati su misura.

Nel complesso, la quantificazione dell'attività elettrica del muscolo è fondamentale per comprendere i meccanismi alla base di numerose patologie e l'efficacia di potenziali trattamenti. Questo flusso di lavoro aggiornato rappresenta una guida semplice alla produzione interna di elettrodi epimisici convenienti che possono essere utilizzati per quantificare in modo affidabile questa importante metrica della salute muscoloscheletrica. Speriamo che questa metodologia possa servire da modello per altri gruppi per fabbricare e testare i propri elettrodi epimisici fabbricati su misura.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiali dell'elettrodo
			Quantità e prezzo per elettrodo
Superficie di contatto	Prince and Izant PT90/IR10 1,25 mm x 5 mm	Catalogo #1040055	2 per elettrodo $ 7,50 per foglia $ 15,00 per elettrodo
Filo conduttore dell'elettrodo in acciaio inossidabile rivestito in PFA	A-M Systems Filo di acciaio inossidabile multifilare rivestito in PFA 50.8 & micro; m diametro del filo	catalogo #793500	A seconda della lunghezza del cavo desiderata (ad esempio, fili conduttori da 9 pollici x2) $ 128 per bobina da 25 piedi $ 5,12 per piede $ 0,42 per pollice (x18) $ 7,68 per elettrodo
	Stampato in 3 (vedi file .gcode)	NA	NA
Sigillante per corpo elettrodo	Nusil Med-1137 silicone liquido	Catalogo #MED-1137	1 grammo $ 344,66 per 2 once (59,15 mL) $ 5,83 per elettrodo
Base in silicone	Implantech Alliedsil Silicone rinforzato con fogli, impiantabile a lungo termine (8 "x 6") .007 di spessore	Catalogo #701-07	Foglio da 10 mm x 5 mm $ 225,00 per 8 x 6 pollici $ 0,36 per elettrodo (10 mm x 5 mm)
Diluente per miscela sigillante	Toluene 99,5% ACS Reagente 500 ml o xilene ACS 99,5%	Catalogo #179418-500 ML	0,75 mL $ 25,53 per 500 mL $ 0,38 per elettrodo
Modello per la perforazione della base in silicone	Maschera di taglio - Stampa 3D (vedi file CAD)	NA	NA
Elettrodo fabbricato su misura: $ 29,25
Elettrodo standard del settore (EP105 EMG Patch Electrode, 2 contatti, lato singolo, 7 mm x 4 mm, MicroProbe for Life Science): $ 305.00
Materiali di fabbricazione aggiuntivi
			Quantità e prezzo per elettrodo
Software di stampa 3D	Solidworks (Solidworks, 2022)
Saldatrice Micro-Tig	Saldatrice Micro-TIG (CD1000SPM, Saldatrice a punti con resistenza alla produzione di luce e ricerca a impulsi singoli, Sunstone)	SKU  301010	$3,500
Bagno ad ultrasuoni	Bagno ad ultrasuoni (Bagno ad ultrasuoni serie CPX, Fisherbrand).	15-337-403	NA
strong>Ex vivo
			Quantità e prezzo per elettrodo
Piattaforma di acquisizione dati e software	DigitalLynx 4sX Base Cheetah versione 6.0 (Neuralynx Inc.)	NA	EMG acquisizione hardware e software
Scheda di interfaccia elettrodo (EIB)	EIB, EIB16-QC, Neuralynx Inc.	31-0603-0007	NA
Generatore di segnale	5 MHz Generatore di funzioni, B& K Precisione	4005DDS220V	$387.46
Potenziostato	PGSTAT1 potenziostato (EcoChemie, Utrecht, Paesi Bassi)	NA	NA
Vite in acciaio inossidabile	Strumenti per la scienza fine	19010-00	$98
Materiali per test ex vivo
			Quantità e prezzo per elettrodo
Tapis roulant per roditori	Tapis roulant aperto Exer 3/6, Columbus Instruments	NA	NA
Cemento dentale	Excel Formula® Materiale dentale colabile, St. George Technology Inc.	#24211$	125.60
Microscopio ottico	Keyence BZ-X800, Keyence Corporation, Osaka, Giappone	NA	NA
Sistema di motion capture Optitrack	Color Camera, Optitrack, NaturalPoint Inc.	NA	NA
Algoritmo di rilevamento dei picchi	" SciPy.signal.find_peaks - Manuale SciPy v1.8.1", 2022	NA	NA
Python software	Python Foundation. Riferimento al linguaggio Python, versione 3.9. Disponibile presso http://www.python.org	NA	NA
Rat	HsdBlu: LE, Envigo	140	NA
Statistical sotware	GraphPad Prism versione 10.0.0 (GraphPad Software, Boston, Massachusetts USA)	NA	NA