Questo protocollo presenta un quadro metodologico dettagliato per la transgenesi basata sull'elettroporazione di cellule cardiache in cuori di topo in via di sviluppo. Le risorse video fornite qui faciliteranno l'apprendimento di questa tecnica versatile.
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Articolo metodologico
Un approccio efficiente alla transgenesi per la consegna genica nel cuore embrionale di topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cuore dei mammiferi è un organo complesso formatosi durante lo sviluppo attraverso popolazioni molto diverse di cellule progenitrici. L'origine, i tempi di reclutamento e il destino di questi progenitori sono vitali per il corretto sviluppo di questo organo. I meccanismi molecolari che governano la morfogenesi del cuore sono essenziali per comprendere la patogenesi delle cardiopatie congenite e della rigenerazione cardiaca embrionale. Gli approcci classici per studiare questi meccanismi hanno impiegato la generazione di topi transgenici per valutare la funzione di geni specifici durante lo sviluppo cardiaco. Tuttavia, la transgenesi del topo è un processo complesso e dispendioso in termini di tempo che spesso non può essere eseguito per valutare il ruolo di geni specifici durante lo sviluppo del cuore. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato un protocollo per l'elettroporazione e la coltura efficienti di cuori embrionali di topo, consentendo alla transgenesi transitoria di valutare rapidamente l'effetto del guadagno o della perdita di funzione dei geni coinvolti nello sviluppo cardiaco. Utilizzando questa metodologia, abbiamo sovraespresso con successo Meis1 nel cuore embrionale, con una preferenza per la trasfezione di cellule epicardiche, dimostrando le capacità della tecnica.
Introduzione
Il cuore è il primo organo che si forma durante lo sviluppo embrionale. Questo processo comporta la coordinazione spazio-temporale di varie popolazioni di cellule progenitrici provenienti da aree distinte dell'embrione. Tutto ciò avviene mentre il cuore in via di sviluppo continua a battere e a funzionare, sottolineando la notevole coordinazione necessaria per la sua formazione 1,2,3. Dato il ruolo cruciale del cuore, una stretta regolazione a livello cellulare e molecolare è essenziale per la sua corretta formazione 4,5. Identificare i meccanismi che controllano lo sviluppo del cuore è stato di grande interesse, in quanto sono cruciali per svelare le cardiopatie congenite, che colpiscono un numero considerevole di pazienti in tutto il mondo6. Inoltre, la comprensione dello sviluppo cardiaco è fondamentale per decifrare la rigenerazione cardiaca, poiché i cuori dei mammiferi postnatali conservano una capacità rigenerativa che viene persa o ostacolata in età adulta 7,8. Di conseguenza, l'analisi dei regolatori molecolari dello sviluppo cardiaco è fondamentale per far avanzare gli sforzi di ricerca sulle cardiopatie congenite e sulla rigenerazione cardiaca.
Nel perseguimento di questo obiettivo, c'è stata una crescente attenzione allo studio del ruolo dell'epicardio nello sviluppo e nella rigenerazione cardiaca9. L'epicardio è un sottile strato di tessuto mesoteliale che comprende lo strato più esterno del cuore dei mammiferi (Figura 1). Recenti studi hanno dimostrato l'importanza dell'epicardio durante il danno cardiaco, rivelando che questo tessuto è in grado di inviare segnali di proliferazione ai cardiomiociti nella zona interessata per mitigare il danno10,11. Nonostante l'importanza dell'epicardio, la conduzione di ulteriori indagini molecolari è stata messa alla prova dalla sua immensa eterogeneità. Gli esperimenti di RNAseq a singola cellula hanno rivelato l'eterogeneità dell'epicardio, che ospita più sottopopolazioni cellulari con firme trascrittomiche distinte 12,13,14,15,16. Pertanto, una strategia per lo screening dei potenziali regolatori dello sviluppo cardiaco dovrebbe tenere conto della diversità delle cellule progenitrici epicardiche.
In questo senso, l'adattabilità del modello murino alla modificazione genetica ha facilitato l'identificazione di numerosi geni cruciali per lo sviluppo del cuore, consentendo la generazione di linee mutanti con guadagno di funzione (GOF) o perdita di funzione (LOF) di geni specifici. Tuttavia, questi approcci implicano un notevole investimento di tempo e risorse sperimentali; pertanto, non sono pratici quando si valutano i ruoli di un gran numero di geni candidati. Inoltre, i geni dello sviluppo spesso esercitano funzioni pleiotropiche in diversi tessuti o sono necessari per lo sviluppo embrionale precoce, ostacolando l'interpretazione del loro contributo allo sviluppo in un processo specifico. Sebbene sia possibile indirizzare la funzione genica in strutture specifiche o in punti temporali dello sviluppo, ciò di solito richiede l'uso di costruzioni genetiche più complesse, che possono essere difficili da generare o sono generalmente non disponibili.
Per superare queste limitazioni, presentiamo una metodologia per elettroporare cuori embrionali di topo per la transgenesi transitoria (Figura 2). Abbinata alla coltura ex vivo e al cell sorting attivato da fluorescenza (FACS), questa strategia dimostra le sue capacità attraverso il GOF transitorio di Meis1, un gene ben caratterizzato implicato nello sviluppo e nella rigenerazione del cuore 17,18,19. In questo articolo, vengono esplorate anche altre potenziali applicazioni di questa metodologia, e vengono discussi i suoi vantaggi e limiti, nonché rispetto ai protocolli esistenti per la modulazione transitoria dell'espressione genica. Riteniamo che il quadro e gli esempi visivi presentati miglioreranno la comprensione della biologia dell'epicardio durante lo sviluppo e la malattia.
Figura 1: Strati cardiaci embrionali di topo. Diagramma schematico di una vista coronale di un cuore embrionale di topo E13-14. I tre principali strati cellulari del cuore sono rappresentati in giallo (endocardio), rosso (miocardio) e blu (epicardio). Il pericardio è rappresentato da una linea marrone. Le quattro camere del cuore sono abbreviate in LV, ventricolo sinistro; RV, ventricolo destro; LA, atrio sinistro; RA, atrio destro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica schematica del protocollo di elettroporazione cardiaca. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocollo
Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale del CNIC e sono conformi alla legislazione vigente, tra cui la Direttiva UE 2010/63 e la Raccomandazione 2007/526/CE, come applicato dalla legge spagnola ai sensi del Real Decreto 53/2013. Per questo protocollo, sono stati impiegati topi CD-1 femmina wild-type di età compresa tra 15 e 21 settimane. I dettagli relativi agli animali, ai reagenti e alle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Plasmide e preparazione degli strumenti
- Innanzitutto, preparare la miscela di elettroporazione aggiungendo il DNA plasmidico desiderato nel ghiaccio a una concentrazione finale di 1 μg/μL. Quindi, completare la miscela aggiungendo saccarosio alla concentrazione finale al 6% (disciolto in PBS), un colorante biocompatibile allo 0,01%, e completare con PBS fino ad un volume finale di 30 μL.
NOTA: Per campione vengono utilizzati circa 1-2 μl della miscela di elettroporazione. Scala le proporzioni della miscela di elettroporazione in base al numero di campioni nell'esperimento. Si ricorda che il DNA per l'elettroporazione deve essere purificato da colture batteriche, garantendo una stabilità ottimale e contaminanti minimi. Per maggiori dettagli sui plasmidi utilizzati per questo studio, fare riferimento alla sezione dei risultati rappresentativi. - Preparare il terreno di crescita integrando il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con il 10% di siero fetale bovino (FBS), il 2% di tampone Hepes e l'1% di penicillina/streptomicina. Conservare il terreno in un'incubatrice a 37 °C fino al momento dell'uso. Inoltre, scaldare 1x PBS a 37 °C, insieme al terreno di coltura.
- Preparare gli aghi allungando un capillare di vetro di 20 μm di diametro utilizzando un estrattore per pipette con le seguenti condizioni: calore = 550; tirare = 100; velocità = 250; tempo = 120. Il diametro finale dopo l'estrazione dovrebbe essere approssimativamente compreso tra 5-8 μm.
- Impostare i parametri dell'elettroporatore su cinque cicli da 50 ms a 40 V con intervalli di 900 ms. Preparare gli elettrodi, la pipetta orale e l'ago smussato (Figura 3A). Equipaggiare la pipetta con l'ago per caricare il DNA (Figura 3A).
2. Dissezione embrionale ed estrazione cardiaca
- Imposta un incrocio tra topi CD-1 wild-type. La mattina successiva, seleziona le femmine che presentano un tappo vaginale e annota questo momento come giorno embrionale E0.5. Eutanasia degli animali al giorno embrionale E12-12.5 mediante lussazione cervicale (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
- Estrarre con cura l'utero dal topo e metterlo in un tovagliolo di carta asciutto. Successivamente, tagliare l'utero con delle forbici sottili inserendo la punta delle forbici nel lato mesometrial e facendo scorrere lentamente il bordo della lama per tutta la lunghezza. Esponi le decidue e trasferiscile nel terreno di coltura. Per maggiori dettagli, si veda il lavoro di Behringer et al.20.
- Sezionare le decidue per estrarre gli embrioni, quindi posizionare gli embrioni in una capsula di Petri da 60 mm con terreno di coltura caldo. Usando una pinza fine, taglia con cura la coda e la testa dell'embrione in modo che rimanga solo il tronco del corpo. Lo stadio degli embrioni può essere verificato valutando le caratteristiche anatomiche, come descritto da Wong et al.21.
- Quindi, rimuovere con cautela quanto più tessuto possibile dal tronco dell'embrione senza danneggiare il cuore o le arterie polmonari e aortiche. Una volta che il cuore è stato esposto, posizionarlo immediatamente in un nuovo terreno di coltura caldo e tenerlo in un'incubatrice a 37 °C fino all'elettroporazione.
NOTA: Mantenere la temperatura del cuore è fondamentale per la sua sopravvivenza. Assicurarsi che il mezzo sia sempre caldo e sostituirlo ogni 5-10 minuti. D'altra parte, i campioni possono essere manipolati senza mantenere la sterilità, in quanto ciò non influirà sull'efficienza della procedura. Si prega di notare che il terreno di coltura contiene antibiotici.
3. Elettroporazione cardiaca e coltura ex vivo
- Caricare circa 10 μl di miscela plasmidica (preparata al punto 1.1) nell'ago aspirando con cautela con la pipetta orale.
- Preparare un singolo cuore per l'elettroporazione mettendolo in una capsula di Petri pulita da 60 mm con 1x PBS sterile riscaldato a 37 °C. Posizionare il piatto sotto il microscopio da dissezione (Figura 3A).
- Preparare gli elettrodi regolando la distanza tra i poli positivo e negativo a circa 4 mm (Figura 3B).
NOTA: 4 mm è la distanza di apertura in cui i cuori di mouse E12.5 si inseriscono negli elettrodi utilizzati in questo lavoro. Si prega di prendere in considerazione la possibilità di modificare questa distanza in base alle diverse dimensioni del campione o alle specifiche dell'elettrodo. - Perforare delicatamente lo strato più superficiale del cuore con l'ago nella pipetta orale. Pipettare con cautela 1-2 μL della miscela plasmidica e rimuovere l'ago. Possono essere eseguite iniezioni multiple per garantire una penetrazione ottimale, nonché per espandere il numero di celle elettroporate.
- Tenere gli elettrodi in posizione in modo che il cuore si trovi tra entrambi i poli (Figura 3C). Quindi, elettroporare il cuore con le condizioni sopra specificate.
NOTA: Per garantire la massima efficienza di elettroporazione, è possibile cambiare la polarità degli elettrodi e dare un altro impulso. - Trasferire il cuore elettroporoso in una nuova piastra a 12 pozzetti contenente 1 mL di terreno di coltura e posizionarlo a 37 °C, 5% CO2.
- Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.6 fino a quando tutti i campioni dell'esperimento sono elettroporizzati. Infine, incubare tutti i cuori in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO2, per 24 ore o fino all'analisi.
NOTA: Nelle nostre mani, i cuori potrebbero essere lasciati in coltura per un massimo di 48 ore senza apparenti segni di deterioramento (Filmato supplementare 1; Film supplementare 2; Figura supplementare 1).
Figura 3: Configurazione dell'elettroporazione. (A) Configurazione utilizzata per l'elettroporazione. Le frecce rosse indicano l'elettroporatore, gli elettrodi e la capsula di Petri dove i cuori vengono elettroporati. (A') Dettaglio ravvicinato dell'ago per elettroporazione come evidenziato in (A) dal rettangolo bianco. (B) Dettaglio della distanza regolata degli elettrodi utilizzati nei cuori E12.5. (C) Rappresentazione schematica dell'elettroporazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. Cell sorting e analisi immunoistochimica
- Per l'analisi di smistamento cellulare dei campioni, preparare un mezzo di digestione per dissociare il tessuto mescolando insieme 400 μL di liberasi (5 mg/ml), 300 μL di dispasi (0,1 g/mL), 4 μL di CaCl2 (0,4 μM), 50 μL di MgCl2 (5 μM) e completare fino a 10 mL di DMEM. Tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso. Ogni cuore ha bisogno di circa 1 ml di terreno di digestione. Regolare i volumi in base al numero di campioni.
NOTA: Per l'immunoistochimica, fissare direttamente i cuori in 1,5 mL di PFA al 4% per 2 ore a RT o durante la notte a 4 °C. Il giorno successivo, lavare i cuori 3 volte con PBS e procedere alle procedure istologiche e di immunocolorazione a valle. Per un protocollo di immunoistochimica dettagliato, fare riferimento a Morris et al.22. - Trasferire ciascun cuore in coltura in una nuova provetta contenente 1 mL di terreno di digestione ghiacciato.
- Per facilitare la dissociazione, tritare il tessuto applicando delicatamente il piacere con una siringa 3-4 volte e incubare immediatamente in una piastra calda a 37 °C, 600 giri/min per 45 minuti.
- Filtrare la miscela di digestione attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una nuova provetta e lasciarla svuotare per gravità. Quindi, recuperare il volume passante e filtrarlo nuovamente utilizzando un filtro cellulare da 40 μm in una nuova provetta da 50 mL.
- Aggiungere 500 μl di siero fetale bovino (FBS) e completare fino a 30 mL utilizzando DMEM freddo.
- Centrifugare la miscela a 240 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Scartare il surnatante e posizionare la provetta da 50 ml capovolta su un tovagliolo di carta per asciugarla completamente.
NOTA: Questo è un punto conveniente per mettere in pausa l'esperimento congelando il pellet della cella. In tal caso, risospendere le cellule con DMSO al 10% in FBS e conservarle a -80 °C. - Per la selezione cellulare, risospendere le cellule in 300 μL di tampone di smistamento (1% FBS, 1% penicillina/streptomicina in PBS) e aggiungere 0,3 μL di DAPI (1000x). Eseguire l'ordinamento delle celle.
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Risultati
Per dimostrare l'efficacia di questa tecnica nell'esecuzione di esperimenti di guadagno di funzione (GOF) per regolatori dello sviluppo cardiaco rilevanti, un costrutto è stato elettroporatamente sovraesprimendo il fattore di trascrizione Meis1. Per raggiungere questo obiettivo, l'RNA è stato estratto dagli embrioni E9.5 ed è stata eseguita la trascrizione inversa per ottenere il DNA complementare (cDNA). Utilizzando il cDNA come modello, la sequenza codificante Meis1 è stata clonata (Tabella supplementare
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Discussione
Nel complesso, la metodologia qui descritta offre un quadro robusto per l'espressione di costrutti transgenici nell'epicardio in via di sviluppo (Figura 4B), come dimostrato dalla sovraespressione di Meis1 (Figura 4C). Con i costrutti appropriati, questo protocollo può essere utilizzato per valutare transitoriamente l'impatto del guadagno di funzione (GOF) o della perdita di funzione (LOF) di un gene specifico. La LOF può essere implementata nella tecnica trasfe...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione RTI2018-097617-J-I00 dal Ministerio de Ciencia e Innovación spagnolo e da Acción 9 dall'Universidad de Jaén all'O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 dal Ministerio de Ciencia e Innovación spagnolo e dalla sovvenzione H2020-MSCA-ITN-2016-722427 dal programma Horizon 2020 dell'UE a M.T. JMG è stato supportato da una borsa di dottorato del Ministero della Scienza spagnolo e della Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Sia il CNIC che il CBMSO sono sostenuti dal Ministero della Scienza spagnolo, mentre il CNIC è sostenuto dalla Fondazione ProCNIC.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| #55 Pinze | Dumont | 11295-51 | |
| Piastra per coltura cellulare multipozzetto a fondo piatto trasparente a 12 pozzetti | BD Falcon | 353043 | |
| Tavolo morsa da 35 mm | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 40 µ m Filtro cellulare | Fischer Scientific | 08-771-1 | |
| Provette da 50 mL | BD Falcon | 352070 | |
| 70 µ m Cell Strainer | Corning | CLS431751 | |
| Anticorpo policlonale anti-GFP | Invitrogen | A10262 | Diluizione 1:1000 utilizzata |
| Anticorpo monoclonale anti-miosina 4 (MF20) | Invitrogen | 14-6503-82 | Diluizione 1:500 utilizzata |
| CD1 Wild Type | Fornito da Animalary Unit (CNIC) | ||
| Caspasi tagliata-3 (Asp175) Anticorpo | Segnalazione cellulare Tecnologie | 9661 | Diluizione 1:400 utilizzata |
| Tecnologie di | segnalazione cellulare | 4083 | Diluizione 1:1000 utilizzata |
| Dispase/collagenasi | Roche | 10269638001 | |
| Acqua | |||
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 10313021 | |
| Siero fetale bovino | Invitrogen | 10438-026 | |
| Heracell 150i Incubatore CO2 | Thermo Scientific | 51032720 | |
| Leica Microscopio stereoscopico S8AP0 | Leica | 11524102 | |
| Liberase Roche | 5401119001 | ||
| Estrattore per micropipette Modello P-97 | Sutter Instrument | SU-P-97 | |
| Plasmide di espressione pCAG | Addgene | #89689 | |
| Penicillina-streptomicina | Invitrogen | 15070-063 | |
| Piastre di Petri 35 & volte; 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Piastre di Petri 60 & volte; 15 mm | BD Falcon | 353002 | |
| Fenolo Rosso | Merck | P3532 | |
| Puntali | Riutilizzati da vecchie attrezzature di laboratorio | ||
| Siero di ratto coltura embrione, ratti maschi SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Anticorpo ricombinante anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Abcam | ab89901 | diluizione 1:300 utilizzata | |
| Elettroporatore a onda quadra CUY21SC | Nepa Gene | CUY664-10X15 | |
| PBS | Fornito e autoclavato dall'unità tecnica | ||
| Saccarosio | Millipore | 84100 | |
| Elettrodi a pinzetta con gap variabile | Nepa Gene | CUY650P5 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
