Isolamento della microglia ipotalamica dal cervello di topo adulto appena perfuso mediante smistamento cellulare attivato magneticamente

Sommario

Descriviamo un protocollo per isolare le cellule microgliali dall'ipotalamo del topo (o piccole strutture cerebrali equivalenti) utilizzando il cell sorting attivato magneticamente (MACS), in un tempo relativamente breve. La microglia ipotalamica selezionata con MACS può essere utilizzata per analisi ex vivo e può essere piastrata per eseguire saggi in vitro .

Abstract

Le microglia, in quanto macrofagi residenti nel cervello, sono essenziali per il mantenimento dell'omeostasi cerebrale. Modellano i circuiti neuronali durante lo sviluppo, esaminano il loro ambiente alla ricerca di detriti o cellule morte, oltre a rispondere a infezioni e lesioni nel cervello, tra molte altre funzioni. Tuttavia, il loro ruolo importante nello sviluppo neurologico e nella plasticità sinaptica e fisiopatologica non è stato completamente definito, evidenziando la necessità di ulteriori indagini. Per ottenere una comprensione più completa del ruolo delle microglia in questi processi, dobbiamo isolare le microglia e caratterizzarle geneticamente, metabolicamente e funzionalmente. Tuttavia, l'isolamento delle microglia da topi adulti, in particolare da piccole strutture cerebrali, è impegnativo in quanto rappresentano una piccola percentuale delle cellule cerebrali totali e la resa delle microglia isolate è spesso troppo bassa. Qui, l'isolamento magnetico della microglia utilizzando microsfere CD11b⁺ ci consente di selezionare le cellule microgliali dall'ipotalamo di un cervello di topo adulto appena perfuso. Il metodo attuale ci consente di ottenere una purezza e una resa relativamente elevate in un breve periodo, mantenendo la vitalità cellulare.

Introduzione

Le microglia corrispondono al 5-20% del totale delle cellule neurali e sono le uniche cellule gliali che originano dai progenitori eritromieloidi nel sacco vitellino e iniziano a colonizzare il cervello in via di sviluppo intorno al giorno embrionale E9.5 ^1,2. Sono cellule longeve con la capacità di autorinnovarsi lentamente, indipendentemente dalle cellule derivate dal midollo osseo³. Essendo alcune delle cellule più altamente dinamiche, sono in grado di acquisire diversi fenotipi in risposta a segnali contestuali e ambientali ^2,4. Tra i segnali in grado di modulare la loro attività, il danno al sistema nervoso centrale (SNC), l'attività neuronale, così come i nutrienti, sono i più potenti. Un numero crescente di ricerche ha dimostrato il ruolo fondamentale della microglia nelle lesioni, nelle malattie neurodegenerative e nell'obesità ^2,5,6. Tuttavia, il ruolo preciso della microglia sia nei processi fisiologici che nella fisiopatologia richiede ulteriori studi. Pertanto, la loro caratterizzazione trascrizionale, metabolica e funzionale in diverse condizioni è di grande importanza e richiede il loro isolamento, poiché gli studi in situ sono appropriati per la localizzazione di DNA, RNA e proteine e per i confronti qualitativi, nonché per la caratterizzazione morfologica delle microglia.

Esistono varie tecniche descritte per l'isolamento delle microglia, tra cui il metodo del gradiente di Percoll⁷, la selezione cellulare con citometria a flusso (FACS)⁸ e la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). La scelta del metodo appropriato dipende dagli obiettivi dello studio e dal livello di purezza richiesto per le applicazioni a valle. L'isolamento della microglia pura dal cervello del topo adulto, in particolare da piccole strutture cerebrali come l'ipotalamo, è difficile a causa del numero limitato di cellule microgliali. La delicata dissociazione automatizzata dell'ipotalamo utilizzando la tecnologia Miltenyi consente la purificazione di una resa di microglia relativamente elevata in breve tempo, con la possibilità di procedere fino a otto campioni contemporaneamente con un dissociatore octo delicato MACS.

L'omogeneizzazione dei tessuti è seguita dalla purificazione della microglia utilizzando la tecnologia MACS basata su colonna e le microsfere CD11b⁺ supermagnetiche di dimensioni nanometriche. Pertanto, tutti i campioni vengono processati esattamente allo stesso modo, producendo cellule CD11b⁺ intatte. È interessante notare che CD11b non è presente esclusivamente nelle microglia, ma è espresso anche su altre cellule della linea mieloide, inclusi macrofagi e monociti⁹. Per limitare questo, la perfusione cerebrale con soluzione salina ghiacciata prima dell'estrazione dell'ipotalamo (vedi fase 2.6 del protocollo) garantisce l'eliminazione della maggior parte delle cellule mieloidi, lasciando solo una frazione potenzialmente piccola dei macrofagi residenti o di quelli aderiti ai vasi sanguigni. I macrofagi e i monociti residenti in un sistema nervoso centrale sano allo stato stazionario costituiscono una percentuale minore del totale delle cellule immunitarie cerebrali (rispettivamente ~10% e <2%^)10,11. Pertanto, quando le cellule cerebrali vengono selezionate con perle CD11b⁺, sia la microglia che i macrofagi possono essere isolati, sebbene la stragrande maggioranza siano microglia.

La resa finale delle microglia e il mantenimento della loro vitalità ci permettono di eseguire saggi ex vivo, così come in vitro, con il vantaggio di analizzare specifiche regioni cerebrali di interesse. Le ultime evidenze hanno dimostrato che la popolazione di microglia è altamente eterogenea, rappresentando l'espressione genica specifica della regione e le caratteristiche morfologiche e la funzione ^2,12,13. Pertanto, l'attuale protocollo mira a isolare e analizzare la microglia adulta in modo region-specific. Infatti, siamo in grado di caratterizzare i profili genetici, trascrizionali e traduzionali della microglia ipotalamica adulta utilizzando metodi come la RT-qPCR e il sequenziamento dell'RNA, oltre a eseguire analisi funzionali in vitro.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati condotti nel rigoroso rispetto delle raccomandazioni dell'Unione Europea (2013/63/UE) e sono stati approvati dal comitato etico locale dell'Università di Bordeaux (CEEA50) e dal Ministero francese dell'istruzione superiore, della ricerca e dell'innovazione (sintesi non tecnica del progetto approvato NTS-FR-619193 v.1, 23-12-2022).

Il seguente protocollo viene eseguito su topi adulti C57BL/6 con un'età media di 2-4 mesi. Tuttavia, potrebbe essere eseguito in tutte le età e condizioni dei topi, tenendo in considerazione che il panorama delle cellule immunitarie del SNC può essere alterato e la percentuale di macrofagi e monociti residenti può essere aumentata (ad esempio nell'invecchiamento e nella neurodegenerazione).

1. Preparazione delle soluzioni

NOTA: I seguenti volumi e soluzioni sono strettamente riferiti all'isolamento delle cellule Cd11b+.

1. Determinare il volume totale di D-PBS/0,5% di albumina sierica bovina (BSA) richiesta in base al numero di campioni. Preparare la soluzione utilizzando il D-PBS disponibile in commercio con calcio e magnesio e BSA in polvere (vedere la Tabella dei materiali).
2. Preparare le provette di dissociazione marcate (C-Tubes) e riempire ciascuna di esse con 1.900 μl di tampone Z, fornito nel kit di dissociazione del tessuto cerebrale adulto (vedere la Tabella dei materiali). Scongelare gli enzimi e mantenerli in ghiaccio, insieme a tutti i tamponi necessari nei passaggi successivi.
3. Preparare e posizionare su ghiaccio il volume appropriato di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (vedere la Tabella dei materiali) necessaria per la perfusione (passaggio 2.6). Calcola 10 ml per ogni animale più il 10% in eccesso.
4. Per l'analisi RT-qPCR, preparare un tampone qPCR per campione: 2,5 μL di tioglicerina + 250 μL di tampone di lisi, utilizzando un kit disponibile in commercio per purificare l'RNA (vedere la Tabella dei materiali).
5. Per la quantificazione delle proteine, preparare il tampone di lisi diluendo il cocktail di inibitori della fosfatasi e il cocktail di inibitori della proteasi 1:100 in un tampone di estrazione di mammiferi (vedere la Tabella dei materiali).
6. Per la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il test della fagocitosi, preparare 1x HBSS dal 10x HBSS disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali). Quindi, preparare il buffer FACS aggiungendo lo 0,2% di BSA a 1x HBSS.

2. Rimozione del cervello

1. Sedare l'animale con una dose di 20 mg/kg di xilazina; Quindi, sopprimere il topo con un sovradosaggio di 400 mg/kg di pentobarbital e metterlo supino in un vassoio da dissezione.
   NOTA: Anche altre combinazioni di anestetici per l'eutanasia dell'animale possono funzionare.
2. Riempire una siringa da 10 ml con 10 ml di 1x PBS ghiacciato e collegarla a un ago a farfalla da 21 G.
3. Una volta che il topo è completamente anestetizzato (verificare pizzicando le zampe per assicurarsi di una mancanza di risposta), la respirazione si è fermata e il cuore è in fibrillazione, tendere la pelle con una pinza e aprire la cavità toracica con le forbici, a livello delle ultime costole e dello sterno.
4. Usa le forbici per fare un taglio profondo lungo i lati della gabbia toracica verso la parte superiore della gabbia toracica per esporre il cuore.
5. Inserire l'ago da 21 G nella parte distale del ventricolo sinistro (assicurarsi che circa 1/3 dell'ago sia all'interno del ventricolo). Praticare immediatamente un'incisione attraverso l'atrio destro utilizzando le forbici.
6. Infondere 10 ml di 1x PBS ghiacciato per pulire il cervello da eventuali cellule immunitarie circolanti.
   NOTA: Controllare visivamente il cervello per assicurarsi che sia pulito e ben perfuso.
7. Taglia la testa del topo, estrai con cura il cervello e posizionalo su una capsula di Petri riempita di ghiaccio e coperta con un foglio di alluminio.
   NOTA: La capsula di Petri e la pellicola aiutano a vedere i pezzi del cervello. È utile mantenere un ambiente fresco durante il taglio dei pezzi del cervello per limitare le attività metaboliche.
8. Isolare l'ipotalamo con una pinza e tagliarlo a pezzetti con le lamette da barba.
   1. Per identificare e sezionare l'ipotalamo, posizionare il cervello capovolto in modo che la corteccia sia ventrale e l'ipotalamo sia visibile dorsalmente sulla superficie superiore. Separare l'ipotalamo, che si trova nella parte inferiore del cervello su entrambi i lati del terzo ventricolo, usando una pinza curva. Il peso medio dell'ipotalamo nei topi adulti C57BL/6 è di 15 mg.
      NOTA: I pezzi di cervello devono essere il più piccoli possibile (<0,5 mm). Il taglio in piccoli pezzi è un passaggio critico poiché consente una migliore dissociazione e una maggiore resa delle cellule.
9. Raccogliere i pezzi dell'ipotalamo in provette di dissociazione (C-Tubes) precedentemente riempite con 1.900 μL di tampone Z (fase 1.2).
   NOTA: Per avere una buona resa di cellule microgliali sufficiente per eseguire i saggi, raggruppare un minimo di due (per la quantificazione delle proteine) o tre (per qPCR e RNAseq) ipotalami per provetta.

3. Dissociazione tissutale

NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio. Non agitare la sospensione cellulare in nessun passaggio; Mescolare accuratamente solo con una pipetta da 1.000 μl.

1. Preparare la miscela enzimatica 2 secondo la Tabella 1 (calcolando il volume totale per tutte le provette + 10% in eccesso). In ogni provetta C, aggiungere 50 μl dell'enzima contenuto nella miscela 1 (vedere la tabella 1) e 30 μl della miscela enzimatica 2. Tutti gli enzimi sono forniti nel kit di dissociazione del tessuto cerebrale adulto (vedi la Tabella dei Materiali).
2. Chiudere i tubi a C e posizionarli capovolti nel dissociatore con le staffe riscaldanti secondo le istruzioni del produttore. Esegui il programma 37C_ABDK_02.
3. Preparare provette a scatto da 15 ml (vedere la Tabella dei materiali) con filtri da 70 μm su di esse. Inumidire il colino con 2 mL di D-PBS.
4. Al termine del programma di dissociazione/digestione, svuotare la provetta C sul filtro e grattare con una punta da 200 μl per ridurre la perdita cellulare aumentando la filtrazione cellulare e riducendo l'aderenza dell'omogeneizzato tissutale sul filtro.
5. Lavare la provetta con 2 x 5 mL di D-PBS, svuotare i lavaggi sul colino e grattare con un puntale da 200 μL tra un lavaggio e l'altro.
6. Centrifugare a 300 × g per 10 minuti a 4 °C e aspirare completamente il surnatante. Risospendere con cautela il pellet della cella con il volume appropriato di D-PBS freddo secondo la Tabella 1.
7. Miscelare immediatamente con cura con 450 μL di reagente a gradiente di densità (Soluzione per la rimozione dei detriti, vedere la Tabella dei materiali) e sovrapporre molto delicatamente con 2 mL di D-PBS freddo (vedere la Tabella 1).
   NOTA: Per ottenere i diversi strati di gradiente di densità, il D-PBS deve essere sovrapposto delicatamente goccia a goccia, con il minor "disturbo" possibile, 1 mL alla volta con una pipetta da 1 mL.
8. Centrifugare a 3.000 × g per 10 min a 4 °C con accelerazione lenta e freno lento (se 9 equivale a pieno, utilizzare 5).
9. Si formano tre fasi. Aspirare completamente le due fasi superiori e scartarle. Assicurarsi di non aspirare la terza fase inferiore.
10. Riempire con 1800 μL di D-PBS freddo e capovolgere delicatamente la provetta 3 volte.
11. Centrifugare a 1.000 × g per 10 minuti a 4 °C con accelerazione e freno a fondo e aspirare completamente il surnatante. Risospendere con cautela il pellet cellulare pipettandolo lentamente su e giù con 2 mL di D-PBS/BSA.

4. Isolamento magnetico delle cellule CD11b⁺

1. Centrifugare a 300 × g per 10 minuti a 4 °C e aspirare completamente il surnatante. Risospendere con cautela il pellet di cella in 90 μl di tampone D-PBS/BSA.
2. Aggiungere 10 μl della miscela di microsfere CD11b e mescolare bene con la pipetta.
3. Incubare per 15 minuti a 2-8 °C in frigorifero, non con ghiaccio; lavare le celle aggiungendo 1 mL di D-PBS/BSA e centrifugare a 300 × g per 10 min a 4 °C; Aspirare completamente il surnatante. Risospendere con cautela in 500 μL di D-PBS/BSA.
4. Avviare il programma POSSEL2 sul separatore seguendo le istruzioni sullo schermo. Posizionare le colonnine (vedi Tabella dei materiali) nel campo magnetico.
   NOTA: Per l'ordinamento delle celle magnetiche è possibile scegliere colonne piccole o grandi, in base al numero medio di celle previste. Le colonne piccole hanno una capacità fino a 1 × 10⁷ celle etichettate e le colonne grandi fino a 1 × 10⁸. Quando si isolano cellule da piccole strutture, come l'ipotalamo, si consigliano piccole colonne. I volumi dei reagenti sono diversi quando si utilizzano colonne di grandi dimensioni (vedere le istruzioni del produttore).
5. Bagnare le colonne (vedere la Tabella dei materiali) con 500 μL di D-PBS/BSA. Se la frazione negativa di cellule (CD11b^-) è necessaria per ulteriori analisi, posizionare una piastra di raccolta sotto le colonne e quindi applicare la sospensione cellulare nelle colonne.
6. Eseguire tre fasi di lavaggio aggiungendo 500 μl di D-PBS/BSA alla volta nella colonna, ogni volta attendendo che il tampone passi attraverso la colonna.
   NOTA: è importante evitare che la parte superiore della colonna si secchi, quindi si consiglia di non attendere il passaggio di tutto il tampone.
7. Trasferire l'effluente totale della frazione CD11b^- dai pozzetti della piastra di raccolta a provette da 15 millilitri.
8. Rimuovere la colonna dal separatore, posizionarla su una provetta da 5 mL e pipettare 1 mL di D-PBS/BSA nella colonna.
9. Eliminare immediatamente la frazione di cella marcata magneticamente applicando saldamente lo stantuffo fornito con la colonna.
10. Eventualmente, contare le cellule CD11b⁺ con un ematocitometro o qualsiasi altro metodo; Aspettatevi ~15.000 cellule per ipotalamo.
11. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 ×g per 10 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.

5. Analisi

1. Per l'analisi RT-qPCR, risospendere i pellet cellulari con il tampone qPCR (per la preparazione, vedere il passaggio 1.3) e conservare le provette a - 80 °C fino all'estrazione dell'mRNA. Isolare l'RNA totale, quindi elaborarlo e analizzarlo seguendo le linee guida MIQE¹⁴. Infine, sintetizzare il cDNA ed eseguire la qPCR utilizzando un dispositivo RT-PCR. Consulta la Tabella dei Materiali per tutti i kit utilizzati disponibili in commercio.
2. Per la quantificazione delle proteine, lavare i pellet cellulari con D-PBS (senza BSA) almeno 2 volte per eliminare la BSA. Quindi, risospendere i pellet cellulari da due ipotalami con 20 μL di tampone di lisi. Procedere con la quantificazione delle proteine con un kit per il dosaggio delle proteine (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: Abbiamo seguito le istruzioni del produttore¹⁵ per quantificare le proteine per eseguire il test di attività serina/treonina chinasi.
3. Per la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle cellule microgliali, risospendere il pellet in 1x HBSS. Trattare le cellule seguendo il protocollo del produttore del kit per il test di citometria a flusso (vedere la Tabella dei materiali). Quindi, risospendere le cellule trattate in 200 μL di tampone FACS (per la preparazione, vedere il passaggio 1.5) ed eseguire il FACS per rilevare le cellule stressate ossidativamente.
4. Per il test di fagocitosi, incubare le cellule selezionate in D-PBS/BSA con perle di lattice fluorescenti (vedere la Tabella dei materiali) per 30 minuti. Adatta il numero di perline per avere in media 4 perline per cella. Quindi centrifugare a 300 × g per 7 minuti a 4 °C, risospendere in 200 μL di tampone FACS e leggere l'emissione di fluorescenza da parte del FACS (λ_ex 575 nm; λ_em 610 nm).

Risultati

La valutazione della resa finale si basa sul livello di purezza e sulla quantità di cellule isolate e può essere determinata mediante RT-qPCR, conteggio delle cellule e quantificazione delle proteine. La purezza delle cellule magnetiche isolate dall'ipotalamo è stata confermata dall'analisi dell'espressione genica di CD11b, C1qa, Gad1 e GFAP con RT-qPCR (Figura 1). CD11b e C1qa sono espressi prevalentemente dalle microglia in uno stato stazionario, CNS¹⁶ e Gad1 e GFAP fungono rispettivamente da marcatore neuronale e astrocitico. Il cDNA totale di un ipotalamo variava da 55 a 98 ng. È interessante notare che solo la frazione positiva mostrava l'espressione di CD11b e C1qa, indicando l'assenza di qualsiasi potenziale perdita di cellule microgliali nella frazione negativa. I primer sono forniti nella Tabella 2.

Inoltre, i livelli minori dei marcatori neuronali e astrocitici assicurano che la stragrande maggioranza delle cellule isolate siano microglia, poiché i macrofagi e i monociti residenti costituiscono solo il 10% del panorama totale delle cellule immunitarie di un cervello sano^10,11. Questi risultati dimostrano l'efficacia della selezione magnetica e aprono la strada all'applicazione della RT-qPCR per valutare i livelli di espressione di tutti i geni di interesse nelle cellule microgliali ipotalamiche appena selezionate. Allo stesso modo, un'analisi RNAseq può essere eseguita su microglia selezionate ipotalamiche per avere una visione completa del loro trascrittoma.

La quantità delle cellule isolate è stata determinata mediante il conteggio delle cellule ed è risultata essere di ~15.000 cellule per ipotalamo (menzionato nella fase 4.10 del protocollo). Inoltre, è stata quantificata la concentrazione proteica nelle microglia selezionate, rivelando una concentrazione media di 0,5 μg/μL nelle cellule CD11b⁺ isolate da due ipotalami raggruppati (Figura 2). Questa conoscenza consente di eseguire diversi saggi a seconda di una soglia minima proteica. Inoltre, mettendo in comune più ipotalami, è possibile ottenere una concentrazione più elevata, ampliando la portata delle potenziali analisi. Le proteine estratte dalla microglia ipotalamica facilitano diverse tecniche, tra cui i saggi immunologici AlphaLISA e i saggi di attività chinasica.

Inoltre, il protocollo descritto consente ai ricercatori di eseguire diverse analisi ex vivo , consentendo l'esplorazione dell'attività microgliale e del loro ruolo nell'ipotalamo in contesti sia fisiologici che patologici. La quantificazione della produzione di ROS rappresenta un aspetto cruciale della risposta immunitaria microgliale¹⁷. Pertanto, dopo la separazione, la microglia può essere trattata con reagenti disponibili in commercio che consentono la rilevazione di ROS in cellule vive esibendo un aumento del segnale fluorescente dopo l'ossidazione. La microglia isolata magneticamente da tre ipotalami raggruppati è sufficiente per rilevare i ROS mediante FACS, come mostrato nella Figura 3A, sebbene i nostri risultati mostrino una variabilità piuttosto elevata della produzione di ROS cellulari tra le condizioni che abbiamo analizzato. È interessante notare che, con il kit commerciale sopra menzionato (vedi la Tabella dei Materiali), siamo stati anche in grado di valutare la vitalità delle cellule Cd11b+ selezionate, grazie a una colorazione di cellule morte immuni che mostra un aumento della fluorescenza al legame del DNA. In particolare, i nostri dati mostrano che il 99% delle cellule è vivo (Figura 3B). Le strategie di gating sono state utilizzate per distinguere tra cellule vive e morte, nonché cellule ossidativamente stressate e non stressate, in base alle loro proprietà di fluorescenza.

Un'altra caratteristica principale dell'attività microgliale è la fagocitosi, un processo dinamico e strettamente regolato che svolge un ruolo chiave nella sorveglianza immunitaria, nella riparazione dei tessuti e nell'omeostasi generale del sistema nervoso centrale¹⁸. Sorprendentemente, le cellule Cd11b⁺ selezionate con biglie accoppiate magneticamente possono essere coltivate per 24 ore e poi incubate con microsfere di lattice fluorescenti in diversi punti temporali per valutare, mediante FACS o microscopia a fluorescenza, alterazioni dell'attività fagocitaria in diverse condizioni. Le microglia appena selezionate possono anche essere esposte a microsfere fluorescenti o a qualsiasi tipo di particelle accoppiate a pHrodo (ad esempio, sinaptosomi) direttamente all'interno della provetta e la fagocitosi può essere valutata mediante analisi FACS.

In particolare, abbiamo incubato direttamente nella provetta contenente la sospensione cellulare selezionata, la microglia isolata da due ipotalami raggruppati o un intero cervello con perle di lattice fluorescenti. Le microglia che fagocitano almeno una perlina fluorescente possono essere distinte dalle cellule non fagocitiche mediante citometria a flusso, poiché le microglia fagocitiche mostreranno una maggiore fluorescenza. Per il gating sono stati utilizzati controlli negativi, non incubati con perline. In entrambe le nostre condizioni sperimentali (topi alimentati con cibo vs dieta ricca di grassi (HFD)) abbiamo osservato una percentuale molto bassa di microglia fagocitaria (Figura 4A). Tuttavia, questo risultato è mostrato qui per dimostrare l'efficacia di questo metodo, che, notevolmente, permette anche di differenziare tra cellule che fagocitano 1 perlina, 2 perle, 3 perle e così via (Figura 4B). Infine, tutti gli approcci omici potrebbero essere applicati alla microglia ipotalamica isolata. Suggeriamo di raggruppare tre ipotalami per avere abbastanza cellule per eseguire questi saggi.

Figura 1: Valutazione della purezza delle cellule CD11b⁺ mediante RT-qPCR. Quantificazione in cellule selezionate dell'espressione dell'mRNA dell'integrina CD11b, della subunità A C1q del complemento C1q, della decarbossilasi dell'acido glutammico Gad1 e della proteina acida fibrillare gliale GFAP normalizzata sui livelli di mRNA dei geni housekeeping Eef1a1 e Sdha. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Quantificazione delle proteine da cellule ipotalamiche dopo lo smistamento cellulare. Quantificazione della concentrazione proteica in cellule CD11b⁺ e CD11b^- . Sia le cellule CD11b⁺ che CD11b^- sono state lisate in 20 μL di tampone di lisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Rilevamento di ROS in cellule vive microgliali. Quantificazione di (A) cellule stressate ossidativamente e (B) cellule vive in una popolazione di cellule Cd11b⁺ selezionate, con relativi grafici di contorno FACS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Quantificazione dell'attività fagocitaria microgliale. (A) Quantificazione di cellule fagocitiche in cellule Cd11b⁺ selezionate da due ipotalami o da un cervello, con relativo diagramma di contorno FACS. (B) Percentuale di cellule fagocitiche in base al numero di perle fagocitate con relativo grafico di contorno FACS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Miscela di enzimi 2
Enzima A	Buffer Y	Enzima P
10 μl	20 μl	50 μl
	D-PBS	Soluzione per la rimozione dei detriti	Sovrapposizione D-PBS
Struttura da 15-100 mg	1000 μl	450 μl	2 ml

Tabella 1: Preparazione della miscela di dissociazione (i volumi si riferiscono a un singolo campione) e dei gradient overlayer.

Geni	Proteina			Inoltrare			Inverso
Itgam	Integrina alfa M (CD11b)			CTCATCACTGCTGGCCTACAA			GCAGCTTCATTCATCATGTCCTT
Sdha	Complesso della succinato deidrogenasi Subunità A della flavoproteina			CCCTCTCATATGTGGACATCAA			CAAGGTCTTGTCGATAACAGGT
C1qa	Componente 1 del complemento, sottocomponente q, polipeptide alfa			CGAGGTGTGGATCGAAAAGG			GAAGATGCTGTCGGCTTCAGT
Gad1	glutammato decarbossilasi 1			GACCAATCTCTGTGACTCGCTTAG			CTGGTCAGTGTATCGGAGGTCTT
Gfap	proteina acida fibrillare gliale			AGGTCCGCTTCCTGGAACA			GGGCTCCTTGGCTCGAA

Tabella 2: Sequenze di primer RT-qPCR.

Selezione cellulare con citometria a flusso (FACS)	Smistamento cellulare attivato magneticamente (MACS)
Anticorpi biochimici marcati con fluorescenza	Sfere magnetiche coniugate ad anticorpi
Differenziazione oltre i marcatori di superficie cellulare	Differenziazione solo in base ai marcatori della superficie cellulare
Resa iniziale sostanziale	Resa iniziale modesta
Più lento del MACS per la gestione simultanea di molti campioni	Più veloce del FACS per la gestione simultanea di molti campioni
Meno delicato del MACS	Più delicato del FACS

Tabella 3: Rappresentazione delle caratteristiche e dei limiti di FACS e MACS

Discussione

L'attuale protocollo prevede l'isolamento di microglia ipotalamiche da cervello di topo adulto appena perfuso mediante Magnetic-Activated Cell Sorting. I risultati presentati sopra confermano la purezza e la vitalità delle cellule isolate, nonché l'efficacia di questo metodo per caratterizzare funzionalmente le microglia ex vivo, ad esempio attraverso l'attività fagocitaria e la quantificazione della produzione di ROS. I metodi classici per l'isolamento di una specifica popolazione cellulare potrebbero essere utilizzati anche per le cellule microgliali. Il frazionamento a gradiente di densità è un metodo ben noto per la separazione di diverse celle e delle loro particelle in base alle loro dimensioni e/o densità. Questa tecnica potrebbe essere applicata per l'isolamento e la coltura di microglia primarie. Tuttavia, la purificazione della microglia adulta richiede un ulteriore smistamento delle cellule cerebrali isolate utilizzando lo smistamento cellulare attivato da fluorescenza o immunomagnetico.

In particolare, la FACS si basa su anticorpi biochimici marcati con fluorescenza per marcare le cellule e distinguerle in base a un gran numero di variabili che vanno oltre i marcatori di superficie, come le loro dimensioni e lo stato metabolico. Tuttavia, il processo di purificazione delle cellule potrebbe essere più lento e non così delicato, aumentando il numero di cellule morte, oltre a richiedere una notevole resa iniziale. Pertanto, il piccolo numero di microglia ipotalamiche è già un fattore limitante. MACS utilizza biglie magnetiche coniugate a determinati anticorpi contro specifici epitopi cellulari e potrebbe funzionare con una modesta resa iniziale facilitando gli studi specifici della regione sulla dinamica microgliale. A causa del forte campo magnetico delle microsfere, è richiesta un'etichettatura minima; quindi, è più delicato del FACS, garantendo il mantenimento dell'integrità della cella. Inoltre, il MACS è più veloce del FACS quando è necessaria la gestione simultanea di numerosi campioni. Ciò fornisce il netto vantaggio di mantenere un'elevata vitalità cellulare che potrebbe derivare anche da una piccola resa iniziale (Tabella 3).

Le sfide principali nell'isolamento delle microglia dall'ipotalamo, che possono essere affrontate efficacemente attraverso la tecnologia MACS, includono il raggiungimento di una resa finale sufficiente e la garanzia della conservazione dell'integrità cellulare. La quantità di cellule richiesta dipende dalla natura dell'analisi scelta dopo l'isolamento. Ad esempio, lo studio del ruolo funzionale della microglia in vitro richiede un numero considerevole di cellule. Ciò sottolinea l'importanza di un pool iniziale della stessa regione cerebrale da topi distinti con condizioni identiche prima di procedere al processo di isolamento. Al contrario, tecniche come il sequenziamento di singole cellule ad alta precisione non richiedono una grande popolazione cellulare e, a sua volta, non è necessario raggruppare diversi topi.

Per massimizzare la resa cellulare, è fondamentale attenersi a passaggi specifici del protocollo. La dissociazione efficace viene avviata tagliando l'ipotalamo in piccoli pezzi e quindi assicurandosi che vengano mantenuti nel tampone sul fondo del tubo durante il processo. Quindi, una combinazione di dissociazione meccanica con degradazione enzimatica della matrice extracellulare garantisce una resa cellulare significativamente elevata. Tuttavia, dovremmo essere estremamente cauti con l'interpretazione dei risultati poiché la dissociazione enzimatica eseguita a 37 °C potrebbe indurre cambiamenti trascrizionali e traduzionali¹⁹. Per prevenire alterazioni tecnicamente mediate, potrebbero essere utilizzati i controlli appropriati con inibitori trascrizionali e traduzionali¹⁹. È anche possibile procedere alla dissociazione enzimatica a una temperatura più bassa, ad esempio in una cella frigorifera (l'efficacia può essere ridotta), sebbene la dissociazione possa basarsi più sull'effetto meccanico che su quello enzimatico. Dopo la dissociazione, la sospensione cellulare viene prelavata e trasferita ai filtri e vengono eseguiti altri due lavaggi accurati delle provette per prevenire la perdita cellulare. Un altro passaggio critico è la rimozione dei detriti e della mielina ottenuta mediante la centrifugazione in gradiente di densità e la formazione di diversi strati. Pertanto, il raggiungimento di una notevole resa finale richiede una gestione meticolosa sia del tessuto ipotalamico che della sospensione cellulare, mantenendole sempre in ghiaccio per rallentare il metabolismo e mantenere il loro fenotipo in vivo .

Inoltre, ci sono alcuni punti a cui dovremmo prestare estrema attenzione per ottenere la massima purezza della microglia e mantenere il fenotipo delle cellule della microglia. Inizialmente, la perfusione, eseguita a 4 °C, è fondamentale per l'eliminazione di tutte le cellule CD11b⁺ circolanti garantendo la massima purezza potenziale della microglia. Tuttavia, in caso di rottura della barriera emato-encefalica, una percentuale maggiore di cellule immunitarie circolanti può colonizzare il cervello interferendo con lo studio delle microglia stesse. Per mitigare questo problema, un approccio alternativo prevede l'implementazione di un ciclo secondario di isolamento magnetico utilizzando microsfere coniugate all'anticorpo CD45. Il CD45 è un marcatore della superficie cellulare che mostra un'elevata espressione nei macrofagi²⁰ e il successivo flusso di questo ciclo comprende solo le cellule microgliali. Questa strategia di utilizzare due cicli di isolamento magnetico migliora la specificità del processo; Tuttavia, richiede più tempo, il che rappresenta un potenziale rischio di interruzione dell'integrità cellulare e/o del fenotipo della microglia. Pertanto, un fattore cruciale per preservare le caratteristiche funzionali e l'integrità delle cellule consiste nell'isolare rapidamente il tessuto cerebrale e mantenerlo in ghiaccio fino all'avvio del processo di dissociazione. In sintesi, questo approccio analitico migliora la comprensione della funzione e del comportamento della microglia, fornendo preziose informazioni sulle loro risposte dinamiche nell'ipotalamo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit per dissociazione cerebrale adulta	Miltenyi	130-107-677	Il kit contiene il tampone Z, il tampone Y, gli enzimi A e P, la soluzione per la rimozione dei detriti, il tampone A (per sciogliere l'enzima A).
Albumina Bovina FrV BSA	EuroMedex	04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, umano e topino - piccole dimensioni	Miltenyi	130-093-636
CellROX Green Kit di test per citometria a flusso	Invitrogen	C10492
Provetta da centrifuga, coperchio Snap-Pop 15 mL	CellTreat	978449
DPBS, calcio, magnesio, glucosio, piruvato	Gibco	14287-072
gentleMACS C Tubes	Miltenyi	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociatore con riscaldatori	Miltenyi	130-096-427
Cocktail di inibitori della fosfatasi Halt (100x)	Thermofisher	78420
Cocktail di inibitori della proteasi Halt, senza EDTA (100x)	Thermofisher	78437
HBSS (10x), calcio, magnesio, senza fenolo rosso	Thermofisher	14065056
Perle di lattice, polistirene modificato con carbossilato, rosso fluorescente	Sigma-Aldrich	L3280
LightCycler  480 SYBR Verde I Maestro	Roche	4707516001	Questo reagente è stato utilizzato per eseguire la PCR.
MACS SmartStrainers (70 &; micro; m)	Miltenyi	130-110-916
Kit di analisi delle proteine Micro BCA	Thermofisher	23235
M-PER Tampone di estrazione dei mammiferi	Thermofisher	78503
Colonne MS	Miltenyi	130-042-201	Indicato come piccole colonne nel protocollo.
Separatore MultiMACS Cell24 Plus	Miltenyi	130-098-637
PBSS, pH 7,4	Thermofisher	10010023
qScript XLT cDNA SuperMix	Quanta biosciences	733-1177	Il kit è stato utilizzato per sintetizzare il cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep Systems	Promega	Z6011	Il kit contiene 1-tioglicerolo e tampone BL (indicato come tampone di lisi nel protocollo) ed è stato utilizzato per isolare l'RNA totale.
Vacutainer safety-lok 21 G	Becton Dickinson	367282