PyOKR: un metodo semi-automatico per quantificare la capacità di tracciamento del riflesso optocinetico

Sommario

Descriviamo qui PyOKR, un metodo di analisi quantitativa semi-automatizzato che misura direttamente i movimenti oculari risultanti dalle risposte visive al movimento bidimensionale dell'immagine. Un'interfaccia utente basata su Python e un algoritmo di analisi consentono una maggiore produttività e misurazioni quantitative più accurate dei parametri di tracciamento oculare rispetto ai metodi precedenti.

Abstract

Lo studio delle risposte comportamentali agli stimoli visivi è una componente chiave per comprendere la funzione del sistema visivo. Una risposta notevole è il riflesso optocinetico (OKR), un comportamento innato altamente conservato necessario per la stabilizzazione dell'immagine sulla retina. L'OKR fornisce una solida lettura della capacità di tracciamento delle immagini ed è stato ampiamente studiato per comprendere i circuiti e la funzione del sistema visivo in animali di diversi background genetici. L'OKR si compone di due fasi: una fase di tracciamento lento in cui l'occhio segue uno stimolo fino al bordo del piano visivo e una fase veloce compensatoria saccada che ripristina la posizione dell'occhio nell'orbita. I metodi precedenti di quantificazione del guadagno, sebbene affidabili, sono laboriosi e possono essere soggettivi o derivati arbitrariamente. Per ottenere una quantificazione più rapida e riproducibile della capacità di tracciamento oculare, abbiamo sviluppato un nuovo programma di analisi semi-automatico, PyOKR, che consente la quantificazione del movimento di tracciamento oculare bidimensionale in risposta a qualsiasi stimolo direzionale, oltre ad essere adattabile a qualsiasi tipo di apparecchiatura di video-oculografia. Questo metodo fornisce il filtraggio automatizzato, la selezione delle fasi di tracciamento lento, la modellazione dei vettori oculari verticali e orizzontali, la quantificazione dei guadagni del movimento oculare rispetto alla velocità dello stimolo e l'organizzazione dei dati risultanti in un foglio di calcolo utilizzabile per confronti statistici e grafici. Questa pipeline di analisi quantitativa e semplificata, facilmente accessibile tramite l'importazione di PyPI, fornisce una misurazione rapida e diretta delle risposte OKR, facilitando così lo studio delle risposte comportamentali visive.

Introduzione

La stabilizzazione dell'immagine si basa su precise risposte oculomotorie per compensare il flusso ottico globale che si verifica durante l'automovimento. Questa stabilizzazione è guidata principalmente da due risposte motorie: il riflesso optocinetico (OKR) e il riflesso vestibolo-oculare (VOR)^1,2,3. Il lento movimento globale attraverso la retina induce l'OKR, che suscita la rotazione riflessiva dell'occhio nella direzione corrispondente per stabilizzare l'immagine ^1,2. Questo movimento, noto come fase lenta, è interrotto da saccadi compensatorie, note come fase veloce, in cui l'occhio si resetta rapidamente nella direzione opposta per consentire una nuova fase lenta. Qui, definiamo queste saccadi di fase rapida come movimenti di tracciamento oculare (ETM). Mentre il VOR si basa sul sistema vestibolare per suscitare movimenti oculari per compensare i movimenti della testa³, l'OKR viene avviato nella retina dall'attivazione di ON e dalla successiva segnalazione al sistema ottico accessorio (AOS) nel mesencefalo ^4,5. A causa della sua dipendenza diretta dai circuiti retinici, l'OKR è stato spesso utilizzato per determinare la capacità di tracciamento visivo sia in ambito di ricerca che clinico ^6,7.

L'OKR è stato ampiamente studiato come strumento per valutare la capacità visiva di base ^2,6,8, lo sviluppo del DSGC ^9,10,11,12, le risposte oculomotorie¹³ e le differenze fisiologiche tra i background genetici⁷. L'OKR viene valutato in animali con testa fissa presentati con uno stimolo in movimento¹⁴. Le risposte oculomotorie vengono in genere catturate utilizzando una varietà di strumenti video e i movimenti di tracciamento oculare vengono catturati come forme d'onda OKR nelle direzioni orizzontale e verticale⁹. Per quantificare la capacità di tracciamento, sono state descritte due metriche principali: il guadagno di tracciamento (la velocità dell'occhio rispetto alla velocità dello stimolo) e la frequenza ETM (il numero di saccadi di fase veloci in un determinato intervallo di tempo). Il calcolo del guadagno è stato utilizzato storicamente per misurare direttamente la velocità angolare dell'occhio per stimare la capacità di inseguimento; Tuttavia, questi calcoli sono laboriosi e possono essere derivati arbitrariamente sulla base di metodi di raccolta video-oculografici e successiva quantificazione. Per una valutazione OKR più rapida, il conteggio della frequenza ETM è stato utilizzato come metodo alternativo per misurare l'acuità di tracciamento⁷. Sebbene ciò fornisca una stima abbastanza accurata della capacità di tracciamento, questo metodo si basa su una metrica indiretta per quantificare la risposta di fase lenta e introduce una serie di distorsioni. Questi includono un bias dell'osservatore nella determinazione delle saccadi, una dipendenza da risposte saccadiche temporalmente coerenti in una determinata epoca e l'incapacità di valutare l'entità della risposta di fase lenta.

Al fine di affrontare queste preoccupazioni con gli attuali approcci di valutazione OKR e per consentire una quantificazione approfondita dei parametri OKR ad alto rendimento, abbiamo sviluppato un nuovo metodo di analisi per quantificare le forme d'onda OKR. Il nostro approccio utilizza una piattaforma software accessibile basata su Python chiamata "PyOKR". Utilizzando questo software, la modellazione e la quantificazione delle risposte in fase lenta degli OKR possono essere studiate in modo più approfondito e con una maggiore parametrizzazione. Il software fornisce valutazioni quantitative accessibili e riproducibili delle risposte a una miriade di stimoli visivi e anche un tracciamento visivo bidimensionale in risposta al movimento orizzontale e verticale.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti presso la Johns Hopkins University School of Medicine (JHUSOM) sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il JHUSOM. Tutti gli esperimenti eseguiti presso l'Università della California, San Francisco (UCSF) sono stati eseguiti in conformità con i protocolli approvati dall'UCSF Institutional Animal Care and Use Program.

1. Raccolta dei dati comportamentali

1. Registra i movimenti oculari OKR utilizzando il metodo di video-oculografia preferito per generare dati d'onda (ad esempio, una serie temporale dell'angolo di sguardo dell'occhio in coordinate sferiche).
   NOTA: I dati rappresentativi raccolti presso JHUSOM sono stati ottenuti utilizzando la chirurgia di impianto della testa e la video-oculografia, come precedentemente descritto ^9,13 (Figura 1). I dati rappresentativi raccolti dall'UCSF sono stati ottenuti attraverso l'intervento chirurgico di impianto della testa e il metodo della video-oculografia, come descritto in precedenza¹⁰ (Figura 7).
   1. Prendere nota dei parametri di stimolo e registrazione: frequenza dei fotogrammi di registrazione, velocità e direzione dello stimolo e periodi di tempo tra e dopo le epoche di stimolo. Per gli stimoli sinusoidali, notare anche l'ampiezza e la frequenza dell'onda di stimolo.
2. Esportare i dati delle onde raccolti come file . File CSV contenente i dati delle onde orizzontali e verticali (azimut ed elevazione).
   1. Organizza i dati dell'ondata come file . File CSV con due colonne contenenti dati orizzontali (epxWave) e dati verticali (epyWave).

2. Installazione del software di analisi

1. Scarica e installa Python.
   1. Per la supervisione del grafo, installa Spyder tramite Anaconda.
   2. Per assicurarti che i grafici funzionino correttamente in Spyder, vai su Strumenti > Preferenze > Console Ipython > Grafica > Backend grafico. Impostare Inline su Automatico.
2. Crea un nuovo ambiente Anaconda con Python.
3. Installa PyOKR tramite PyPi con pip install PyOKR per installare la versione più recente insieme alle dipendenze del pacchetto (File di codifica supplementare 1 e File di codifica supplementare 2)
4. Se si utilizza un computer Windows, eseguire da PyOKR import OKR_win as o e poi o.run().
5. Se si utilizza un computer Mac, eseguire da PyOKR import OKR_osx as o e poi o.run().

3. Analisi dei dati delle onde

1. Inizializzazione dell'analisi e importazione dei file
   1. Eseguire o.run() in uno script .py per aprire l'interfaccia utente.
   2. In File, utilizzare la funzione Apri o il comando Ctrl+O [comando iOS] per aprire un browser che consentirà all'utente di selezionare il file wave desiderato.
   3. In File, utilizzare il pulsante Esporta cartella o il comando Ctrl+E per aprire un browser di cartelle che consentirà la selezione di una cartella di output in cui verranno esportate le analisi finali.
   4. Immettere il nome del file di analisi finale nel file di output in un formato consigliato, ad esempio AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis.
   5. Impostare il programma per un singolo animale utilizzando il comando Imposta oggetto in File o il comando Ctrl+S per inizializzare il set di dati per un singolo animale.
2. Definizione dei parametri del file wave
   1. Per iniziare a impostare i parametri dello stimolo, definire la direzionalità in Seleziona direzione stimolo selezionando una delle quattro direzioni cardinali. Per gli stimoli sinusoidali, selezionarne uno che contenga (Orizzontale) o (Verticale) di conseguenza, con la direzione cardinale che definisce la direzione iniziale dell'onda sinusoidale.
   2. Impostare il tipo di stimolo in Seleziona tipo di stimolo come Unidirezionale, Oscillatorio o Obliquo.
   3. Dopo aver impostato la direzionalità, importare il proprio set di dati sulla posizione dello stimolo (Importa i propri dati vettoriali di stimolo) o generare automaticamente un vettore basato sui parametri (Genera vettore di stimolo dai parametri). Se si importa un vettore di stimolo, procedere con 3.2.3.1 e quindi andare al passaggio 3.3. Se si genera un vettore di stimolo, procedere con i passaggi successivi.
      1. Se si importano i propri dati vettoriali, importare i valori di distanza dello stimolo (cioè una serie temporale che descrive la distanza di spostamento dello stimolo tra ogni frame di acquisizione adiacente) nello stesso formato descritto nel passaggio 3.2.1. Inoltre, analizza l'intero set di dati come un'unica epoca piuttosto che suddividerlo in singole epoche, poiché la funzionalità per il sottoinsieme del valore di stimolo importato non è stata aggiunta a partire da PyOKR v1.1.2.
   4. In Parametri stimolo, impostare i parametri dello stimolo utilizzato per la raccolta dei dati.
      1. Imposta la durata dell'assenza di stimoli all'inizio (testa) e alla fine (coda) di una determinata prova con testa e coda.
      2. Imposta la quantità di tempo in cui viene mostrato uno stimolo, la quantità di tempo di assenza di stimolo dopo e il numero di epoche totali all'interno di una determinata prova con rispettivamente la durata dell'epoca, la lunghezza del post-stimolo e il numero di epoche.
      3. Per gli stimoli unidirezionali e obliqui, impostare la velocità dello stimolo in gradi al secondo con Velocità orizzontale e Velocità verticale.
      4. Impostare la velocità di acquisizione della fotocamera di raccolta con Acquisisci frequenza fotogrammi.
      5. Per gli stimoli sinusoidali, generare l'onda sinusoidale per modellare stimoli oscillatori con frequenza e ampiezza.
   5. Dopo la parametrizzazione, creare il modello appropriato dalle informazioni di stimolo inserite sopra con Genera vettore di stimolo dai parametri.
   6. Selezionare una data epoca per lo stimolo immesso utilizzando Seleziona epoca per scorrere il file d'onda totale.
3. Selezione supervisionata delle fasi di tracciamento
   1. Per identificare le regioni di tracciamento lento, selezionare automaticamente le saccadi di fase veloce con la regolazione preliminare facendo clic su Dati non filtrati o Dati filtrati, che etichetteranno le potenziali saccadi in base alle variazioni di velocità massima.
   2. In Dati non filtrati, verificare che le saccadi siano selezionate correttamente con un punto blu. Se la selezione automatica non è accurata, rimuovere manualmente i punti con il pulsante sinistro del mouse (LMB) o aggiungere punti con il pulsante destro del mouse (RMB). Quando le saccadi di fase veloce sono state selezionate in modo adeguato, salvare i punti con il pulsante centrale del mouse (MMB) e chiudere il grafico.
   3. Se si desidera applicare un filtro automatico, impostare una soglia Z-Score e fare clic su Dati filtrati per filtrare automaticamente le saccadi. Se necessario, utilizzare la stessa supervisione manuale descritta al punto 3.3.2 per rimuovere qualsiasi rumore.
   4. Dopo aver selezionato correttamente la saccadide, premere Regolazione punto per selezionare la regione da rimuovere. Modificare i punti superiore e inferiore tramite uno schema di controllo simile a quello descritto in precedenza nel passaggio 3.3.2. Modifica i punti superiori (verdi) con il tasto LMB o RMB e modifica i punti inferiori (rossi) con MAIUSC+LMB o MAIUSC+RMB. Quando i punti sono posizionati correttamente, usa l'MMB per salvare i punti.
      NOTA: se si utilizza un Mac, la regolazione del punto inferiore e superiore si trova in due pulsanti separati e segue lo stesso schema di controllo descritto al punto 3.3.2.
4. Analisi delle fasi di slow-tracking
   1. Impostare l'ordine del modello polinomiale utilizzando Imposta ordine polinomiale per definire il modello polinomiale che verrà adattato alle singole fasi lente.
      NOTA: Per gli stimoli unidirezionali o obliqui, il valore predefinito è 1 poiché la linearità è necessaria per calcolare il guadagno di tracciamento. Per gli stimoli sinusoidali, è necessario un ordine superiore per modellare la curva dell'onda, con un valore predefinito di 15.
   2. Per analizzare la traccia, selezionare Analisi finale per generare i modelli di fase lenta (Figura 2) per le fasi lente selezionate (vedere Figura 2A-D) e calcolare le distanze, le velocità e i guadagni di tracciamento medi nell'epoca (Figura 2E).
   3. Per visualizzare il grafico bidimensionale (2D) o tridimensionale (3D) delle regioni selezionate, selezionare rispettivamente Visualizza grafico 2D o Visualizza grafico 3D .
   4. Selezionare Aggiungi epoca per salvare i valori raccolti generati nel passaggio 3.4.2. Per visualizzare tutti i valori aggiunti per un determinato animale e le medie delle prove raccolte, selezionare Visualizza set di dati corrente.
   5. Dopo aver aggiunto un'epoca, scorrere il resto del file con Seleziona epoca, seguendo i passaggi da 3.3.1 a 3.4.4.
   6. Una volta che un file wave è stato completamente analizzato, ripeti questo processo per tutti gli altri file per un determinato animale aprendo nuovi file, impostando i parametri appropriati e analizzandoli di conseguenza. Ripetendo i passaggi 3.2.1-3.4.5 per ogni file, generare un set di dati finale contenente tutti i dati delle onde per un determinato animale.
5. Esportazione finale dei dati
   1. Al termine dell'analisi dei dati per un determinato animale, con tutte le direzioni o gli stimoli analizzati, esportare il set di dati tramite Esporta dati.
      NOTA: Il set di dati grezzo verrà esportato in base al nome del file di output e salvato lungo il percorso impostato dalla cartella di output come CSV contenente i dati delle singole epoche con la media totale per ciascun parametro di stimolo.
   2. Dopo aver esportato un singolo animale, reinizializzare il set di dati con CTRL+S e quindi ripetere tutti i passaggi precedenti per analizzare un nuovo animale.
   3. Se necessario, riorganizzare tutti i dati di output raccolti per più animali per un'analisi più semplice utilizzando il comando Ordina dati nella scheda Analisi .
      NOTA: Questa funzione compilerà e ordinerà tutti i valori medi per tutti i file di animali analizzati memorizzati all'interno della cartella di output per consentire una più facile generazione di grafici e confronti statistici. L'ordinamento dipende dalla denominazione dei file a partire dalla v1.1.2. Utilizzare lo schema di denominazione consigliato come descritto nel passaggio 3.1.4 per ogni file (ad esempio, WT_123_Analysis).

Risultati

Per convalidare il metodo di analisi sopra descritto, abbiamo quantificato il guadagno di tracciamento OKR su tracce d'onda raccolte da topi wild-type e da un mutante knockout condizionale con un deficit di tracciamento noto. Inoltre, per testare la più ampia applicabilità del nostro metodo di analisi, abbiamo analizzato tracce derivate da una coorte separata di topi wild-type acquisiti utilizzando un diverso metodo di raccolta video-oculografica. Il filtraggio automatico delle saccadi facilita l'elaborazione e l'analisi dei dati OKR (Figura 3). Utilizzando le registrazioni di stimoli unidirezionali e sinusoidali (Figura 1D), abbiamo calcolato i guadagni di tracciamento OKR nelle quattro direzioni cardinali (Figura 2F) per gli animali selvatici (n = 13) agli stimoli unidirezionali e anche i guadagni di tracciamento in risposta a stimoli sinusoidali orizzontali e verticali (Figura 4). La disparità nella capacità di tracciamento rispetto alla direzione dello stimolo sia per gli stimoli unidirezionali che sinusoidali è costantemente osservata in tutti i topi wild-type, con risposte orizzontali altrettanto robuste che dimostrano guadagni di tracciamento significativamente più elevati rispetto alle risposte verticali, come è stato descritto². Inoltre, i guadagni di tracciamento asimmetrico tra le risposte verso l'alto e verso il basso sono stati osservati anche nei topi wild-type che utilizzano entrambi i metodi di raccolta video-oculografica, come è stato precedentemente riportato ^2,10. Le grandezze relative e la coerenza dei guadagni di tracciamento rispetto alla caratterizzazione pubblicata delle risposte OKR indicano che i guadagni di tracciamento calcolati utilizzando il software riflettono accuratamente la capacità di tracciamento. Oltre ai calcoli del guadagno unidirezionale, il movimento orizzontale e verticale degli occhi può essere modellato simultaneamente (Figura 5), consentendo una ricostruzione tridimensionale del movimento degli occhi in risposta a un dato stimolo. Ciò fornisce un'ulteriore capacità di quantificazione utile per studi futuri che indagano le risposte orizzontali e verticali ad accoppiamento incrociato⁹.

Per convalidare l'utilità del software per l'identificazione di cambiamenti comportamentali significativi in diverse condizioni sperimentali, abbiamo rianalizzato i nostri dati pubblicati⁹ per confermare che i deficit nel tracciamento verticale valutati in quello studio mediante il conteggio manuale delle saccadi di fase veloce si riflettono nel monitoraggio dei guadagni utilizzando la metodologia qui presentata. Lavori precedenti hanno dimostrato che l'inattivazione genetica nella retina del fattore di trascrizione T-box Transcription Factor 5 (Tbx5) attraverso knockout condizionale con Protocaderina 9-Cre (Pcdh9-Cre) causa la perdita specifica di cellule gangliari selettive per la direzione ON sintonizzate verso l'alto (up-oDSGCs), e che Tbx5 Flox/Flox (Tbx5f/f); I mutanti Pcdh9-Cre mostrano una perdita specifica del tracciamento OKR verticale⁹. L'analisi quantitativa con il metodo qui descritto mostra che Tbx5f/f; Gli animali Pcdh9-Cre mantengono i normali guadagni di tracciamento orizzontale (Figura 6A), simili a quelli descritti in precedenza e ottenuti mediante conteggio manuale delle saccadi di fase veloce (ETM) (Figura 2F); tuttavia, questi topi mostrano una significativa perdita di tracciamento verticale, con guadagni vicini allo zero in risposta sia agli stimoli verso l'alto che verso il basso (Figura 6B, C). Inoltre, l'analisi delle risposte sinusoidali conferma che gli animali Tbx5 cKO mostrano maggiori guadagni di tracciamento orizzontale mentre mostrano un tracciamento verticale significativamente ridotto (Figura 6D-F). Una rianalisi di questo fenotipo precedentemente descritto utilizzando PyOKR dimostra la precisione e la sensibilità di questa nuova metodologia, che consente confronti quantitativi delle risposte OKR in topi di diversi ceppi genetici.

Infine, abbiamo analizzato le tracce OKR verticali wild-type raccolte presso l'UCSF per convalidare l'utilità dell'applicazione software con diversi metodi di video-oculografia e parametri di stimolo. I dati dell'UCSF sono stati raccolti utilizzando un sistema di proiezione emisferica in cui i reticoli mobili vengono presentati al topo attraverso la riflessione di un proiettore con lunghezza d'onda di 405 nm su un emisfero che circonda l'animale con la testa fissa¹⁰ (Figura 7A). I reticoli verticali unidirezionali sono stati presentati ai topi a una velocità di 10 gradi al secondo e le risposte OKR sono state registrate a intervalli di 60 secondi (Figura 7B, C). Le tracce verticali sono state analizzate quantitativamente tramite PyOKR e le risposte verso l'alto sono state confrontate con le risposte verso il basso (Figura 7D). Le risposte al rialzo sono state significativamente più forti di quelle al ribasso, come previsto¹⁰; tuttavia, i guadagni di tracciamento sono stati leggermente ridotti rispetto alle tracce registrate a JHUSOM (Figura 2F). Inoltre, la quantificazione delle risposte sinusoidali è stata analizzata tramite PyOKR (Figura 7E) e una significativa asimmetria nelle risposte verticali agli stimoli che si muovono sinusoidalmente si riflette nei guadagni calcolati (Figura 7F). Le differenze tra i valori di guadagno raccolti presso JHUSOM e UCSF possono essere attribuite a differenze tra i parametri dello stimolo, tra cui diverse velocità, tipi e lunghezze d'onda dello stimolo; tuttavia, la coerenza complessiva che osserviamo nella nostra analisi dei dati ottenuti utilizzando ciascun metodo di raccolta mostra che il nostro PyOKR può essere facilmente adattato oltre il nostro sistema di raccolta dati JHUSOM OKR e applicato ad altre registrazioni OKR, indipendentemente dai metodi di video-oculografia. Questi risultati dimostrano che la piattaforma software qui descritta è accurata e può essere generalmente applicata allo studio delle risposte oculomotorie, consentendo confronti quantitativi precisi tra animali appartenenti a gruppi diversi per approfondire lo studio dei circuiti di stabilizzazione dell'immagine visiva.

Figura 1: Raccolta dei dati di risposta agli OKR. (A) Apparecchio per arena virtuale OKR per la stimolazione comportamentale, come precedentemente descritto ^9,13. Quattro monitor circondano un animale con la testa fissa (1), visualizzando uno stimolo a scacchiera in continuo movimento (2). Il tamburo virtuale può presentare un movimento unidirezionale in tutte e quattro le direzioni cardinali, nonché stimoli sinusoidali oscillatori. L'occhio sinistro del mouse è illuminato da una luce a infrarossi (IR) e registrato con una fotocamera (3) per registrare le risposte del sistema visivo riflesse nell'eye tracking. (B) L'analisi dell'eye tracking avviene catturando la pupilla e un riflesso corneale generato dalla luce IR. La raccolta dei dati e il calcolo dei movimenti oculari in risposta al tamburo virtuale sono stati eseguiti come descritto in precedenza ^9,13. (C) Schema dei vettori oculari che si muovono verticalmente (onda Y) e orizzontalmente (onda X). (D) Tracce campione della risposta di inseguimento di un occhio al movimento unidirezionale verso l'alto e all'indietro, e anche al movimento sinusoidale verticale e orizzontale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi dell'inseguimento delle risposte visive unidirezionali. (A-D) Identificazione e selezione delle fasi di inseguimento lento per l'analisi del guadagno. Vengono mostrate tracce unidirezionali di esempio con risposte visive al movimento in avanti (A), indietro (B), verso l'alto (C) e verso il basso (D) in relazione all'occhio del topo. Le fasi lente sono identificate dall'aggiunta di punti rossi e verdi descritti nel passaggio 3 per rimuovere le saccadi e le fasi lente selezionate sono evidenziate in giallo. Le regressioni polinomiali vengono sovrapposte alle tracce come linee. (E) Quantificazione delle tracce del campione (A-D) come organizzato nella lettura PyOKR. Per ogni traccia, vengono calcolate le velocità XY totali e i rispettivi guadagni, indipendentemente dalla direzionalità. Nelle risposte unidirezionali, queste velocità totali rifletteranno solitamente la velocità individuale in una certa direzione; Tuttavia, per le risposte sinusoidali, questo valore rifletterà la velocità complessiva media dell'occhio. Le componenti della velocità orizzontale e verticale sono suddivise per mostrare la velocità in ciascuna rispettiva direzione. Il guadagno viene quindi calcolato in base alle velocità di stimolo presentate. (F) Guadagni di tracciamento calcolati di animali selvatici (n = 13) nelle quattro direzioni cardinali rispetto alla quantificazione ETM associata. I dati sono presentati come media ± SD. Dati analizzati con un'ANOVA unidirezionale con confronti multipli. *p<0.05, **p<0.01,***p<0.005, ****p<0.0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Il filtraggio automatico delle saccadi facilita l'elaborazione e l'analisi dei dati OKR. (A-D) Il filtraggio automatico delle tracce dalla Figura 2A-D rimuove le saccadi e modella solo il movimento di fase lento rimuovendo i rapidi cambiamenti di velocità e unendo insieme le fasi lente. La pendenza finale rappresenta il movimento totale degli occhi nell'arco di una data epoca. (E) Quantificazione dei guadagni dai dati del campione filtrati, come organizzato nella lettura PyOKR. (F) Il confronto dei valori di guadagno tra le tracce oculari del campione non filtrato e quelle filtrate non riflette differenze significative. I dati sono presentati come media ± SD. Dati analizzati con un test U di Mann-Whitney tra risultati non filtrati e filtrati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Derivazione dei guadagni di tracciamento in risposta a stimoli visivi oscillatori. (A,B) Le risposte ai movimenti oculari verticali (A) e orizzontali (B) a stimoli in movimento sinusoidale possono essere modellate in relazione ai parametri di stimolo oscillatorio definiti. Le regioni selezionate sono etichettate in giallo con l'approssimazione polinomiale sovrapposta alla traccia. Un modello dello stimolo è presentato come un'onda sinusoidale arancione dietro la traccia per consentire il riferimento a ciò che lo stimolo è in ogni punto. (C) I calcoli del guadagno delle risposte sinusoidali wild-type (n = 7) riflettono le risposte asimmetriche tra la capacità di tracciamento orizzontale e verticale. I dati sono presentati come media ± SD. Dati analizzati con un'ANOVA unidirezionale con confronti multipli. **p<0.01,***p<0.005. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Il tracciamento direzionale può essere modellato nelle sue componenti orizzontale e verticale. (A) Componente verticale di un'onda di tracciamento oculare in risposta a uno stimolo verso l'alto. (B) Componente orizzontale di un'onda di tracciamento oculare in risposta a uno stimolo verso l'alto. (C) Traiettoria complessiva dell'occhio in entrambe le direzioni verticale e orizzontale. (D) Modello tridimensionale del vettore di movimento dell'occhio nel tempo in risposta al movimento verso il basso. I dati di traccia non elaborati vengono visualizzati in rosso e il modello di regressione della traiettoria viene visualizzato in blu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Analisi dell'OKR in Tbx5f/f; I topi Pcdh9-Cre mostrano deficit significativi nei guadagni di tracciamento verticale unidirezionale. (A) Tbx5f/f; Gli animali Pcdh9-Cre non mostrano cambiamenti significativi nel guadagno di tracciamento orizzontale. (B,C) Tbx5f/f; Gli animali Pcdh9-Cre mostrano una significativa riduzione del guadagno nelle loro risposte verticali: verso l'alto (B) e verso il basso (C). (D,E) Risposte sinusoidali di Tbx5f/f; Animali Pcdh9-Cre in risposta a stimoli oscillatori orizzontali (D) e verticali (E). (f) Quantificazione di Tbx5f/f; Le risposte oscillatorie di Pcdh9-Cre mostrano aumenti significativi dei guadagni di tracciamento orizzontale, ma mostrano diminuzioni delle risposte verticali. I dati sono presentati come media ± SD. Dati analizzati con i test U di Mann-Whitney. *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Applicazione di PyOKR ai dati acquisiti da metodi alternativi di video-oculografia. (A) Apparecchio per la stimolazione virtuale del tamburo OKR, come descritto¹⁰. Un proiettore DLP con lunghezza d'onda di 405 nm viene riflesso tramite uno specchio convesso su un emisfero per creare un tamburo virtuale che circonda il campo visivo dell'animale. I movimenti oculari vengono misurati utilizzando una telecamera NIR posizionata all'esterno dell'emisfero. Le griglie a barre unidirezionali e sinusoidali sono mostrate a un animale a testa fissa in direzione verticale. (B,C) Le fasi di tracciamento verso l'alto (B) e verso il basso (C) vengono identificate e selezionate per l'analisi quantitativa. Le fasi lente sono evidenziate in giallo. (D) Guadagni di tracciamento calcolati dal tracciamento verticale di animali selvatici (n=5) utilizzando i metodi qui descritti. Si osserva una capacità di tracciamento asimmetrica, con una significativa diminuzione dell'inseguimento verso il basso. (E) Risposta oscillatoria a stimoli sinusoidali modellata per quantificare i guadagni di tracciamento negli animali wild-type (n=8). Le fasi lente sono evidenziate in giallo. (F) La quantificazione dei guadagni sinusoidali rivela una diminuzione dei guadagni di tracciamento verso il basso rispetto ai guadagni verso l'alto. I dati sono presentati come media ± SD. Dati analizzati con i test U di Mann-Whitney. *p<0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File di codifica supplementare 1: PyOKR Windows Fare clic qui per scaricare questo file.

File di codifica supplementare 2: PyOKR Mac Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

PyOKR offre diversi vantaggi per lo studio delle risposte visive riflesse nei movimenti oculari. Queste includono l'accuratezza, l'accessibilità e le opzioni di raccolta dei dati, oltre alla capacità di incorporare la parametrizzazione e le velocità di stimolo variabili.

La valutazione diretta del guadagno di tracciamento oculare fornisce una caratterizzazione accurata del movimento oculare che è una metrica quantitativa più diretta rispetto al tradizionale conteggio manuale delle saccadi di fase veloce (ETM). Sebbene utile, il conteggio delle saccadi fornisce una valutazione indiretta del movimento di tracciamento effettivo. La piattaforma software PyOKR fornisce la quantificazione diretta delle velocità di tracciamento, tenendo conto di parametri aggiuntivi tra cui le ampiezze delle saccadi e la lunghezza delle fasi lente. Inoltre, il conteggio delle saccadi in fase rapida si basa sulla valutazione della frequenza delle saccadi in un determinato periodo di tempo, richiedendo che ogni traccia abbia poco o nessun rumore, comprese le saccadi casuali dovute allo stress degli animali. Questi fattori fanno sì che molte tracce raccolte siano inutilizzabili e, quindi, aggiungono molto tempo per la raccolta dei dati al fine di valutare con precisione l'eye tracking. Tuttavia, il software qui descritto affronta questo problema quantificando direttamente le singole fasi lente all'interno di una data traccia e calcolando i guadagni in punti istantanei lungo la traccia. Raggiunge questo obiettivo confrontando la velocità del movimento dell'occhio con la velocità dello stimolo in un dato punto. Poiché la frequenza saccadica non è più il parametro determinante per l'analisi, il rumore può essere facilmente rimosso dalla supervisione dell'utente, riducendo l'impatto del rumore sulla qualità dell'analisi. Ciò consente di raccogliere dati più utilizzabili e di ottenere una maggiore potenza statistica durante l'analisi di questi dati, aumentando l'accuratezza e la riproducibilità nella quantificazione dell'eye tracking e nella caratterizzazione dei parametri OKR per singoli topi e diversi gruppi di topi. Il filtraggio automatizzato delle saccadi basato su rapidi cambiamenti nella velocità oculare rilevati tramite un metodo Z-score è stato utilizzato anche per caratterizzare il guadagno di tracciamento¹⁰. Per incorporare questo metodo di filtraggio all'interno del software, abbiamo incluso questo tipo di filtraggio della velocità, ma con strumenti aggiuntivi come la parametrizzazione della soglia e la supervisione saccadica manuale per ridurre i potenziali errori generati da questo approccio. Se le tracce grezze vengono utilizzate per l'analisi invece di utilizzare il filtraggio automatico, i rapidi cambiamenti nel movimento degli occhi causati da saccadi, battiti di ciglia o sofferenza del mouse vengono identificati attraverso variazioni di velocità massimali tramite una stima della densità del kernel gaussiana della velocità delle tracce. Ciò consente la selezione automatica delle regioni di segmentazione e, infine, la rimozione in base alla supervisione manuale dell'utente. La supervisione manuale fornisce una maggiore tolleranza alle tracce rumorose, consentendo agli utenti di correggere rapidamente le marcature di falsi positivi o falsi negativi per rapidi cambiamenti oculari. Inoltre, poiché PyOKR utilizza approssimazioni polinomiali per modellare il movimento generale dell'occhio in una data direzione, il rumore nei singoli punti viene attenuato, consentendo di valutare le velocità di traiettoria con una certa tolleranza per il rumore nella traccia. Solo in caso di scarsa qualità dei dati sull'intera traccia o di calibrazione impropria durante la raccolta dei dati, il software non sarà in grado di generare un'analisi accurata dei dati. Nel complesso, incorporando strumenti di supervisione dell'utente, filtraggio e calcolo del guadagno istantaneo, l'applicazione software PyOKR qui descritta genera guadagni di tracciamento con elevata precisione e metriche più dirette rispetto ai metodi precedenti.

PyOKR ha anche molte funzionalità che consentono di personalizzare le analisi OKR per soddisfare le esigenze degli utenti. L'inserimento dei parametri di stimolo, così come dei vettori di stimolo grezzi, consente all'utente di definire con precisione qualsiasi stimolo desiderato. Questi possono includere stimoli unidirezionali, sinusoidali o obliqui, che il software può utilizzare per generare guadagni di tracciamento accurati per le risposte visive associate. Con la parametrizzazione dello stimolo di questa metodologia, i guadagni istantanei calcolati ad ogni fotogramma possono essere generati in modo affidabile con elevata precisione, indipendentemente dallo stimolo immesso in ingresso. Sebbene i dati sugli stimoli obliqui non siano stati analizzati qui, i guadagni accurati possono essere calcolati attraverso vettori di velocità XY scomposti per ricostruire un angolo obliquo, consentendo calcoli accurati del guadagno degli stimoli obliqui. Attraverso la parametrizzazione accessibile delle impostazioni degli stimoli, il nostro strumento è ampiamente applicabile al tracciamento delle onde in risposta a qualsiasi stimolo visivo. Inoltre, il software facilita una maggiore produttività e una quantificazione riproducibile rispetto ai metodi precedenti. L'ordinamento delle tracce OKR richiede molto tempo e lavoro; tuttavia, l'interfaccia utente semplificata di PyOKR è in grado di filtrare facilmente molte tracce a una velocità più elevata di quanto fosse possibile in precedenza. Ciò non solo consente una quantificazione più rapida delle tracce, ma rivela anche ulteriori parametri OKR, tra cui la quantificazione diretta delle velocità oculari, le componenti vettoriali direzionali del movimento oculare e i guadagni istantanei relativi allo stimolo sia nelle componenti orizzontali che verticali del vettore di movimento. Inoltre, data l'identificazione automatizzata delle saccadi e il calcolo delle velocità di tracciamento offerti dal nostro metodo, la distorsione del potenziale sperimentatore nell'analisi dei dati è notevolmente ridotta rispetto ad altri metodi di quantificazione, come il conteggio manuale ETM o il filtraggio automatico delle tracce, che possono generare falsi negativi. Inoltre, è possibile generare e compilare automaticamente grandi quantità di dati comportamentali per semplificare l'analisi a valle. Attraverso le funzioni di esportazione e smistamento dei dati disponibili in PyOKR, i dati di tracciamento di più animali e condizioni possono essere elaborati automaticamente per consentire l'archiviazione organizzata dei dati e una rapida analisi statistica. Per condurre esperimenti che impiegano più condizioni durante la stessa sessione di registrazione, come la manipolazione del circuito o le risposte visive, si consiglia di raccogliere dati in file d'onda discreti o epoche sottoimpostate che consentono l'archiviazione di set di dati separati in base alle variabili indipendenti di interesse derivate da questa singola sessione di registrazione. Un esempio potrebbe essere se si stanno testando le differenze nelle risposte a diverse frequenze d'onda sinusoidali all'interno di un paradigma sperimentale, si consiglia di salvare parametri diversi in file d'onda diversi per un'analisi separata, come WT_1_Freq0.1Analysis, WT_1_Freq0.2Analysis e WT_1_Freq0.3Analysis. Nella versione attuale, una volta analizzate le epoche, non esiste alcuna funzionalità per la selezione dei singoli valori di epoca all'interno del set di dati, anche se questa potrebbe essere aggiunta in futuro, se necessario.

Infine, il nostro metodo è adattabile a diversi metodi di raccolta video-oculografica e fornisce una solida piattaforma di analisi che può essere facilmente adattata alle esigenze specifiche di un laboratorio. Attraverso l'analisi dei dati OKR wild-type e mutanti esistenti, e anche dei dati OKR wild-type raccolti utilizzando diversi metodi e stimoli, dimostriamo qui che il nostro strumento di analisi è in grado di a) quantificare il tracciamento OKR da qualsiasi stimolo direzionale con elevata precisione e produttività; b) identificare le differenze comportamentali del sistema visivo derivanti da perturbazioni genetiche; e c) valutazione dei dati di tracciamento visivo da diversi metodi di video-oculografia. L'accessibilità e l'adattabilità generale della nostra piattaforma di analisi facilitano ulteriori studi sulle risposte OKR e miglioreranno gli studi comportamentali che caratterizzano l'assemblaggio e la dinamica dei circuiti neurali nel contesto delle risposte oculomotorie.

Per ottenere misurazioni accurate e successive analisi dei dati utili, sono necessari diversi passaggi per la raccolta dei dati. Si consiglia di raccogliere i dati OKR in più sessioni per consentire all'animale di acclimatarsi all'apparato di test comportamentale e ridurre l'impatto dello stress animale sulle risposte comportamentali; tuttavia, una registrazione eccessiva può portare al potenziamento della risposta OKR¹³, quindi si raccomanda attenzione nella progettazione dei regimi di test. Durante la raccolta dei dati OKR, la corretta calibrazione dell'apparecchiatura di video-oculografia è fondamentale per una quantificazione accurata, poiché la qualità dei dati analizzati è una funzione diretta della traccia elaborata. È importante sottolineare che l'uso dell'IDE Spyder è necessario per la supervisione dei grafi tramite Matplotlib. Data l'accessibilità e la progettazione del framework della nostra piattaforma, tutti gli strumenti necessari sono disponibili per gli altri per espandere le capacità del software e adattare questa piattaforma a paradigmi sperimentali comportamentali distinti.

In conclusione, descriviamo qui uno strumento nuovo, accessibile e versatile per l'analisi delle risposte comportamentali OKR in modo più approfondito e con una potenza quantitativa maggiore di quella attualmente disponibile utilizzando le metodologie esistenti. PyOKR può essere facilmente utilizzato dagli utenti Python inesperti e contiene una pipeline di analisi e un'interfaccia consolidate per l'analisi rapida e accurata delle onde OKR con maggiore rigore e riproducibilità. L'adattabilità di questo software fornisce un framework flessibile che gli utenti possono facilmente personalizzare per soddisfare le loro esigenze specifiche e le procedure di raccolta dei dati. Prevediamo che questo metodo quantitativo farà avanzare lo studio delle risposte oculomotorie e migliorerà la nostra comprensione dello sviluppo e della funzione dei circuiti neurali che guidano i comportamenti del sistema visivo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
C57BL/6J  topi	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
Camera di registrazione reflex optocinetica - JHUSOM	Custom-built	N/A	Come descritto in Al-Khindi et al.(2022)9 e Kodama et al. (2016)13
Camera di registrazione reflex optocinetica - UCSF	Custom-built	N/A	Come descritto in Harris e Dunn, 201510
Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ mice	Dono di B. Bruneau	N/A	Come descritto in Al-Khindi et al.(2022)9
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd	MMRRC MMRRC	Stock # 036084-UCD; Codice RRID: MMRRC_036084-UCD