Questo studio descrive un protocollo combinato di risonanza magnetica (MRI) e ultrasuoni focalizzati pulsati a bassa intensità (FUS), utilizzando ratti vivi con cateterismo della vena giugulare per monitorare l'apertura della barriera emato-encefalica (BEE).
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Articolo metodologico
Monitoraggio dell'apertura della barriera emato-encefalica nei ratti con un sistema ecografico focalizzato preclinico
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cervello ha una barriera sanguigna semipermeabile altamente selettiva, chiamata barriera emato-encefalica (BBB), che impedisce la somministrazione di agenti macromolecolari terapeutici al cervello. L'integrazione degli ultrasuoni focalizzati pulsati a bassa intensità (FUS) guidati dalla risonanza magnetica con la pre-iniezione di microbolle è una tecnica promettente per la modulazione della BBB non invasiva e non tossica. La risonanza magnetica può offrire un contrasto superiore dei tessuti molli e varie valutazioni quantitative, come la permeabilità vascolare, la perfusione e la distribuzione spazio-temporale degli agenti di contrasto MRI. In particolare, le tecniche di risonanza magnetica con mezzo di contrasto a base di gadolinio hanno dimostrato di essere il gold standard per rilevare le aperture della BEE. Questo studio delinea una metodologia completa che coinvolge protocolli di risonanza magnetica e procedure animali per il monitoraggio dell'apertura della BBB in un modello di ratto. Il modello di ratto offre l'ulteriore vantaggio dell'utilizzo del catetere della vena giugulare, che facilita la somministrazione rapida dei farmaci. Un trasduttore FUS preclinico a guida stereotassica facilita il perfezionamento e la semplificazione delle procedure sugli animali e dei protocolli MRI. I metodi risultanti sono caratterizzati da riproducibilità e semplicità, eliminando la necessità di competenze chirurgiche specializzate. Questa ricerca si propone di contribuire all'ottimizzazione delle procedure precliniche con modelli di ratto e di incoraggiare ulteriori indagini sulla modulazione della BBB per migliorare gli interventi terapeutici nei disturbi neurologici.
Introduzione
La BBB regola il movimento di ioni, molecole e cellule tra i vasi sanguigni e i tessuti cerebrali1. Questa funzione consente il mantenimento della funzione neuronale e della salute, impedendo la somministrazione di agenti macromolecolari terapeutici ai tessuti cerebrali. La limitata permeabilità della BBB può comportare una diminuzione dell'efficacia e dell'efficacia dei trattamenti per i tumori cerebrali e le malattie neurodegenerative, come il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica e il morbo di Alzheimer2. Pertanto, sono stati studiati vari approcci, come la somministrazione potenziata dalla convezione, le iniezioni intracraniche dirette, l'interruzione osmotica e la progettazione di farmaci potenziati, per bypassare la BBB per la somministrazione controllata di agenti terapeutici3,4,5.
Tuttavia, questi approcci hanno limitazioni intrinseche come l'invasività, il rischio di infezione, il rischio di emorragia, l'eterogeneità e il rapido afflusso di farmaci. L'ecografia focalizzata pulsata a bassa intensità (FUS) con l'iniezione di microbolle è una tecnica promettente e non invasiva che consente l'interruzione localizzata e reversibile della BBB. Gli effetti meccanici degli ultrasuoni accoppiati con le microbolle possono alterare transitoriamente la permeabilità della BBB (cioè l'apertura della BBB)6,7. Per ulteriori progressi nelle applicazioni di trattamento che utilizzano l'apertura della BEE, sono essenziali esperimenti in vivo su piccoli animali.
In questo studio, abbiamo introdotto protocolli di risonanza magnetica e procedure animali per monitorare l'apertura della BBB in un modello di ratto. Il protocollo includeva un modello di ratto con un catetere della vena giugulare incannulato da un'organizzazione commerciale (vedi Tabella dei materiali). Un modello di ratto di cateterismo della vena giugulare presenta i potenziali benefici della somministrazione rapida di farmaci, dei test di monitoraggio emodinamico e del cateterismo stabile. L'apertura della BBB è stata realizzata utilizzando un sistema FUS preclinico. Progettato specificamente per l'apertura della BBB in modelli di piccoli animali come ratti e topi, questo sistema incorpora componenti essenziali, come un sistema da banco, un computer di controllo, un trasduttore, un degasatore dell'acqua e gli accessori di accompagnamento. L'uso di questo sistema FUS preclinico a guida stereotassica non solo migliora la precisione, ma semplifica anche le procedure animali e i protocolli di risonanza magnetica, contribuendo alla riproducibilità e alla semplicità del protocollo sperimentale complessivo.
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati approvati dall'Università della California, San Francisco (UCSF) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). In questo studio sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague-Dawley (200-250 g). I ratti sono stati alloggiati e curati secondo le linee guida del National Institutes of Health Office of Animal Care and Use su topi e ratti. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione degli animali
NOTA: Per le procedure interne, gli animali sono stati trasportati nella sala di preparazione e le procedure sono state condotte come segue:
- Mettere i ratti singolarmente in una camera di lucite ed esporre l'isoflurano (2%-3%) mescolato con l'ossigeno estratto da una bombola di ossigeno medica fino a quando non sono incoscienti (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente).
NOTA: L'anestesia con isoflurano consente l'implementazione di un protocollo di risonanza magnetica a lungo termine. - Rimuovi i ratti dalla camera e rade i peli dalle zone anteriori e posteriori del collo usando una crema depilatoria.
- Applicare un unguento lubrificante sugli occhi.
- Posizionare il naso nel cono nasale per mantenere l'anestesia con la respirazione spontanea (vaporizzatore di isoflurano tra il 2% e il 2,5%, flussometro di ossigeno fino a 1-1,5 L/min).
- Posizionare il ratto anestetizzato su un tavolo chirurgico riscaldato e confermare con un pizzico di dito del piede.
NOTA: Il protocollo MRI includeva sequenze con contrasto potenziato, come l'imaging con eco gradiente pesato in T1 e l'imaging con eco di spin pesato in T2. Queste sequenze sono state condotte sia prima che dopo l'iniezione di agenti di contrasto a base di gadolinio (GAD) per valutare la permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB). Ciò comporta la somministrazione di agenti di contrasto GAD mentre il ratto si trova in uno scanner MRI7. Per facilitare questo processo, è stato utilizzato un tubo del catetere che si estende dal catetere cannulato nel ratto. L'estensione comprendeva un connettore per catetere e un tubo in polietilene di 30 cm. Per garantire la pervietà e prevenire perdite, il tubo di prolunga è stato lavato con glicerolo eparinizzato (250 UI di eparina/1 ml di glicerolo).
2. Ecografo focalizzato a guida stereotassica
NOTA: Gli animali sono stati trasferiti e posizionati su un tavolo in un sistema FUS stereotassico. Il naso del ratto è stato inserito nel cono del naso per mantenere l'anestesia. Il sistema FUS comprende un generatore di funzioni, un amplificatore RF e un oscilloscopio. Prima di configurare il trasduttore, ci siamo assicurati del corretto collegamento di tutti i dispositivi con il sistema. La configurazione del trasduttore è stata completata utilizzando i seguenti passaggi:
- Posiziona un puntatore appuntito sulla posizione del Bregma nel cranio e salva la posizione. La posizione di Bregma può essere identificata puntando la posizione di 9,0 mm anteriormente a Lambda sulla linea mediana8. La Lambda si trova al centro della linea tra i timpani bilaterali9.
- Posizionare il gel per ultrasuoni sulla testa del ratto, sulla sacca di accoppiamento dell'acqua e sul trasduttore (frequenza 1 MHz). Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria tra la pelle del ratto, la sacca di accoppiamento dell'acqua e il trasduttore.
- Collegare un cavo BNC coassiale del trasduttore all'ingresso del modulo del sistema FUS.
- In un computer di controllo) Fare clic su carica per immagini di ratti pre-registrate; Vengono scelti un numero di punti focali e la pressione acustica.
- In un computer di controllo) Fare clic sul test di movimento nel modulo di trattamento per assicurarsi che il trasduttore possa spostarsi da un punto all'altro entro un periodo di burst.
- Impostare i parametri di sonicazione descritti al punto 3.
3. Infusione e sonicazione di microbolle
- Attiva il microbubble.
NOTA: La microbolla utilizzata in questo studio è stata caratterizzata da un diametro di 1,7 μm e una concentrazione di 0,2 × 109 particelle per millilitro10. La fiala di microbolle è stata attivata sulla base delle istruzioni di prescrizione fornite dal fornitore e di un rapporto precedentemente pubblicato11.- Preparare una siringa da 5 ml con punta luer lock e riempita con 5 ml di cloruro di sodio allo 0,9% senza additivi.
- Rimuovere il tappo verde e collegare la siringa al perno di erogazione ventilato (vedere la Tabella dei materiali) avvitandolo in senso orario.
- Rimuovere la protezione del perno e posizionarla al centro del tappo di gomma della fiala. Premere con decisione fino a quando la punta non è completamente inserita nel tappo.
- Svuotare l'intera siringa da 5 ml nel flaconcino spingendo l'asta dello stantuffo.
- Agitare energicamente la fiala per 20 s per mescolare tutto il contenuto. Un liquido bianco e lattiginoso consistente mostrerà che si sono formate microsfere lipidiche di esafluoruro di zolfo.
- Per ottenere la dose richiesta, capovolgere la siringa e prelevare lentamente il volume previsto della sospensione in una siringa da 5 mL.
- Utilizzare una pompa per infusione.
NOTA: L'approccio all'infusione12 è stato utilizzato per erogare microbolle ai ratti utilizzando una pompa a siringa. Una siringa contenente microbolle è stata collegata a un connettore per catetere inserito nel ratto. Le microbolle sono state trasferite attraverso tubi in polietilene e la portata della pompa di infusione è stata impostata su 0,66 mL/min. Questa velocità di infusione consente l'iniezione di 2 mL di microbolle da una siringa da 3 mL nell'arco di 3 minuti. L'infusione è iniziata prima della sonicazione per 1 minuto ed è continuata per tutto il periodo di sonicazione di 2 minuti. - Eseguire la sonicazione.
NOTA: In questo studio, gli impulsi FUS sono stati scelti con i seguenti parametri: (1) Regione target: ippocampo sinistro; (2) Numero di macchie: 6 per coprire l'ippocampo nel cervello; (3) Lunghezza burst: 10 ms; (4) Periodo di burst: 1200 ms; (5) Pressione acustica: 0,65 MPa; (6) 'Modalità burst' nel menu della modalità sonica nel sistema FUS; (7) Tempo di sonicazione: 120 s.
4. Procedura di risonanza magnetica con scanner preclinico 3T
- Dopo la sonicazione, trasferire gli animali su un tavolo in uno scanner preclinico 3T privo di criogeni.
- Posizionare i ratti in posizione prona. Mantenere la temperatura del termoforo nello scanner e monitorare la frequenza respiratoria utilizzando un sensore pneumatico a cuscino. Eseguire il protocollo MRI per testare vari tipi di imaging RM (Tabella 1).
- Includere altre tecniche di imaging quantitativo, come l'imaging pesato in diffusione (DWI), la mappatura T2*, la mappatura T1 e la risonanza magnetica con mezzo di contrasto dinamico (DCE), oltre alla risonanza magnetica con mezzo di contrasto, per dimostrare la sua potenziale praticità per diversi studi di imaging. Fare riferimento alla Tabella 1 per i protocolli di risonanza magnetica utilizzati in questo studio.
- Iniettare agenti di contrasto MRI basati su GAD (Gadavist, 1 mmol/kg) dopo la sequenza di eco del gradiente RM pesato in T1 e acquisire immagini post-GAD.
NOTA: Per un ratto di 200 g, abbiamo iniettato 200 μl di mezzo di contrasto per risonanza magnetica e li abbiamo seguiti con una soluzione salina da 200 μl per lavare il tubo.
5. Esame macroscopico del cervello di ratto
NOTA: Dopo la risonanza magnetica, sono stati iniettati 2 ml di soluzione blu di Evans (diluita al 2% con soluzione salina tamponata con fosfato) e il ratto è stato lasciato riposare per almeno 30 minuti per consentire alla soluzione di diffondersi e circolare in tutto il corpo. Successivamente, i ratti sono stati soppressi utilizzando un sovradosaggio di isoflurano (5%) per l'esame macroscopico del cervello (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Per confermare l'eutanasia, è stato necessario dare un pugno alle dita dei piedi e l'animale è stato osservato per la cessazione della respirazione per almeno 1 minuto. È stata eseguita la procedura di perfusione, seguita da un esame del cervello di ratto. La procedura di perfusione è riassunta come segue:
- Eseguire una toracotomia utilizzando una forbice chirurgica per esporre gli organi nel torace e visualizzare la regione cardiaca.
- Incidere (~5 mm) l'atrio destro.
- Introdurre una soluzione salina nel ventricolo sinistro per scopi di perfusione.
- Apri l'osso del cranio con una forbice chirurgica per svelare e presentare il cervello.
NOTA: Un'adeguata perfusione dovrebbe portare a un aspetto uniformemente luminoso del cervello, mentre le aree blu persistenti indicano una perdita di albumina associata alla BBB, come rilevato dal blu di Evans.
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Risultati
Questo studio presenta un protocollo preclinico per il monitoraggio dell'apertura della barriera ematoencefalica in un modello ratto mediante l'utilizzo di un sistema FUS commerciale per animali. Il sistema FUS è stato posizionato su un banco o su un carrello di grandi dimensioni (Figura 1). I ratti sono stati anestetizzati con isoflurano mescolato con ossigeno attraverso un cono nasale montato sul telaio dotato di supporto per il trasduttore. Un idrofono risonante a 500 kHz, utilizzato per ...
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Discussione
Sono stati sviluppati un protocollo e una procedura animale che utilizzano un modello di ratto di cateterismo della vena giugulare per studi di apertura della BEE. Sebbene esistano numerosi protocolli preclinici, questo protocollo incorpora un sistema FUS disponibile in commercio e un modello di ratto, riducendo al minimo le procedure di preparazione degli animali e garantendo così la riproducibilità sperimentale.
In questo protocollo, la selezione delle microbolle si basava sulla sua stabilit...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse rilevanti da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato parzialmente supportato dal National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) Grant K99DE032397, dal Seed Grant del Dipartimento UCSF (n. 7504831), dal RAP grant dell'UCSF (PI: Kazim Narsinh, MD) e dalla German Research Foundation (DFG, GA 3535/1-1).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa da 1 mL | BD plastipak | ||
| 20 mL, cloruro di sodio 0,9% | Hospira, Inc | 00409-7101-67 | |
| siringa da 3 mL siringa | BD plastipak | ||
| 5 mL BD | plastipak | ||
| Ago smussato, 21 G | SAI tecnologie di infusione | B21-50 | |
| Connettore catetere, 21 G | SAI per infusione tecnologie | CC-25-25 | |
| Soluzione di blocco del catetere | SAI Tecnologie di infusione | Sku # HGS-10 | (500 µ/mL) Glicerolo |
| Evans Blue | Sigma aldrich | E2129-10g | |
| ExAblate Neuro | Insightec Inc., Israele | ||
| Gadavist | Bayer 2068062 | ||
| GE Vaporizzatore di isoflurano | GE Healthcare | ||
| IPS-12RS Pompa a siringa | Inovenso | IPS-12 | |
| isoflurano USP | Vet one | 501017 | |
| Lumason microbbuble | Bracco Diagnostics Inc | SKJ709700 | |
| ratti maschi Sprague-Dawley (200... 250 g) | Ago Charles River Laboratories | ||
| , 18 G | BD Precisionglide | ||
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Mediatech | 21-030-CVR | |
| Tubo in polietilene | BD Intramedic | ||
| scanner Bruker Biospin preclinico 3T criogeno gratuito. | Bruker | Biospec3T | |
| Rat con cateterismo della vena giugulare | Charles River Laboratories | ||
| Trasduttore a ultrasuoni focalizzato RK-50 | FUS Instruments | Tx-50-1000-0 | |
| RK-50 sistema a ultrasuoni focalizzato da banco | FUS Instruments | ||
| Sonic Concepts | Sonic Concepts Inc., WA, USA | ||
| Spillo di erogazione ventilato | B Braun | 4550560 |
Riferimenti
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