Isolamento e crioconservazione di cellule mononucleate del sangue periferico umano altamente vitali da sangue intero: una guida per principianti

Questo protocollo dimostra un metodo e un flusso di lavoro accessibili per l'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue intero. Questo protocollo è rivolto in particolare ai tecnici di ricerca alle prime armi, agli studenti e al personale di laboratorio clinico con l'obiettivo di facilitare la raccolta e la crioconservazione delle PBMC senza presupporre una formazione preliminare nelle tecniche di laboratorio.

Questo protocollo utilizza la centrifugazione per separare i componenti del sangue intero in base alla densità. Il sangue intero è costituito da quattro componenti principali elencati in ordine decrescente di densità: globuli rossi/eritrociti (~45% del volume), globuli bianchi (<1% del volume), piastrine (<1% del volume) e plasma (~55% del volume)1,2,3,4,5,6. I globuli bianchi possono essere suddivisi in due categorie in base alle caratteristiche dei loro nuclei: rotondi o plurinucleati⁶. Le PBMC sono definite come globuli bianchi con nuclei rotondi e sono costituite dai seguenti tipi di cellule: linfociti (cellule T, cellule B, cellule NK), cellule dendritiche e monociti⁶. I globuli bianchi multinucleati includono i granulociti, che consistono nei seguenti tipi di cellule: neutrofili, basofili ed eosinofili⁶. I globuli bianchi multinucleati sono più densi dei PBMC⁶. Le densità di ciascun componente del sangue intero sono dettagliate nella Tabella 1.

In questo protocollo, il sangue intero viene raccolto in provette per centrifugazione a gradiente di densità. Queste provette contengono un terreno di gradiente di densità preconfezionato con una densità di 1,077 g/mL. Dopo la centrifugazione, le cellule più dense, compresi i globuli bianchi multinucleati e gli eritrociti, vengono separate dalle PBMC e dalle piastrine mediante il mezzo del gradiente di densità (Figura 1A)^6,7. La PBMC e la frazione piastrinica vengono quindi raccolte, lavate e centrifugate per rimuovere le piastrine. Le PBMC purificate risultanti vengono raccolte e conservate a -80 °C o in azoto liquido. Le PBMC crioconservate possono essere scongelate in modo vitale e utilizzate direttamente nelle analisi a valle o ulteriormente elaborate per isolare specifici tipi di cellule componenti.

Questo protocollo è stato ottimizzato per il sequenziamento di RNA di alta qualità da PBMC altamente vitali. In questo articolo, le PBMC sono state isolate e crioconservate da pazienti in una clinica ambulatoriale. Successivamente, i monociti sono stati isolati dalle PBMC mediante FACS e analizzati tramite sequenziamento dell'RNA. Tuttavia, il protocollo può essere ampiamente adattato ad altre esigenze sperimentali come la coltura cellulare, l'editing genetico, gli studi funzionali ex-vivo, le analisi di singole cellule, la fenotipizzazione mediante citometria a flusso o citometria a tempo di volo, l'isolamento di DNA/RNA o proteine, vetrini per immunoistochimica, tra gli altri 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Oltre alla raccolta di PBMC da provette per centrifugazione a gradiente di densità, questo protocollo esamina come raccogliere il plasma e il buffy coat tramite centrifugazione utilizzando una provetta EDTA. Dopo la centrifugazione, il sangue intero viene separato in plasma, eritrociti e un sottile strato di interfaccia chiamato buffy coat contenente leucociti (Figura 1B)⁶. Il buffy coat è comunemente usato per l'estrazione del DNA e le successive analisi genomiche^19,20. Lo strato plasmatico contiene i componenti privi di cellule del sangue intero e può essere utilizzato per saggi di biomarcatori^21,22.

Il protocollo di studio è stato approvato dall'UCSD e dal KUMC Human Protections Program ed è conforme alla Dichiarazione di Helsinki. Tutti gli individui hanno fornito il consenso informato per la partecipazione e la raccolta del sangue.

1. Elaborazione e crioconservazione delle PBMC

1. Un giorno prima del prelievo di sangue, stampare la lista di controllo dei materiali e dei reagenti elencati nella Tabella 2 e preparare ed etichettare di conseguenza.
   NOTA: Questo protocollo è stato progettato per la raccolta di 6 provette per centrifugazione a gradiente di densità. Ogni provetta produce circa 12 milioni di PBMC, di cui circa il 50% e il 20% saranno rispettivamente linfociti e monociti vivi. Scala di conseguenza per le esigenze sperimentali. Si noti che il numero assoluto di cellule può differire in modo significativo tra i pazienti o le condizioni di trattamento.
2. Utilizzando la tecnica standard di flebotomia, raccogliere il sangue intero in 6 provette da centrifugazione a gradiente di densità e 1 provetta EDTA fino al riempimento, circa 6 ml di volume.
   NOTA: Se sono necessari campioni da più pazienti o condizioni di trattamento, le provette raccolte possono essere conservate fino a 4 ore e quindi elaborate contemporaneamente.
3. Dopo la raccolta, centrifugare tutte le provette a 1.800 x g per 20 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Fare riferimento al Video supplementare 1 per una dimostrazione di come utilizzare una centrifuga.
4. Dopo la centrifugazione, aprire con cautela la provetta per centrifugazione a gradiente di densità. Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere ed eliminare lo strato giallo traslucido contenente plasma. Non disturbare lo strato nebuloso di celle direttamente sopra il mezzo del gradiente di densità. Pecca per eccesso di cautela, lasciando il plasma in eccesso piuttosto che scartare le PBMC. Ripetere per tutte le provette.
   NOTA: Dopo la centrifugazione della provetta contenente il mezzo a gradiente di densità, il plasma e le PBMC saranno al di sopra del mezzo a gradiente di densità; Gli eritrociti e i granulociti si depositeranno sul fondo. Fare riferimento alla Figura 1A per una visualizzazione.
5. Con una nuova pipetta di trasferimento, pipettare delicatamente su e giù il volume rimanente contenente le cellule e il plasma residuo in ciascuna provetta più volte al di sopra del mezzo di gradiente di densità.
6. Dopo la risospensione, pipettare il contenuto risospeso della provetta in una provetta conica da 50 mL etichettata. Ripetere per tutte le provette.
7. Versare la soluzione 1 (RPMI Medium) nella provetta da 50 mL fino a raggiungere la linea da 50 mL.
8. Ripetere i passaggi da 1.4 a 1.7 per ogni paziente o condizione di trattamento, se necessario.
   NOTA: Assicurarsi che campioni diversi non siano mescolati e utilizzare una nuova pipetta di trasferimento per evitare contaminazioni.
9. Centrifugare la provetta da 50 mL a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Il protocollo di raccolta del plasma e del buffy descritto nella Sezione 2 può essere completato durante questo periodo.
10. Scartare quanto più surnatante possibile. Toccare secondo necessità per rimuovere le gocce residue.
    NOTA: Dopo la centrifugazione, il pellet contiene PBMC e il surnatante contiene piastrine e plasma residuo.
11. Versare una provetta da 15 mL di Soluzione 2 (terreno RPMI + 12,5% albumina sierica umana + 1 μM di flavopiridol) nella provetta conica da 50 mL contenente il pellet di PBMC. Capovolgere delicatamente il tubo per risospendere il pellet della cella.
12. Aspirare 15 mL di soluzione 3 (terreno RPMI + 11,25% albumina sierica umana + 1 μM di flavopiridolo + 10% DMSO) utilizzando una pipetta di trasferimento. Aggiungere goccia a goccia alla provetta da 50 mL.
    NOTA: La soluzione 3 contiene DMSO, che è tossico per le cellule a temperatura ambiente. Non aggiungere la soluzione 3 fino a quando non è pronta per essere immediatamente elaborata.
13. Capovolgere delicatamente il tubo 3 volte per mescolare.
14. Riempire ogni crioviale pre-marcato e pre-raffreddato con 1 mL di PBMC utilizzando una pipetta a dispensazione multipla.
    NOTA: Fare riferimento al Video supplementare 2 per una dimostrazione di come utilizzare una pipetta a dispensazione multipla.
15. Metti i crioviali all'interno di un contenitore di congelamento pre-raffreddato. Quindi, spostare il contenitore in un congelatore a -80 °C.
16. Ripetere i passaggi da 1.9 a 1.13 per ogni paziente o condizione di trattamento, se necessario.
17. Conservare i crioviali all'interno del contenitore di congelamento per un minimo di 12 ore, quindi trasferirli in una scatola di conservazione etichettata a -80 °C.
    NOTA: In alternativa, trasferire i crioviali congelati in azoto liquido (<-135 °C) per la conservazione a lungo termine.

2. Lavorazione di plasma e buffy coat da provette EDTA

1. Centrifugare a 1.800 x g per 10 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Dopo la centrifugazione, lo strato superiore è costituito da plasma, il fondo contiene eritrociti e l'interfaccia sarà il buffy coat. Vedere la Figura 1B per una visualizzazione.
2. Utilizzando una nuova pipetta di trasferimento, aspirare quanto più plasma possibile senza disturbare lo strato di buffy coat. Quindi, erogare 0,5 mL di aliquote in crioviali premarcati. Aspirare lo strato di buffy coat e trasferirlo nel crioviale opportunamente etichettato.
   NOTA: Alcuni plasma ed eritrociti possono contaminare la collezione di buffy coat.
3. Ripetere il passaggio 2.2 per ogni paziente o condizione di trattamento, se necessario.
4. Dopo la raccolta, conservare i crioviali in un congelatore a -80 °C.
   NOTA: In alternativa, conservare in azoto liquido (<-135 °C) per la conservazione a lungo termine.

3. Scongelamento delle PBMC

1. Un giorno prima dello scongelamento, stampare una lista di controllo dei materiali e dei reagenti elencati nella Tabella 3 e preparare ed etichettare di conseguenza.
   NOTA: Questo protocollo è stato progettato per lo scongelamento di 1 provetta da 1,5 mL contenente 1 mL di PBMC. Ogni provetta produce circa 2 milioni di PBMC, di cui circa il 50% e il 20% saranno rispettivamente linfociti e monociti vivi. Scala di conseguenza per le esigenze sperimentali. Si noti che il numero assoluto di cellule può differire in modo significativo tra i pazienti o le condizioni di trattamento.
2. Trasferire le PBMC congelate dal deposito con ghiaccio secco e scongelarle in un'incubatrice a 37 °C per 4 minuti, o appena prima dello scongelamento dell'ultimo cristallo di ghiaccio.
   NOTA: Se lo si desidera, è possibile prelevare un'aliquota per il conteggio delle cellule e le misure di vitalità, come descritto nella Sezione 4.
3. Dopo lo scongelamento, aggiungere 1 mL di Soluzione 4 (PBS + 2 mM EDTA) a ciascun crioviale. Quindi, versare il contenuto in una provetta da 50 ml pre-marcata contenente 10 ml di soluzione 4 per ogni provetta PBMC scongelata. Tocca per rimuovere le gocce residue.
4. Posizionare il filtro cellulare sulla provetta vuota da 50 mL, quindi versare la sospensione cellulare attraverso il filtro cellulare.
   NOTA: Se necessario, picchiettare leggermente per interrompere la tensione superficiale.
5. Centrifugare ogni provetta contenente le celle filtrate a 400 x g per 7 minuti a temperatura ambiente.
6. Dopo la centrifugazione, versare il surnatante contenente DMSO. Toccare secondo necessità per rimuovere le gocce residue.
7. Risospendere il pellet cellulare nel terreno desiderato appropriato per le esigenze sperimentali a valle (ad es. terreni di coltura cellulare, cocktail di anticorpi per citometria a flusso, ecc.).

4. Conteggio e vitalità delle cellule

1. Immediatamente dopo lo scongelamento delle PBMC congelate nella fase 3.2, pipettare 20 μL di cellule in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere un volume uguale di soluzione di Trypan Blue allo 0,4% e pipettare delicatamente su e giù 3-4 volte per mescolare.
2. Utilizzando un contatore di cellule automatizzato, seguire il protocollo del produttore per contare le cellule e valutarne la vitalità. Assicurarsi che il fattore di diluizione di 2 sia preso in considerazione.
   NOTA: Come descritto altrove, un emocitometro può essere utilizzato come metodo alternativo per valutare la conta e la vitalità cellulare²³.

Dopo la raccolta e la crioconservazione delle PBMC, la vitalità di PBMC, monociti e linfociti scongelati da 56 campioni unici è stata valutata mediante citometria a flusso utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 4 seguendo le istruzioni del produttore (Figura 2A-F). È stata raggiunta una vitalità media ± SD di PBMC, monociti e linfociti rispettivamente del 94 ± del 4,0%, del 98 ± dell'1,1% e del 93 ± del 5,6% (Figura 2G). La misurazione della vitalità mediante esclusione del blu di tripano ha prodotto una vitalità media di 88 ± 7,5% e una conta cellulare di 2,3 x 106 ± 1,9 x 106. L'analisi della citometria a flusso ha anche dimostrato che i monociti vivi costituivano il 17-± il 5,9% e i linfociti costituivano il 53-± il 13,0% del totale delle PBMC.

Successivamente, i monociti sono stati selezionati da PBMC scongelati da 59 campioni unici mediante citometria a flusso e inviati per la preparazione della libreria e il sequenziamento dell'RNA come descritto altrove24. Un numero medio di sequenze SD ± totali di 18,0 ± 16,3 milioni è stato raggiunto con un allineamento di lettura di 93 ± 6,3% e un contenuto di GC di 49,6 ± 1,4% (Figura 3A-B). È stata trovata una percentuale media di letture mappate in modo univoco ± SD dell'88 ± del 3,6% con un sottoinsieme di 56 campioni unici. Questi parametri dimostrano che le PBMC altamente valide adatte alle applicazioni a valle, compreso il sequenziamento dell'RNA di alta qualità, possono essere ottenute da operatori con qualsiasi livello di formazione di laboratorio utilizzando questo protocollo.

Tabella 1: Componenti del sangue intero elencati in ordine decrescente di densità.

Tabella 2: Lista di controllo dei reagenti e dei materiali da preparare ed etichettare per la raccolta e la crioconservazione delle PBMC.

Tabella 3: Lista di controllo dei reagenti e dei materiali da preparare ed etichettare per lo scongelamento e il conteggio dei PBMC.

Tabella 4: Tabella dei reagenti per l'isolamento dei monociti dalle PBMC mediante citometria a flusso.

Figura 1: Componenti del sangue intero separati mediante centrifugazione in centrifugazione a gradiente di densità o provette con EDTA. (A) La centrifugazione del sangue intero in provette per centrifugazione a gradiente di densità determina la separazione di plasma, piastrine e PBMC al di sopra del mezzo di gradiente di densità con multinucleati ed eritrociti al di sotto del mezzo di gradiente di densità. (B) La centrifugazione del sangue intero in provette EDTA determina la separazione del plasma nello strato più superficiale, degli eritrociti nello strato inferiore e del buffy coat nell'interfaccia. Creato con Biorender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: La vitalità delle PBMC crioconservate scongelate è stata valutata mediante colorazione a flusso vivo/morto e citometria a flusso. (A) I detriti, contrassegnati da un asterisco *, sono esclusi dalle PBMC mediante un gating a dispersione anteriore e laterale. (B) Analisi rappresentativa vivo/morto di PBMC interi (C) I pan-monociti sono classificati come HLA-DR positivi e negativi per i seguenti antigeni di superficie marcati con FITC: CD3, CD19, CD56 e CD66b. (D) Analisi rappresentativa viva/morta dei monociti. (E) Linfociti controllati dai seguenti antigeni di superficie marcati con FITC: CD3, CD19, CD56 e CD 66b. (F) Analisi rappresentativa dei linfociti vivi/morti. (G) Percentuale di vitalità di ciascun tipo di cellula quantificata da 56 campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Qualità del sequenziamento dell'RNA dei monociti selezionati da PBMC crioconservate. Sono stati sequenziati 56 campioni unici e sono state generate ± medie SD 18,0 ± 16,3 milioni di sequenze totali. (A) L'allineamento era elevato, con il 92,5% ± il 6,3% delle sequenze allineate con il genoma di riferimento. (B) Il contenuto di GC di queste sequenze era del 49,6 ± dell'1,4%. Creato con FastQC25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video supplementare 1: Dimostrazione di come utilizzare la centrifuga Fare clic qui per scaricare questo file.

Video supplementare 2: Dimostrazione di come utilizzare una pipetta multi-dispenser. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno interessi finanziari o non finanziari rilevanti da rivelare.