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Articolo metodologico

Isolamento e crioconservazione di cellule mononucleate del sangue periferico umano altamente vitali da sangue intero: una guida per principianti

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DOI:

10.3791/66794

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25 ottobre 2024

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1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta una guida accessibile per la raccolta, la conservazione e lo scongelamento di cellule mononucleate del sangue periferico adatte per analisi e flussi di lavoro a valle come la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA. Vengono dimostrate anche le collezioni di plasma e buffy coat.

Abstract

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono comunemente utilizzate nella ricerca biomedica sul sistema immunitario e la sua risposta a malattie e agenti patogeni. Questo protocollo dettagliato descrive le apparecchiature, le forniture e i passaggi per l'isolamento, la crioconservazione e lo scongelamento di PBMC di alta qualità e altamente vitali da cellule di sangue intero, adatte per applicazioni a valle come la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA. Vengono inoltre descritti i protocolli per l'elaborazione del plasma e del buffy coat dal sangue intero in parallelo e in concomitanza con le PBMC. Questo protocollo passo-passo facile da seguire, che utilizza la centrifugazione in gradiente di densità per isolare le PBMC, è accompagnato da una lista di controllo di forniture, attrezzature e fasi di preparazione. Questo protocollo è adatto a persone con qualsiasi esperienza precedente con le tecniche di laboratorio e può essere implementato in laboratori clinici o di ricerca. La vitalità cellulare e il sequenziamento dell'RNA di alta qualità sono il risultato di PBMC raccolti da operatori senza precedenti esperienze di laboratorio nell'utilizzo di questo protocollo.

Introduzione

Questo protocollo dimostra un metodo e un flusso di lavoro accessibili per l'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue intero. Questo protocollo è rivolto in particolare ai tecnici di ricerca alle prime armi, agli studenti e al personale di laboratorio clinico con l'obiettivo di facilitare la raccolta e la crioconservazione delle PBMC senza presupporre una formazione preliminare nelle tecniche di laboratorio.

Questo protocollo utilizza la centrifugazione per separare i componenti del sangue intero in base alla densità. Il sangue intero è costituito da quattro componenti principali elencati in ordine decrescente di densità: globuli rossi/eritrociti (~45% del volume), globuli bianchi (<1% del volume), piastrine (<1% del volume) e plasma (~55% del volume)1,2,3,4,5,6. I globuli bianchi possono essere suddivisi in due categorie in base alle caratteristiche dei loro nuclei: rotondi o plurinucleati6. Le PBMC sono definite come globuli bianchi con nuclei rotondi e sono costituite dai seguenti tipi di cellule: linfociti (cellule T, cellule B, cellule NK), cellule dendritiche e monociti6. I globuli bianchi multinucleati includono i granulociti, che consistono nei seguenti tipi di cellule: neutrofili, basofili ed eosinofili6. I globuli bianchi multinucleati sono più densi dei PBMC6. Le densità di ciascun componente del sangue intero sono dettagliate nella Tabella 1.

In questo protocollo, il sangue intero viene raccolto in provette per centrifugazione a gradiente di densità. Queste provette contengono un terreno di gradiente di densità preconfezionato con una densità di 1,077 g/mL. Dopo la centrifugazione, le cellule più dense, compresi i globuli bianchi multinucleati e gli eritrociti, vengono separate dalle PBMC e dalle piastrine mediante il mezzo del gradiente di densità (Figura 1A)6,7. La PBMC e la frazione piastrinica vengono quindi raccolte, lavate e centrifugate per rimuovere le piastrine. Le PBMC purificate risultanti vengono raccolte e conservate a -80 °C o in azoto liquido. Le PBMC crioconservate possono essere scongelate in modo vitale e utilizzate direttamente nelle analisi a valle o ulteriormente elaborate per isolare specifici tipi di cellule componenti.

Questo protocollo è stato ottimizzato per il sequenziamento di RNA di alta qualità da PBMC altamente vitali. In questo articolo, le PBMC sono state isolate e crioconservate da pazienti in una clinica ambulatoriale. Successivamente, i monociti sono stati isolati dalle PBMC mediante FACS e analizzati tramite sequenziamento dell'RNA. Tuttavia, il protocollo può essere ampiamente adattato ad altre esigenze sperimentali come la coltura cellulare, l'editing genetico, gli studi funzionali ex-vivo, le analisi di singole cellule, la fenotipizzazione mediante citometria a flusso o citometria a tempo di volo, l'isolamento di DNA/RNA o proteine, vetrini per immunoistochimica, tra gli altri 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Oltre alla raccolta di PBMC da provette per centrifugazione a gradiente di densità, questo protocollo esamina come raccogliere il plasma e il buffy coat tramite centrifugazione utilizzando una provetta EDTA. Dopo la centrifugazione, il sangue intero viene separato in plasma, eritrociti e un sottile strato di interfaccia chiamato buffy coat contenente leucociti (Figura 1B)6. Il buffy coat è comunemente usato per l'estrazione del DNA e le successive analisi genomiche19,20. Lo strato plasmatico contiene i componenti privi di cellule del sangue intero e può essere utilizzato per saggi di biomarcatori21,22.

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Protocollo

Il protocollo di studio è stato approvato dall'UCSD e dal KUMC Human Protections Program ed è conforme alla Dichiarazione di Helsinki. Tutti gli individui hanno fornito il consenso informato per la partecipazione e la raccolta del sangue.

1. Elaborazione e crioconservazione delle PBMC

  1. Un giorno prima del prelievo di sangue, stampare la lista di controllo dei materiali e dei reagenti elencati nella Tabella 2 e preparare ed etichettare di conseguenza.
    NOTA: Questo protocollo è stato progettato per la raccolta di 6 provette per centrifugazione a gradiente di densità. Ogni provetta produce circa 12 milioni di PBMC, di cui circa il 50% e il 20% saranno rispettivamente linfociti e monociti vivi. Scala di conseguenza per le esigenze sperimentali. Si noti che il numero assoluto di cellule può differire in modo significativo tra i pazienti o le condizioni di trattamento.
  2. Utilizzando la tecnica standard di flebotomia, raccogliere il sangue intero in 6 provette da centrifugazione a gradiente di densità e 1 provetta EDTA fino al riempimento, circa 6 ml di volume.
    NOTA: Se sono necessari campioni da più pazienti o condizioni di trattamento, le provette raccolte possono essere conservate fino a 4 ore e quindi elaborate contemporaneamente.
  3. Dopo la raccolta, centrifugare tutte le provette a 1.800 x g per 20 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Fare riferimento al Video supplementare 1 per una dimostrazione di come utilizzare una centrifuga.
  4. Dopo la centrifugazione, aprire con cautela la provetta per centrifugazione a gradiente di densità. Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere ed eliminare lo strato giallo traslucido contenente plasma. Non disturbare lo strato nebuloso di celle direttamente sopra il mezzo del gradiente di densità. Pecca per eccesso di cautela, lasciando il plasma in eccesso piuttosto che scartare le PBMC. Ripetere per tutte le provette.
    NOTA: Dopo la centrifugazione della provetta contenente il mezzo a gradiente di densità, il plasma e le PBMC saranno al di sopra del mezzo a gradiente di densità; Gli eritrociti e i granulociti si depositeranno sul fondo. Fare riferimento alla Figura 1A per una visualizzazione.
  5. Con una nuova pipetta di trasferimento, pipettare delicatamente su e giù il volume rimanente contenente le cellule e il plasma residuo in ciascuna provetta più volte al di sopra del mezzo di gradiente di densità.
  6. Dopo la risospensione, pipettare il contenuto risospeso della provetta in una provetta conica da 50 mL etichettata. Ripetere per tutte le provette.
  7. Versare la soluzione 1 (RPMI Medium) nella provetta da 50 mL fino a raggiungere la linea da 50 mL.
  8. Ripetere i passaggi da 1.4 a 1.7 per ogni paziente o condizione di trattamento, se necessario.
    NOTA: Assicurarsi che campioni diversi non siano mescolati e utilizzare una nuova pipetta di trasferimento per evitare contaminazioni.
  9. Centrifugare la provetta da 50 mL a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Il protocollo di raccolta del plasma e del buffy descritto nella Sezione 2 può essere completato durante questo periodo.
  10. Scartare quanto più surnatante possibile. Toccare secondo necessità per rimuovere le gocce residue.
    NOTA: Dopo la centrifugazione, il pellet contiene PBMC e il surnatante contiene piastrine e plasma residuo.
  11. Versare una provetta da 15 mL di Soluzione 2 (terreno RPMI + 12,5% albumina sierica umana + 1 μM di flavopiridol) nella provetta conica da 50 mL contenente il pellet di PBMC. Capovolgere delicatamente il tubo per risospendere il pellet della cella.
  12. Aspirare 15 mL di soluzione 3 (terreno RPMI + 11,25% albumina sierica umana + 1 μM di flavopiridolo + 10% DMSO) utilizzando una pipetta di trasferimento. Aggiungere goccia a goccia alla provetta da 50 mL.
    NOTA: La soluzione 3 contiene DMSO, che è tossico per le cellule a temperatura ambiente. Non aggiungere la soluzione 3 fino a quando non è pronta per essere immediatamente elaborata.
  13. Capovolgere delicatamente il tubo 3 volte per mescolare.
  14. Riempire ogni crioviale pre-marcato e pre-raffreddato con 1 mL di PBMC utilizzando una pipetta a dispensazione multipla.
    NOTA: Fare riferimento al Video supplementare 2 per una dimostrazione di come utilizzare una pipetta a dispensazione multipla.
  15. Metti i crioviali all'interno di un contenitore di congelamento pre-raffreddato. Quindi, spostare il contenitore in un congelatore a -80 °C.
  16. Ripetere i passaggi da 1.9 a 1.13 per ogni paziente o condizione di trattamento, se necessario.
  17. Conservare i crioviali all'interno del contenitore di congelamento per un minimo di 12 ore, quindi trasferirli in una scatola di conservazione etichettata a -80 °C.
    NOTA: In alternativa, trasferire i crioviali congelati in azoto liquido (<-135 °C) per la conservazione a lungo termine.

2. Lavorazione di plasma e buffy coat da provette EDTA

  1. Centrifugare a 1.800 x g per 10 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Dopo la centrifugazione, lo strato superiore è costituito da plasma, il fondo contiene eritrociti e l'interfaccia sarà il buffy coat. Vedere la Figura 1B per una visualizzazione.
  2. Utilizzando una nuova pipetta di trasferimento, aspirare quanto più plasma possibile senza disturbare lo strato di buffy coat. Quindi, erogare 0,5 mL di aliquote in crioviali premarcati. Aspirare lo strato di buffy coat e trasferirlo nel crioviale opportunamente etichettato.
    NOTA: Alcuni plasma ed eritrociti possono contaminare la collezione di buffy coat.
  3. Ripetere il passaggio 2.2 per ogni paziente o condizione di trattamento, se necessario.
  4. Dopo la raccolta, conservare i crioviali in un congelatore a -80 °C.
    NOTA: In alternativa, conservare in azoto liquido (<-135 °C) per la conservazione a lungo termine.

3. Scongelamento delle PBMC

  1. Un giorno prima dello scongelamento, stampare una lista di controllo dei materiali e dei reagenti elencati nella Tabella 3 e preparare ed etichettare di conseguenza.
    NOTA: Questo protocollo è stato progettato per lo scongelamento di 1 provetta da 1,5 mL contenente 1 mL di PBMC. Ogni provetta produce circa 2 milioni di PBMC, di cui circa il 50% e il 20% saranno rispettivamente linfociti e monociti vivi. Scala di conseguenza per le esigenze sperimentali. Si noti che il numero assoluto di cellule può differire in modo significativo tra i pazienti o le condizioni di trattamento.
  2. Trasferire le PBMC congelate dal deposito con ghiaccio secco e scongelarle in un'incubatrice a 37 °C per 4 minuti, o appena prima dello scongelamento dell'ultimo cristallo di ghiaccio.
    NOTA: Se lo si desidera, è possibile prelevare un'aliquota per il conteggio delle cellule e le misure di vitalità, come descritto nella Sezione 4.
  3. Dopo lo scongelamento, aggiungere 1 mL di Soluzione 4 (PBS + 2 mM EDTA) a ciascun crioviale. Quindi, versare il contenuto in una provetta da 50 ml pre-marcata contenente 10 ml di soluzione 4 per ogni provetta PBMC scongelata. Tocca per rimuovere le gocce residue.
  4. Posizionare il filtro cellulare sulla provetta vuota da 50 mL, quindi versare la sospensione cellulare attraverso il filtro cellulare.
    NOTA: Se necessario, picchiettare leggermente per interrompere la tensione superficiale.
  5. Centrifugare ogni provetta contenente le celle filtrate a 400 x g per 7 minuti a temperatura ambiente.
  6. Dopo la centrifugazione, versare il surnatante contenente DMSO. Toccare secondo necessità per rimuovere le gocce residue.
  7. Risospendere il pellet cellulare nel terreno desiderato appropriato per le esigenze sperimentali a valle (ad es. terreni di coltura cellulare, cocktail di anticorpi per citometria a flusso, ecc.).

4. Conteggio e vitalità delle cellule

  1. Immediatamente dopo lo scongelamento delle PBMC congelate nella fase 3.2, pipettare 20 μL di cellule in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere un volume uguale di soluzione di Trypan Blue allo 0,4% e pipettare delicatamente su e giù 3-4 volte per mescolare.
  2. Utilizzando un contatore di cellule automatizzato, seguire il protocollo del produttore per contare le cellule e valutarne la vitalità. Assicurarsi che il fattore di diluizione di 2 sia preso in considerazione.
    NOTA: Come descritto altrove, un emocitometro può essere utilizzato come metodo alternativo per valutare la conta e la vitalità cellulare23.

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Risultati

Dopo la raccolta e la crioconservazione delle PBMC, la vitalità di PBMC, monociti e linfociti scongelati da 56 campioni unici è stata valutata mediante citometria a flusso utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 4 seguendo le istruzioni del produttore (Figura 2A-F). È stata raggiunta una vitalità media ± SD di PBMC, monociti e linfociti rispettivamente del 94 ± del 4,0%, del 98 ± dell'1,1% e del 93 ± del 5,6% (Figura 2G). ...

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Discussione

Questo protocollo per la raccolta e la crioconservazione delle PBMC è stato implementato con successo da individui con e senza una precedente formazione di laboratorio di ricerca. Nella nostra applicazione, il sequenziamento FACS e RNA di monociti altamente vitali purificati da PBMC conservati ha portato a sequenze di alta qualità.

Uno dei principali punti di forza di questo protocollo è la sua accessibilità. La tecnica presentata nel protocollo utilizza tubi ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari o non finanziari rilevanti da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare i pazienti che hanno offerto volontariamente il loro consenso, il loro tempo e la donazione di campioni di sangue. Ringraziamo anche il Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton e Mark McClellen del Kansas University Medical Center per la loro collaborazione e per l'implementazione di questo protocollo in un sito remoto. CY ha ricevuto supporto per la ricerca dalla sovvenzione NIH 1K08HL150271.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1000 µ L TipsGilsonF174501Sono necessari circa 3 puntali per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Provetta da 15 mLBiopioneeerCNT-15Per contenere Soluzioni 2/3
2 necessarie per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL CryovialsGlobe Scientific3012Sono necessari circa 40 crioviali per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µ L TipsGilsonF174201Per l'uso nel conteggio delle cellule; il volume necessario dipende dal metodo di conteggio delle cellule utilizzato. È necessario 1 puntale per 1 mL di PBMC congelate non raggruppate da scongelare
50 mL di provetta conicaCEM Corporation50-187-76832 necessarie per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
3 necessarie per 1 mL di PBMC congelate non raggruppate da scongelare
Anticorpo CD14Biolegend325621
CD16 AnticorpoBiolegend360723
CD19 AnticorpoBiolegend363007
CD3 AnticorpoBiolegend300405
CD56 AnticorpoBiolegend318303
CD66b AnticorpoBiolegend305103
Cell StrainerBiopioneeerDGN2583671 necessario per 1 mL di PBMC congelati non raggruppati da scongelare
Tubo per la preparazione delle cellule mononucleate CPTBD Biosciences3627536 provette necessarie per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer BoxSouthern LabwareSB2CC-81Contiene 81 provette
1 necessario per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube RackFisherbrand05-669-45Contiene fino a 50 crioviali
DMSOInvitrogen15575020Circa 2,5 mL necessari per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Acqua distillata priva di DNasi/RNasiInvitrogen10977015Circa 2 mL necessari per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Circa 9 mL necessari per 1 mL di PBMC congelati da scongelare
Provette EDTABD Biosciences366643necessaria 1 provetta per paziente/condizione di trattamento per la collezione PBMC/Plasma/Buffy Coat
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR AntibodyBiolegend307609
Albumina sierica umanaGeminiBio800-120Sono necessari circa 25 ml per paziente o condizione di trattamento per la collezione PBMC/Plasma/Buffy Coat
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanoloSigma-AldrichW292912-1KG-KPer l'uso nella stampante per etichette Mr. Frosty
PhomemoM110-WH
Macchia vivaBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Può contenere fino a 18 tubi.
Sono necessari 2 Mr. Frostys per paziente/condizione di trattamento per la pipetta Multidispense per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Brandtech705110
Puntali per pipette MultidispenseBrandtech705744Sono necessari circa 3 puntali per paziente/condizione di trattamento per la pipetta PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000GilsonF144059M
Pipetta P20GilsonF144056MPer l'uso nel conteggio delle cellule; il volume necessario dipende dal metodo di conteggio delle cellule utilizzato.
Etichette per stampantiPhomemoPM-M110-3020Sono necessarie circa 45 etichette per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Sono necessarie circa 5 etichette per 1 mL di PBMC congelate non raggruppate da scongelare EDTA
senza RNasi (0,5 M)InvitrogenAM9260GCirca 40 µ L necessario per 1 mL di PBMC congelate da scongelare
PBS senza RNasi (10X)InvitrogenAM9625Circa 1 mL necessario per 1 mL di PBMC congelate da scongelare
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVCirca 80 mL necessari per paziente o condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer PipetteFisherbrand13-711-7MCirca 5 necessari per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat
Supporto per provettedi raccolta Endicott-Seymour14-781-15Contiene fino a 80 provette CPT/EDTA
morta

Riferimenti

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Isolamento e crioconservazione di cellule mononucleate del sangue periferico umano altamente vitali da sangue intero: una guida per principianti
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