Articolo metodologico

Isolamento e crioconservazione di cellule mononucleate del sangue periferico umano altamente vitali da sangue intero: una guida per principianti

DOI:

10.3791/66794

⸱

25 ottobre 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Medical Biochemistry, Amsterdam Immunity and Infection: Inflammatory diseases; Amsterdam Cardiovascular Sciences: Atherosclerosis and Ischemic Syndrome, Amsterdam UMC location University of Amsterdam, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 4Division of Clinical Immunology & Rheumatology, Department of Medicine, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 5Comprehensive Arthritis, Musculoskeletal, Bone and Autoimmunity Center, Heersink School of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 6Department of Medicine, University of California San Diego

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta una guida accessibile per la raccolta, la conservazione e lo scongelamento di cellule mononucleate del sangue periferico adatte per analisi e flussi di lavoro a valle come la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA. Vengono dimostrate anche le collezioni di plasma e buffy coat.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono comunemente utilizzate nella ricerca biomedica sul sistema immunitario e la sua risposta a malattie e agenti patogeni. Questo protocollo dettagliato descrive le apparecchiature, le forniture e i passaggi per l'isolamento, la crioconservazione e lo scongelamento di PBMC di alta qualità e altamente vitali da cellule di sangue intero, adatte per applicazioni a valle come la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA. Vengono inoltre descritti i protocolli per l'elaborazione del plasma e del buffy coat dal sangue intero in parallelo e in concomitanza con le PBMC. Questo protocollo passo-passo facile da seguire, che utilizza la centrifugazione in gradiente di densità per isolare le PBMC, è accompagnato da una lista di controllo di forniture, attrezzature e fasi di preparazione. Questo protocollo è adatto a persone con qualsiasi esperienza precedente con le tecniche di laboratorio e può essere implementato in laboratori clinici o di ricerca. La vitalità cellulare e il sequenziamento dell'RNA di alta qualità sono il risultato di PBMC raccolti da operatori senza precedenti esperienze di laboratorio nell'utilizzo di questo protocollo.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo dimostra un metodo e un flusso di lavoro accessibili per l'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue intero. Questo protocollo è rivolto in particolare ai tecnici di ricerca alle prime armi, agli studenti e al personale di laboratorio clinico con l'obiettivo di facilitare la raccolta e la crioconservazione delle PBMC senza presupporre una formazione preliminare nelle tecniche di laboratorio.

Questo protocollo utilizza la centrifugazione per separare i componenti del sangue intero in base alla densità. Il sangue intero è costituito da quattro componenti principali elencati in ordine decrescente di densità: globuli rossi/eritrociti (~45% del volume), globuli bianchi (<1% del volume), piastrine (<1% del volume) e plasma (~55% del volume)1,2,3,4,5,6. I globuli bianchi possono essere suddivisi in due categorie in base alle caratteristiche dei loro nuclei: rotondi o plurinucleati6. Le PBMC sono definite come globuli bianchi con nuclei rotondi e sono costituite dai seguenti tipi di cellule: linfociti (cellule T, cellule B, cellule NK), cellule dendritiche e monociti6. I globuli bianchi multinucleati includono i granulociti, che consistono nei seguenti tipi di cellule: neutrofili, basofili ed eosinofili6. I globuli bianchi multinucleati sono più densi dei PBMC6. Le densità di ciascun componente del sangue intero sono dettagliate nella Tabella 1.

In questo protocollo, il sangue intero viene raccolto in provette per centrifugazione a gradiente di densità. Queste provette contengono un terreno di gradiente di densità preconfezionato con una densità di 1,077 g/mL. Dopo la centrifugazione, le cellule più dense, compresi i globuli bianchi multinucleati e gli eritrociti, vengono separate dalle PBMC e dalle piastrine mediante il mezzo del gradiente di densità (Figura 1A)6,7. La PBMC e la frazione piastrinica vengono quindi raccolte, lavate e centrifugate per rimuovere le piastrine. Le PBMC purificate risultanti vengono raccolte e conservate a -80 °C o in azoto liquido. Le PBMC crioconservate possono essere scongelate in modo vitale e utilizzate direttamente nelle analisi a valle o ulteriormente elaborate per isolare specifici tipi di cellule componenti.

Questo protocollo è stato ottimizzato per il sequenziamento di RNA di alta qualità da PBMC altamente vitali. In questo articolo, le PBMC sono state isolate e crioconservate da pazienti in una clinica ambulatoriale. Successivamente, i monociti sono stati isolati dalle PBMC mediante FACS e analizzati tramite sequenziamento dell'RNA. Tuttavia, il protocollo può essere ampiamente adattato ad altre esigenze sperimentali come la coltura cellulare, l'editing genetico, gli studi funzionali ex-vivo, le analisi di singole cellule, la fenotipizzazione mediante citometria a flusso o citometria a tempo di volo, l'isolamento di DNA/RNA o proteine, vetrini per immunoistochimica, tra gli altri 8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18.

Oltre alla raccolta di PBMC da provette per centrifugazione a gradiente di densità, questo protocollo esamina come raccogliere il plasma e il buffy coat tramite centrifugazione utilizzando una provetta EDTA. Dopo la centrifugazione, il sangue intero viene separato in plasma, eritrociti e un sottile strato di interfaccia chiamato buffy coat contenente leucociti (Figura 1B)6. Il buffy coat è comunemente usato per l'estrazione del DNA e le successive analisi genomiche19,20. Lo strato plasmatico contiene i componenti privi di cellule del sangue intero e può essere utilizzato per saggi di biomarcatori21,22.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo di studio è stato approvato dall'UCSD e dal KUMC Human Protections Program ed è conforme alla Dichiarazione di Helsinki. Tutti gli individui hanno fornito il consenso informato per la partecipazione e la raccolta del sangue.

1. Elaborazione e crioconservazione delle PBMC

  1. Un giorno prima del prelievo di sangue, stampare la lista di controllo dei materiali e dei reagenti elencati nella Tabella 2 e preparare ed etichettare di conseguenza.
    NOTA: Questo protocollo è stato progettato per la raccolta di 6 provette per centrifugazione a gradiente di densità. Ogni provetta produce circa 12 milioni di PBMC, di cui circa il 50% e il 20% saranno rispettivamente linfociti e monociti vivi. Scala di conseguenza per le esigenze sperimentali. Si noti che il numero assoluto di cellule può differire in modo significativo tra i pazienti o le condizioni di trattamento.
  2. Utilizzando la tecnica standard di flebotomia, raccogliere il sangue intero in 6 provette da centrifugazione a gradiente di densità e 1 provetta EDTA fino al riempimento, circa 6 ml di volume.
    NOTA: Se sono necessari campioni da più pazienti o condizioni di trattamento, le provette raccolte possono essere conservate fino a 4 ore e quindi elaborate contemporaneamente.
  3. Dopo la raccolta, centrifugare tutte le provette a 1.800 x g per 20 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Fare riferimento al Video supplementare 1 per una dimostrazione di come utilizzare una centrifuga.
  4. Dopo la centrifugazione, aprire con cautela la provetta per centrifugazione a gradiente di densità. Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere ed eliminare lo strato giallo traslucido contenente plasma. Non disturbare lo strato nebuloso di celle direttamente sopra il mezzo del gradiente di densità. Pecca per eccesso di cautela, lasciando il plasma in eccesso piuttosto che scartare le PBMC. Ripetere per tutte le provette.
    NOTA: Dopo la centrifugazione della provetta contenente il mezzo a gradiente di densità, il plasma e le PBMC saranno al di sopra del mezzo a gradiente di densità; Gli eritrociti e i granulociti si depositeranno sul fondo. Fare riferimento alla Figura 1A per una visualizzazione.
  5. Con una nuova pipetta di trasferimento, pipettare delicatamente su e giù il volume rimanente contenente le cellule e il plasma residuo in ciascuna provetta più volte al di sopra del mezzo di gradiente di densità.
  6. Dopo la risospensione, pipettare il contenuto risospeso della provetta in una provetta conica da 50 mL etichettata. Ripetere per tutte le provette.
  7. Versare la soluzione 1 (RPMI Medium) nella provetta da 50 mL fino a raggiungere la linea da 50 mL.
  8. Ripetere i passaggi da 1.4 a 1.7 per ogni paziente o condizione di trattamento, se necessario.
    NOTA: Assicurarsi che campioni diversi non siano mescolati e utilizzare una nuova pipetta di trasferimento per evitare contaminazioni.
  9. Centrifugare la provetta da 50 mL a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Il protocollo di raccolta del plasma e del buffy descritto nella Sezione 2 può essere completato durante questo periodo.
  10. Scartare quanto più surnatante possibile. Toccare secondo necessità per rimuovere le gocce residue.
    NOTA: Dopo la centrifugazione, il pellet contiene PBMC e il surnatante contiene piastrine e plasma residuo.
  11. Versare una provetta da 15 mL di Soluzione 2 (terreno RPMI + 12,5% albumina sierica umana + 1 μM di flavopiridol) nella provetta conica da 50 mL contenente il pellet di PBMC. Capovolgere delicatamente il tubo per risospendere il pellet della cella.
  12. Aspirare 15 mL di soluzione 3 (terreno RPMI + 11,25% albumina sierica umana + 1 μM di flavopiridolo + 10% DMSO) utilizzando una pipetta di trasferimento. Aggiungere goccia a goccia alla provetta da 50 mL.
    NOTA: La soluzione 3 contiene DMSO, che è tossico per le cellule a temperatura ambiente. Non aggiungere la soluzione 3 fino a quando non è pronta per essere immediatamente elaborata.
  13. Capovolgere delicatamente il tubo 3 volte per mescolare.
  14. Riempire ogni crioviale pre-marcato e pre-raffreddato con 1 mL di PBMC utilizzando una pipetta a dispensazione multipla.
    NOTA: Fare riferimento al Video supplementare 2 per una dimostrazione di come utilizzare una pipetta a dispensazione multipla.
  15. Metti i crioviali all'interno di un contenitore di congelamento pre-raffreddato. Quindi, spostare il contenitore in un congelatore a -80 °C.
  16. Ripetere i passaggi da 1.9 a 1.13 per ogni paziente o condizione di trattamento, se necessario.
  17. Conservare i crioviali all'interno del contenitore di congelamento per un minimo di 12 ore, quindi trasferirli in una scatola di conservazione etichettata a -80 °C.
    NOTA: In alternativa, trasferire i crioviali congelati in azoto liquido (<-135 °C) per la conservazione a lungo termine.

2. Lavorazione di plasma e buffy coat da provette EDTA

  1. Centrifugare a 1.800 x g per 10 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Dopo la centrifugazione, lo strato superiore è costituito da plasma, il fondo contiene eritrociti e l'interfaccia sarà il buffy coat. Vedere la Figura 1B per una visualizzazione.
  2. Utilizzando una nuova pipetta di trasferimento, aspirare quanto più plasma possibile senza disturbare lo strato di buffy coat. Quindi, erogare 0,5 mL di aliquote in crioviali premarcati. Aspirare lo strato di buffy coat e trasferirlo nel crioviale opportunamente etichettato.
    NOTA: Alcuni plasma ed eritrociti possono contaminare la collezione di buffy coat.
  3. Ripetere il passaggio 2.2 per ogni paziente o condizione di trattamento, se necessario.
  4. Dopo la raccolta, conservare i crioviali in un congelatore a -80 °C.
    NOTA: In alternativa, conservare in azoto liquido (<-135 °C) per la conservazione a lungo termine.

3. Scongelamento delle PBMC

  1. Un giorno prima dello scongelamento, stampare una lista di controllo dei materiali e dei reagenti elencati nella Tabella 3 e preparare ed etichettare di conseguenza.
    NOTA: Questo protocollo è stato progettato per lo scongelamento di 1 provetta da 1,5 mL contenente 1 mL di PBMC. Ogni provetta produce circa 2 milioni di PBMC, di cui circa il 50% e il 20% saranno rispettivamente linfociti e monociti vivi. Scala di conseguenza per le esigenze sperimentali. Si noti che il numero assoluto di cellule può differire in modo significativo tra i pazienti o le condizioni di trattamento.
  2. Trasferire le PBMC congelate dal deposito con ghiaccio secco e scongelarle in un'incubatrice a 37 °C per 4 minuti, o appena prima dello scongelamento dell'ultimo cristallo di ghiaccio.
    NOTA: Se lo si desidera, è possibile prelevare un'aliquota per il conteggio delle cellule e le misure di vitalità, come descritto nella Sezione 4.
  3. Dopo lo scongelamento, aggiungere 1 mL di Soluzione 4 (PBS + 2 mM EDTA) a ciascun crioviale. Quindi, versare il contenuto in una provetta da 50 ml pre-marcata contenente 10 ml di soluzione 4 per ogni provetta PBMC scongelata. Tocca per rimuovere le gocce residue.
  4. Posizionare il filtro cellulare sulla provetta vuota da 50 mL, quindi versare la sospensione cellulare attraverso il filtro cellulare.
    NOTA: Se necessario, picchiettare leggermente per interrompere la tensione superficiale.
  5. Centrifugare ogni provetta contenente le celle filtrate a 400 x g per 7 minuti a temperatura ambiente.
  6. Dopo la centrifugazione, versare il surnatante contenente DMSO. Toccare secondo necessità per rimuovere le gocce residue.
  7. Risospendere il pellet cellulare nel terreno desiderato appropriato per le esigenze sperimentali a valle (ad es. terreni di coltura cellulare, cocktail di anticorpi per citometria a flusso, ecc.).

4. Conteggio e vitalità delle cellule

  1. Immediatamente dopo lo scongelamento delle PBMC congelate nella fase 3.2, pipettare 20 μL di cellule in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere un volume uguale di soluzione di Trypan Blue allo 0,4% e pipettare delicatamente su e giù 3-4 volte per mescolare.
  2. Utilizzando un contatore di cellule automatizzato, seguire il protocollo del produttore per contare le cellule e valutarne la vitalità. Assicurarsi che il fattore di diluizione di 2 sia preso in considerazione.
    NOTA: Come descritto altrove, un emocitometro può essere utilizzato come metodo alternativo per valutare la conta e la vitalità cellulare23.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dopo la raccolta e la crioconservazione delle PBMC, la vitalità di PBMC, monociti e linfociti scongelati da 56 campioni unici è stata valutata mediante citometria a flusso utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 4 seguendo le istruzioni del produttore (Figura 2A-F). È stata raggiunta una vitalità media ± SD di PBMC, monociti e linfociti rispettivamente del 94 ± del 4,0%, del 98 ± dell'1,1% e del 93 ± del 5,6% (Figura 2G). La misurazione della vitalità mediante esclusione del blu di tripano ha prodotto una vitalità media di 88 ± 7,5% e una conta cellulare di 2,3 x 106 ± 1,9 x 106. L'analisi della citometria a flusso ha anche dimostrato che i monociti vivi costituivano il 17-± il 5,9% e i linfociti costituivano il 53-± il 13,0% del totale delle PBMC.

Successivamente, i monociti sono stati selezionati da PBMC scongelati da 59 campioni unici mediante citometria a flusso e inviati per la preparazione della libreria e il sequenziamento dell'RNA come descritto altrove24. Un numero medio di sequenze SD ± totali di 18,0 ± 16,3 milioni è stato raggiunto con un allineamento di lettura di 93 ± 6,3% e un contenuto di GC di 49,6 ± 1,4% (Figura 3A-B). È stata trovata una percentuale media di letture mappate in modo univoco ± SD dell'88 ± del 3,6% con un sottoinsieme di 56 campioni unici. Questi parametri dimostrano che le PBMC altamente valide adatte alle applicazioni a valle, compreso il sequenziamento dell'RNA di alta qualità, possono essere ottenute da operatori con qualsiasi livello di formazione di laboratorio utilizzando questo protocollo.

ComponenteDensitàCitazione
Plasmada 1,022 g/mL a 1,026 g/mL1
Piastrineda <1,061 g/mL a >1,070 g/mL2
PBMC<1,077 g/mL6
Neutrofili a bassa densità*<1,077 g/mL3
Granulociti (neutrofili*, basofili ed eosinofili)>1,077 g/mL6
Eritrociti1,11 g/mL4

Tabella 1: Componenti del sangue intero elencati in ordine decrescente di densità.

Reagant/MaterialeQuantità (per 6 provette CPT e 1 provetta EDTA)ManciaAvvertenze
Tubi CPT6Etichetta in base all'ID del paziente o del campione.
Tubo EDTA1Etichetta in base all'ID del paziente o del campione.
Provetta conica da 50 mL2Oltre all'ID del paziente o del campione, etichettare 1 provetta per le PBMC e 1 per i rifiuti.
Criovali39Etichetta 30 per PBMC, 8 per plasma EDTA e 1 per buffy coat. Non tutti i crioviali possono essere utilizzati.
Il signor Frosty2Riempire fino a metà con isopropanolo e pre-raffreddare per una notte a -20°C.L'isopropanolo è un irritante infiammabile. Tenere lontano da scintille/fiamme. Evitare di inalare e maneggiare con guanti e cura.
Flavopiridolo100 μL di stock 1000XPer preparare 1000X stock di flavopiridol, sospendere 5 mg di flavopiridol in 1,14 mL di DMSO per una concentrazione di 10 mM. Aliquotare 200 μl in contenitori individuali, quindi congelare. Per l'uso, scongelare le singole aliquote e diluire 1:10 in acqua distillata priva di DNasi/RNasi, quindi utilizzare come soluzione 1000X.Il flavopiridolo è un irritante. Maneggiare con i guanti e curare.
Soluzione 150 mlRPMI Medio.
Per preparare 50 mL di soluzione madre, utilizzare 50 mL di RPMI Medium.
Soluzione 215 mlRPMI Medium + 12,5% Albumina sierica umana + 1 μM di flavopiridol.
Per preparare 50 mL di soluzione madre, utilizzare 25 mL di terreno RPMI + 25 mL di albumina sierica umana + 50 μL di 1000X Flavopiridol.		Il flavopiridolo è un irritante. Maneggiare con i guanti e curare.
Soluzione 315 mlRPMI Medium + 11,25% albumina sierica umana + 1 μM di flavopiridolo + 10% DMSO.
Per preparare 50 mL di soluzione madre, utilizzare 22,5 mL di terreno RPMI + 22,5 mL di HSA + 5 mL di DMSO + 50 μL di 1000X Flavopiridol.		Il flavopiridolo è un irritante e il DMSO è tossico e viene facilmente assorbito attraverso la pelle. Maneggiare con i guanti e curare.

Tabella 2: Lista di controllo dei reagenti e dei materiali da preparare ed etichettare per la raccolta e la crioconservazione delle PBMC.

Reagant/MaterialeQuantità (per 1 ml di aliquota di PBMC congelati)ManciaAvvertenze
Soluzione 410 mlPBS + 2 mM EDTA

Per preparare 50 mL di soluzione madre, utilizzare 5 mL di PBS 10X + 200 μL di EDTA 0,5M + 44,8 mL di acqua distillata priva di DNasi/RNasi
Provetta conica da 50 mL3Oltre all'ID del paziente o del campione, etichettare 1 provetta per le PBMC pre-filtrate, 1 per le PBMC post-filtrate e 1 per i rifiuti. Riempire la provetta etichettata per PBMC precolorate con 9 mL di soluzione 4 per mL di PBMC congelate
Provetta da 1,5 mL1Per il conteggio delle cellule; etichetta con ID paziente o campione
Soluzione di Trypan Blue allo 0,4%20 μlPer il conteggio delle cellule; può essere aggiunto alla provetta da 1,5 ml in anticipo il giorno prima.Il blu di tripano è un agente cancerogeno. Maneggiare con i guanti e curare.

Tabella 3: Lista di controllo dei reagenti e dei materiali da preparare ed etichettare per lo scongelamento e il conteggio dei PBMC.

Reagente/MaterialeQuantità (per milione di celle)
Macchia di morte viva5 μl
Fiducia Umana FcX5 μl
Anticorpo CD35 μl
Anticorpo CD195 μl
Anticorpo CD565 μl
Anticorpo CD66b5 μl
Anticorpo HLA-DR5 μl
Anticorpo CD145 μl
Anticorpo CD162,5 μl
RNAsina100 Unità

Tabella 4: Tabella dei reagenti per l'isolamento dei monociti dalle PBMC mediante citometria a flusso.

Diagramma di separazione dei componenti del sangue in centrifugazione a gradiente di densità; plasma, PBMCs, strati di buffy coat.
Figura 1: Componenti del sangue intero separati mediante centrifugazione in centrifugazione a gradiente di densità o provette con EDTA. (A) La centrifugazione del sangue intero in provette per centrifugazione a gradiente di densità determina la separazione di plasma, piastrine e PBMC al di sopra del mezzo di gradiente di densità con multinucleati ed eritrociti al di sotto del mezzo di gradiente di densità. (B) La centrifugazione del sangue intero in provette EDTA determina la separazione del plasma nello strato più superficiale, degli eritrociti nello strato inferiore e del buffy coat nell'interfaccia. Creato con Biorender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

grafici a dispersione per citometria a flusso; PBMC, monociti, linfociti; Analisi di vitalità, grafico del tipo di cellula.
Figura 2: La vitalità delle PBMC crioconservate scongelate è stata valutata mediante colorazione a flusso vivo/morto e citometria a flusso. (A) I detriti, contrassegnati da un asterisco *, sono esclusi dalle PBMC mediante un gating a dispersione anteriore e laterale. (B) Analisi rappresentativa vivo/morto di PBMC interi (C) I pan-monociti sono classificati come HLA-DR positivi e negativi per i seguenti antigeni di superficie marcati con FITC: CD3, CD19, CD56 e CD66b. (D) Analisi rappresentativa viva/morta dei monociti. (E) Linfociti controllati dai seguenti antigeni di superficie marcati con FITC: CD3, CD19, CD56 e CD 66b. (F) Analisi rappresentativa dei linfociti vivi/morti. (G) Percentuale di vitalità di ciascun tipo di cellula quantificata da 56 campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Grafici di analisi dei dati FastQC; Milioni di sequenze vs distribuzione di contenuti GC allineabile.
Figura 3: Qualità del sequenziamento dell'RNA dei monociti selezionati da PBMC crioconservate. Sono stati sequenziati 56 campioni unici e sono state generate ± medie SD 18,0 ± 16,3 milioni di sequenze totali. (A) L'allineamento era elevato, con il 92,5% ± il 6,3% delle sequenze allineate con il genoma di riferimento. (B) Il contenuto di GC di queste sequenze era del 49,6 ± dell'1,4%. Creato con FastQC25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video supplementare 1: Dimostrazione di come utilizzare la centrifuga Fare clic qui per scaricare questo file.

Video supplementare 2: Dimostrazione di come utilizzare una pipetta multi-dispenser. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo per la raccolta e la crioconservazione delle PBMC è stato implementato con successo da individui con e senza una precedente formazione di laboratorio di ricerca. Nella nostra applicazione, il sequenziamento FACS e RNA di monociti altamente vitali purificati da PBMC conservati ha portato a sequenze di alta qualità.

Uno dei principali punti di forza di questo protocollo è la sua accessibilità. La tecnica presentata nel protocollo utilizza tubi preconfezionati con un mezzo a gradiente a densità solida. Di conseguenza, il sangue intero può essere raccolto direttamente nella provetta e quindi immediatamente processato per isolare le PBMC. È necessario un numero relativamente ridotto di soluzioni preconfezionate e attrezzature specializzate, che facilitino la collaborazione tra il laboratorio di ricerca, dove possono essere preparati i reagenti, e il laboratorio clinico, dove i campioni vengono raccolti ed elaborati. I protocolli scritti e video sono rivolti agli operatori di qualsiasi livello di formazione.

Sebbene questo protocollo utilizzi sangue intero fresco per isolare le PBMC e, quindi, abbia una resa e una purezza attese relativamente elevate del >90%, potrebbe non essere adatto per applicazioni che richiedono purezze eccezionalmente elevate del >98%26,27. Inoltre, le provette per centrifugazione a gradiente di densità possono essere costose da ottenere, soprattutto se è necessario raccogliere un gran numero di campioni.

Metodi alternativi di raccolta di PBMC includono l'uso di un mezzo di gradiente di densità liquida o deplezione immunomagnetica28,29. In breve, il primo prevede la stratificazione di un terreno di gradiente di densità preconfezionato sotto sangue intero eparinizzato, seguito da centrifugazione. Quest'ultimo utilizza anticorpi marcati magneticamente per marcare i non-PBMC, che vengono poi trattenuti in una colonna magnetica mentre i PBMC non marcati passano inalterati.

Rispetto al protocollo presentato, l'uso di un mezzo a gradiente di densità liquido è meno costoso e richiede molto meno materiale a causa della mancanza di provette per centrifugazione a gradiente di densità; L'isolamento PBMC può essere eseguito in una provetta standard da 50 mL8. Tuttavia, questa tecnica è più elaborata, ha un tempo di elaborazione più lungo e può essere soggetta a un rischio maggiore di errore da parte dell'utente. L'eparina deve essere aggiunta con precisione per evitare un'eccessiva diluizione e il mezzo del gradiente di densità deve essere stratificato con cura nelle quantità corrette per garantire una buona separazione PBMC26.

Rispetto al protocollo presentato, l'uso della deplezione immunomagnetica offre una maggiore resa e purezza, una manipolazione ridotta a causa della mancanza di centrifugazione, un tempo di lavorazione più rapido e richiede molto meno materiale 30,31,32. Tuttavia, lo svantaggio principale è che questo metodo è il più costoso dei tre metodi descritti, soprattutto su larga scala.

Sebbene questo protocollo sia robusto, alcuni passaggi critici possono richiedere ulteriore attenzione. Durante tutto il protocollo, assicurarsi che i campioni non vengano mescolati e inseriti nelle provette adeguatamente etichettate, soprattutto quando si lavora con più pazienti o condizioni contemporaneamente. Per il passaggio 1.4, assicurarsi che non vengano scartate le PBMC; l'eccesso di plasma non farà altro che diminuire la concentrazione di PBMC, che è meno critica per mantenere la vitalità e la qualità del campione. Separatamente, la presenza di precipitati nelle PBMC raccolte suggerisce che pezzi del mezzo del gradiente di densità sono stati rimossi. Pipettare più delicatamente al punto 1.5 per evitare questo problema. Nei passaggi 1.10 e 3.6, assicurarsi che il pellet della cella centrifugata non venga scartato. Lavorare rapidamente è fondamentale per le fasi 1.12 e 3.3 poiché la soluzione 3 contiene DMSO, che è tossico per le cellule a temperatura ambiente33. È inoltre importante notare che si consiglia di conservare le PBMC in azoto liquido rispetto allo stoccaggio a -80°C. La conservazione a lungo termine a -80°C è stata associata a una diminuzione della vitalità cellulare e a un'alterazione dell'espressione genica34,35.

Questo protocollo può essere adattato in base alle esigenze sperimentali. L'aggiunta di flavopiridol, un inibitore della RNA polimerasi e della sintesi dell'mRNA, nelle soluzioni 2 e 3 ha lo scopo di prevenire qualsiasi manipolazione e artefatto indotto dallo stress con il sequenziamento dell'RNA36. Tuttavia, il flavopiridolo può essere omesso se si desiderano studi funzionali o ex vivo che utilizzano PBMC.

Il plasma raccolto dalle provette di EDTA sarà contaminato con EDTA, un agente chelante. Di conseguenza, il plasma EDTA non è adatto per i test che coinvolgono la coagulazione o gli ioni calcio37,38. Se lo si desidera, lo strato di plasma nelle provette del mezzo a gradiente di densità dopo la centrifugazione può essere raccolto nella fase 1.4. Questi tubi contengono eparina sodica come anticoagulante che può essere rimosso con l'aggiunta di eparinasi39. In particolare, l'eparina inibisce la trascrittasi inversa e l'amplificazione della PCR, rendendo il plasma raccolto inadatto per esperimenti di PCR senza l'aggiunta di un agente bloccante l'eparina40.

Il buffy coat raccolto dalle provette di EDTA non viene conservato in una soluzione contenente DMSO o flavopiridol. Il DMSO è importante nel ridurre la formazione di cristalli di ghiaccio e la morte cellulare41. Il flavopiridolo è importante per l'inibizione della sintesi dell'RNA36. Pertanto, il buffy coat non è adatto per analisi ex vivo e trascrittomiche. Se lo si desidera, i passaggi da 1.6 a 1.15 possono essere eseguiti utilizzando il buffy coat raccolto al fine di massimizzare la vitalità cellulare e inibire la sintesi dell'RNA.

Sebbene questo protocollo sia stato progettato per il sequenziamento dell'RNA, ulteriori potenziali applicazioni delle PBMC raccolte e crioconservate utilizzando questo protocollo includono la coltura cellulare, l'editing genetico, gli studi funzionali ex-vivo, le analisi di singole cellule, la fenotipizzazione mediante citometria a flusso o citometria a tempo di volo, l'isolamento di DNA/RNA o proteine, vetrini per immunoistochimica, tra gli altri.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno interessi finanziari o non finanziari rilevanti da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare i pazienti che hanno offerto volontariamente il loro consenso, il loro tempo e la donazione di campioni di sangue. Ringraziamo anche il Dr. Patrick Moriarty, Julie-Ann Dutton e Mark McClellen del Kansas University Medical Center per la loro collaborazione e per l'implementazione di questo protocollo in un sito remoto. CY ha ricevuto supporto per la ricerca dalla sovvenzione NIH 1K08HL150271.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1000 µ L TipsGilsonF174501Sono necessari circa 3 puntali per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Provetta da 15 mLBiopioneeerCNT-15Per contenere Soluzioni 2/3
2 necessarie per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
2 mL CryovialsGlobe Scientific3012Sono necessari circa 40 crioviali per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
20 µ L TipsGilsonF174201Per l'uso nel conteggio delle cellule; il volume necessario dipende dal metodo di conteggio delle cellule utilizzato. È necessario 1 puntale per 1 mL di PBMC congelate non raggruppate da scongelare
50 mL di provetta conicaCEM Corporation50-187-76832 necessarie per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
3 necessarie per 1 mL di PBMC congelate non raggruppate da scongelare
Anticorpo CD14Biolegend325621
CD16 AnticorpoBiolegend360723
CD19 AnticorpoBiolegend363007
CD3 AnticorpoBiolegend300405
CD56 AnticorpoBiolegend318303
CD66b AnticorpoBiolegend305103
Cell StrainerBiopioneeerDGN2583671 necessario per 1 mL di PBMC congelati non raggruppati da scongelare
Tubo per la preparazione delle cellule mononucleate CPTBD Biosciences3627536 provette necessarie per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryo Freezer BoxSouthern LabwareSB2CC-81Contiene 81 provette
1 necessario per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Cryotube RackFisherbrand05-669-45Contiene fino a 50 crioviali
DMSOInvitrogen15575020Circa 2,5 mL necessari per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Acqua distillata priva di DNasi/RNasiInvitrogen10977015Circa 2 mL necessari per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Circa 9 mL necessari per 1 mL di PBMC congelati da scongelare
Provette EDTABD Biosciences366643necessaria 1 provetta per paziente/condizione di trattamento per la collezione PBMC/Plasma/Buffy Coat
FlavopiridolSigma-AldrichF3055-5MG
HLA-DR AntibodyBiolegend307609
Albumina sierica umanaGeminiBio800-120Sono necessari circa 25 ml per paziente o condizione di trattamento per la collezione PBMC/Plasma/Buffy Coat
Human Trustain FcXBiolegend422301
IsopropanoloSigma-AldrichW292912-1KG-KPer l'uso nella stampante per etichette Mr. Frosty
PhomemoM110-WH
Macchia vivaBiolegend423105
Mr. FrostyThermo Scientific5100-0001Può contenere fino a 18 tubi.
Sono necessari 2 Mr. Frostys per paziente/condizione di trattamento per la pipetta Multidispense per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Brandtech705110
Puntali per pipette MultidispenseBrandtech705744Sono necessari circa 3 puntali per paziente/condizione di trattamento per la pipetta PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
P1000GilsonF144059M
Pipetta P20GilsonF144056MPer l'uso nel conteggio delle cellule; il volume necessario dipende dal metodo di conteggio delle cellule utilizzato.
Etichette per stampantiPhomemoPM-M110-3020Sono necessarie circa 45 etichette per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Sono necessarie circa 5 etichette per 1 mL di PBMC congelate non raggruppate da scongelare EDTA
senza RNasi (0,5 M)InvitrogenAM9260GCirca 40 µ L necessario per 1 mL di PBMC congelate da scongelare
PBS senza RNasi (10X)InvitrogenAM9625Circa 1 mL necessario per 1 mL di PBMC congelate da scongelare
RNasinPromegaN2111
RPMICorning10-040-CVCirca 80 mL necessari per paziente o condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection
Transfer PipetteFisherbrand13-711-7MCirca 5 necessari per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat
Supporto per provettedi raccolta Endicott-Seymour14-781-15Contiene fino a 80 provette CPT/EDTA
morta

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. Physiology, Blood Plasma. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).
  2. Van Oost, B., Van Hien-Hagg, I. H., Timmermans, A. P., Sixma, J. J. The effect of thrombin on the density distribution of blood platelets: Detection of activated platelets in the circulation. Blood. 62 (2), 433-438 (1983).
  3. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 107 (5), 809-818 (2020).
  4. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLOS ONE. 12 (7), e0180520(2017).
  5. Manzone, T. A., Dam, H. Q., Soltis, D., Sagar, V. V. Blood volume analysis: A new technique and new clinical interest reinvigorate a classic study. JNMT. 35 (2), 55-63 (2007).
  6. Kleiveland, C. R. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo models. , Springer. Cham. 161-167 (2015).
  7. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Adv Clin Chem. 92, 141-199 (2019).
  8. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Multiple sclerosis: Methods and Protocols. 1304, Humana Press. New York, NY. 53-61 (2016).
  9. Panda, S. K., Ravindran, B. In vitro Culture of Human PBMCs. Bio Protoc. 3 (3), e322(2013).
  10. He, D., et al. Whole blood vs PBMC: Compartmental differences in gene expression profiling exemplified in asthma. Allergy Asthma Clinic Immol. 15, 67(2019).
  11. Pelák, O., et al. Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix. Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).
  12. Higdon, L. E., et al. Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing. Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).
  13. Liu, Z., et al. Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice. ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).
  14. Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis. Front Med. 11, 1369341(2024).
  15. Honardoost, M. A., et al. Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes. Genome Med. 16, 45(2024).
  16. Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells. NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).
  17. Luo, Y., et al. Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9. Front Immunol. 15, e1303356(2024).
  18. Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy. Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).
  19. Rucci, C., et al. Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study. FASEB J. 38 (10), e23672(2024).
  20. Ghamrawi, R., et al. Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy. Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).
  21. Johansson, C., et al. Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease. Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).
  22. Bonaterra-Pastra, A., et al. Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Biomedicines. 9 (1), 72(2021).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harb Protoc. (11), prot097980(2019).
  24. Cobo, I., et al. Monosodium urate crystals regulate a unique JNK-dependent macrophage metabolic and inflammatory response. Cell Rep. 38 (10), e110489(2022).
  25. Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2015).
  26. Corkum, C. P., et al. Immune cell subsets and their gene expression profiles from human PBMC isolated by Vacutainer Cell Preparation Tube (CPT™) and standard density gradient. BMC Immunology. 16, 48(2015).
  27. Golke, T., et al. Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability. Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).
  28. Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).
  29. Faass, L., et al. Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori. Front Immunol. 12, e632154(2021).
  30. Preobrazhensky, S. N., Bahler, D. W. Immunomagnetic bead separation of mononuclear cells from contaminating granulocytes in cryopreserved blood samples. Cryobiology. 59 (3), 366-368 (2009).
  31. Schenz, J., Obermaier, M., Uhle, S., Weigand, M. A., Uhle, F. Low-density granulocyte contamination from peripheral blood mononuclear cells of patients with sepsis and how to remove it - A technical report. Front Immunol. 12, e684119(2021).
  32. Tessema, B., Riemer, J., Sack, U., König, B. Cellular stress assay in peripheral blood mononuclear cells: factors influencing its results. Int J Mol Sci. 23 (21), 13118(2022).
  33. abc. Chen, X., Thibeault, S. 2013 35th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), , IEEE. 6228-6231 (2013).
  34. Yang, J., et al. The effects of storage temperature on PBMC gene expression. BMC Immunol. 17, 6(2016).
  35. Ticha, O., Moos, L., Bekeredjian-Ding, I. Effects of long-term cryopreservation of PBMC on recovery of B cell subpopulations. J Immunol Methods. 495, e113081(2021).
  36. Chao, S. -H., Price, D. H. Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo. J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).
  37. Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
  38. Mohri, M., Rezapoor, H. Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum. Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).
  39. Edwards, K., et al. Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I. J Virol Methods. 327, 114944(2024).
  40. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13 (3), 133-140 (1999).
  41. Yuan, Y., et al. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C. Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Isolamento di PBMCCentrifugazione a gradiente di densitCrioconservazione cellulareBuffy coatPlasma EDTACitometria a flussoSequenziamento dell RNAVitalit cellulareSorting dei monociti

Articoli correlati