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Articolo metodologico

Modellazione in vitro della deposizione di grasso nella malattia epatica steatosica associata a disfunzione metabolica

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DOI:

10.3791/66810

⸱

19 luglio 2024

 ,  ,  ,  , 
1Inner Mongolia Medical University, 2Xilin Gol League Mongolian Medical Hospital, 3National and local Joint Mongolian Medicine R & D Engineering Center, 4Inner Mongolia Minzu University, 5Affiliated Hospital of Inner Mongolia Minzu University, 6Traditional Chinese & Mongolian Medical Research Institute of Inner Mongolia

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive l'uso di cellule HepG2 indotte da acido oleico come modello per la malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica.

Abstract

La prevalenza della malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD) è aumentata a causa dei cambiamenti nei modelli economici e di stile di vita, portando a significative sfide per la salute. Rapporti precedenti hanno studiato la creazione di modelli animali e cellulari per MASLD, evidenziando le differenze tra di loro. In questo studio, è stato creato un modello cellulare inducendo l'accumulo di grasso in MASLD. Le cellule HepG2 sono state stimolate con l'acido grasso insaturo acido oleico a varie concentrazioni (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) per emulare la MASLD. L'efficacia del modello è stata valutata utilizzando i saggi del kit di conteggio cellulare-8, la colorazione Oil Red O e l'analisi del contenuto lipidico. Questo studio mirava a creare un modello cellulare semplice da usare per le cellule MASLD. I risultati dei saggi del kit di conteggio delle cellule-8 hanno mostrato che la sopravvivenza delle cellule HepG2 dipendeva dalla concentrazione di acido oleico, con un GI50 di 1,875 mM. La vitalità cellulare nei gruppi 0,5 mM e 1 mM era significativamente inferiore rispetto a quella del gruppo di controllo (P < 0,05). Inoltre, la colorazione con olio rosso O e l'analisi del contenuto lipidico hanno esaminato la deposizione di grasso a concentrazioni variabili di acido oleico (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) su cellule HepG2. Il contenuto lipidico dei gruppi 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM era significativamente superiore a quello del gruppo di controllo (P < 0,05). Inoltre, i livelli di trigliceridi nei gruppi OA erano significativamente più alti di quelli nel gruppo di controllo (P < 0,05).

Introduzione

La malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD) comprende una serie di condizioni, tra cui la steatosi semplice, la steatoepatite non alcolica (NASH), la cirrosi e il carcinoma epatocellulare 1,2,3,4,5,6, tutti attribuiti a fattori diversi dal consumo di alcol7. La MASLD è la malattia epatica più diffusa causata da danno epatico metabolico, che colpisce quasi un quarto della popolazione globale 8,9,10,11,12. Sebbene la patogenesi precisa della MASLD non sia stata ancora chiarita, varie teorie tentano di spiegarne lo sviluppo. Una nozione prevalente suggerisce un allontanamento dalla classica teoria dei "due colpi" verso un modello "a colpi multipli"1. Al centro di queste ipotesi c'è il ruolo dell'insulino-resistenza, che si ritiene sia fondamentale nella patogenesi13 della MASLD. La ricerca indica che l'insulino-resistenza negli epatociti porta ad un aumento dei livelli di acidi grassi liberi, formando successivamente i trigliceridi immagazzinati nel fegato14,15.

I ricercatori hanno utilizzato modelli sia in vivo che in vitro per simulare la deposizione di grasso in MASLD; Tuttavia, replicare completamente il suo meccanismo patologico rimane una sfida. Nonostante questa limitazione, questi modelli sono stati determinanti nello studio di potenziali bersagli terapeutici per MASLD. Tuttavia, lo sviluppo di un modello stabile di MASLD è fondamentale. Sebbene i modelli animali siano efficaci, richiedono tempo e denaro, evidenziando così il crescente interesse per i modelli cellulari in vitro . Questi modelli utilizzano spesso acidi grassi liberi singoli o multipli come l'acido oleico (OA) e l'acido palmitico per ricreare la MASLD indotta dalla dieta. Tra queste, la linea cellulare di epatoblastoma umano HepG2 viene spesso utilizzata per stabilire modelli cellulari in vitro di MASLD.

L'induzione dell'OA stimola le cellule HepG2 a replicare la deposizione di grasso in modo simile alla MASLD, un metodo con una storia ben consolidata. Lo scopo di questo studio era dimostrare la vitalità, la colorazione Oil Red O (ORO), il contenuto lipidico e il livello di trigliceridi (TG) delle cellule HepG2 trattate con 0,25 mM di OA. L'obiettivo di questo esperimento è stato quello di fornire ulteriori prove per lo sviluppo di studi di modellazione MAFLD.

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Protocollo

NOTA: Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Coltura cellulare

  1. Colture di cellule HepG2 in fiasche di coltura contenenti Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (contenenti il 10% di siero fetale bovino [FBS], 100 unità/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina). Mantenere i matracci di coltura a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .

2. Effetto dell'acido oleico sulla vitalità cellulare misurato dal kit per il conteggio delle cellule-8

  1. Sciogliere un volume specifico di OA in dimetilsolfossido (DMSO) per ottenere una concentrazione di 200 mM. Conservare la soluzione a -20 °C per un uso futuro.
  2. Seminare le cellule HepG2 in una piastra a 96 pozzetti con una densità cellulare di 6 × 103 celle per pozzetto. Aggiungere 100 μl di DMEM a ciascun pozzetto. Incubare e coltivare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per 24 ore. Dividi le cellule HepG2 in due gruppi:
    1. Gruppo di controllo: aggiungere il terreno di coltura cellulare.
    2. Gruppo OA: aggiungere OA al terreno di coltura cellulare per ottenere concentrazioni finali di 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM.
  3. Dopo 24 ore di incubazione iniziale, scartare il surnatante da ciascun pozzetto e aggiungere OA secondo il raggruppamento specificato, aggiungendo 100 μl per pozzetto. Per il gruppo di controllo, aggiungere 100 μL di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto. Continuare a incubare le celle per altre 24 ore.
    NOTA: Assicurarsi che ogni gruppo abbia sei pozzetti di replica. Per evitare l'evaporazione, aggiungere 100 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) all'anello esterno dei pozzetti nella piastra a 96 pozzetti.
  4. Dopo 24 ore di incubazione, aggiungere 10 μL di kit per il conteggio delle cellule-8 (CCK-8) a ciascun pozzetto, mescolare delicatamente e incubare per 2 ore al buio. Estrarre la piastra a 96 pozzetti dall'incubatore, inserirla nel lettore di micropiastre e misurare il valore di assorbanza a 450 nm (A450). I valori di IG50 sono stati contati in base all'OD.

3. Colorazione con olio rosso O per osservare la formazione di goccioline lipidiche intracellulari

  1. Seminare le cellule HepG2 in piastre di coltura cellulare a 6 pozzetti a una densità di 5 × 105 cellule per pozzetto e coltivare le piastre in un incubatore a temperatura costante per 24 ore. Fare riferimento alla Figura 1 per una rappresentazione visiva dei passaggi descritti.
  2. Dopo 24 ore di coltura cellulare, aggiungere 2 mL di terreno di coltura cellulare contenente OA a ciascun pozzetto, ottenendo concentrazioni finali di 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM. Dopo altre 24 ore, rimuovere il terreno di coltura cellulare da ciascun pozzetto e lavare due volte con PBS. Aggiungere 1 mL di fissativo ORO a ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti.
  3. Preparare la soluzione colorante ORO mescolando la soluzione colorante A con la soluzione colorante B in un rapporto di 3:2. Lasciare riposare il composto a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi filtrarlo una volta attraverso un filtro da 0,45 μm. Conservare la soluzione filtrata in una provetta da centrifuga al riparo dalla luce fino al momento dell'uso.
  4. Scartare il fissativo e lavare due volte con acqua distillata. Aggiungere 1 mL di isopropanolo al 60% in ciascun pozzetto e incubare per 30 s. Scartare il 60% della soluzione di isopropanolo e aggiungere 1 mL di soluzione colorante ORO appena preparata a ciascun pozzetto prima di incubare per 20 minuti. Scartare la soluzione colorante ORO, aggiungere 1 mL di isopropanolo al 60% in ciascun pozzetto e incubare per 30 s. Lavare 5 volte con acqua per rimuovere la tintura in eccesso.
  5. Coprire le cellule con acqua distillata e osservare al microscopio. Una volta raccolte le immagini, scartare il liquido nella lastra e lasciarla asciugare. Quindi, aggiungere 2 mL di isopropanolo a ciascun pozzetto e agitare la piastra su uno shaker orbitale per 10 minuti. Trasferire il liquido in una nuova piastra da 96 pozzetti, con 16 pozzetti in ciascun gruppo, aggiungendo 100 μl per pozzetto. Calcolare il contenuto lipidico misurando la densità ottica (OD) di ciascun pozzetto utilizzando un lettore di micropiastre a 510 nm (A510).

4. Effetti di diverse concentrazioni di acido oleico sui trigliceridi totali nel surnatante cellulare HepG2

  1. Equilibrare il kit a temperatura ambiente per 20 minuti e preparare le piastre necessarie per l'esperimento.
  2. Raccogliere il surnatante cellulare e centrifugare a 1.570 × g per 10 minuti. Impostazione di pozzetti standard e test di pozzetti campione. Aggiungere 50 μL di concentrazione standard ([S0 → S5] seguita da: 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 mmol/L) ai pozzetti standard. Oltre ai pozzetti bianchi e standard, aggiungere 10 μl di campioni diversi ai pozzetti, quindi aggiungere 40 μl di diluente per campioni a ciascun pozzetto. Aggiungere 100 μl di anticorpo di rilevazione-perossidasi di rafano a ciascun pozzetto, sigillare con una membrana a piastra e incubare a 37 °C per 1 ora in un forno a temperatura costante.
  3. Scartare il surnatante, asciugare su carta priva di polvere e lavare ogni pozzetto con 1 soluzione di lavaggio. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 min. Ripetere il processo di lavaggio 5 volte.
  4. Aggiungere 50 μl di substrato A e 50 μl di substrato B a ciascun pozzetto. Mescolare delicatamente e incubare per 15 minuti a 37 °C. Aggiungere 50 μL di soluzione di terminazione a ciascun pozzetto e misurare il valore OD di ciascun pozzetto a 450 nm (A450) entro 15 minuti.
  5. Tracciare la concentrazione dello standard lungo l'asse x e il corrispondente valore di assorbanza (OD) lungo l'asse y per eseguire la regressione lineare e derivare l'equazione della curva per calcolare il valore di concentrazione di ciascun campione.

5. Analisi statistica

  1. Determinare differenze significative nei dati quantitativi.
  2. Calcola la media ± la deviazione standard (SD) e rappresenta graficamente i dati. Considera P < 0,05 come statisticamente significativo.

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Risultati

Effetto dell'acido oleico sulla vitalità cellulare
Le cellule HepG2 sono state esposte a concentrazioni variabili di OA (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), con conseguente diminuzione dei tassi di sopravvivenza cellulare a 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM rispetto a 0 mM. La significatività statistica è stata osservata a 0,5 mM (P < 0,05) e 1 mM (P < 0,05) rispetto a 0 mM. I risultati dell'impatto dell'OA sulla vitalità cellulare, valutati dal kit CCK-8, sono mostrati nell...

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Discussione

La MASLD è una sindrome clinicopatologica caratterizzata da un'eccessiva deposizione di grasso intracellulare negli epatociti dovuta a fattori diversi dall'alcol e da altri agenti dannosi per il fegato18. La MASLD è strettamente legata al danno epatico da stress metabolico acquisito, in particolare associato all'insulino-resistenza e alla suscettibilità genetica. Per studiare e selezionare efficacemente i farmaci per la MASLD, è fondamentale selezionare un modello sperimentale appropriato. La crea...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Il presente studio è stato finanziato da "Studio sulle questioni chiave dell'effetto curativo di Koumiss sulle malattie regionali della medicina mongola" nel 2018 Progetto supportato del programma scientifico e tecnologico del Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Regione Autonoma della Mongolia Interna.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 µ m filtroMillex
0,25% Tripsina-EDTA (1x) Tripsina-EDTAGibco25200-056
0,45 µ m filterMillex
2 mL Fiale crigenicheCORNING430659
25 cm2 Pallone per colture cellulariCORNING430639
6 pozzetti Piastra per colture cellulariCORNING3516
Piastra per colture cellulari a 96 pozzettiCORNING3599
Piastra per emocromoShanghai Jing Jing Reagente biochimico e Strumento Co.
Kit di conteggio delle cellule-8 saggiPechino Solarbio Science & Tecnologia Co., Ltd.CA1210-1000T
CO2 incubatoreNUAIRENU-5710E
  DMSO Dimetil solfossido Pechino Solarbio Scienza & Tecnologia Co., Ltd.D8371
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco8122691
Enzyme Labeling EquipmentTecanSpark
Fetal Bovine Serum,qualificata Gibco10099141
HepG2North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)221031
ELISA di trigliceridi umani (TG) istruzioniNanjing Jiacheng Bioengineering Institute20170301
Microscopio invertito per colture cellulariLeicaDMi1 
IsopropanoloTianjin Zhiyuan Reagente Chimico Co.
2021030141 Kit Macchia Rossa Olio, Per Cellule Coltivate PechinoSolarbio Scienza & Tecnologia Co., Ltd.G1262
Acido oleico Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Penicillina StreptomicinaGibco15140122
SPSS 24.0Software di statistica
02270113 linea cellulare Beijing A502071

Riferimenti

  1. Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).
  2. Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).
  3. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).
  4. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  5. European Association for the Study of the Liver (EASL); European Association for the Study of Diabetes (EASD); European Association for the Study of Obesity (EASO). EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the Management of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. Obes Facts. 9 (2), 65-90 (2016).
  6. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  7. Díaz, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).
  8. Cotter, T. G., Rinella, M. Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease. Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).
  9. Lonardo, A., et al. Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation. Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).
  10. Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts. Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).
  11. Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter's guide. Nutrients. 9 (10), 1072(2017).
  12. Wieckowska, A., Feldstein, A. E. Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive. Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).
  13. Stein, L. L., Dong, M. H., Loomba, R. Insulin sensitizers in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: Current status. Adv Ther. 26 (10), 893-907 (2009).
  14. Milić, S., Lulić, D., Štimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  15. Neuschwander-Tetri, B. A., Caldwell, S. H. Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference. Hepatology. 37 (5), 1202-1219 (2003).
  16. Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution. Adipocyte. 12 (1), 2179334(2023).
  17. Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).
  18. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  19. Watkins, P. A., Ellis, J. M. Peroxisomal acyl-CoA synthetases. Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).
  20. Heeren, J., Scheja, L. Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism. Mol Metab. 50, 101238(2021).
  21. Kim, S. H., et al. Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells. Molecules. 28 (3), 1476(2023).
  22. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  23. Li, J., et al. Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD. Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).
  24. Li, Y., et al. Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway. Biomed Pharmacother. 160, 114319(2023).
  25. Liu, H., et al. Zeaxanthin prevents ferroptosis by promoting mitochondrial function and inhibiting the p53 pathway in free fatty acid-induced HepG2 cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1868 (4), 159287(2023).
  26. Mun, J., et al. Water extract of Curcuma longa L. ameliorates non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 11 (10), 2536(2019).
  27. Park, M., Yoo, J. H., Lee, Y. S., Lee, H. J. Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Nutrients. 11 (3), 494(2019).
  28. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomed Pharmacother. 118, 109287(2019).
  29. Alkhatatbeh, M. J., Lincz, L. F., Thorne, R. F. Low simvastatin concentrations reduce oleic acid-induced steatosis in HepG(2) cells: An in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease. Exp Ther Med. 11 (2), 1487-1492 (2016).
  30. Cui, W., Chen, S. L., Hu, K. Q. Quantification and mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells. Am J Transl Res. 2 (1), 95-104 (2010).
  31. Guo, X., Yin, X., Liu, Z., Wang, J. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) pathogenesis and natural products for prevention and treatment. Int J Mol Sci. 23 (24), 15489(2022).
  32. Rafiei, H., Omidian, K., Bandy, B. Dietary polyphenols protect against oleic acid-induced steatosis in an in vitro model of NAFLD by modulating lipid metabolism and improving mitochondrial function. Nutrients. 11 (3), 541(2019).
  33. Tie, F., et al. Kaempferol and kaempferide attenuate oleic acid-Induced lipid accumulation and oxidative stress in HepG2 cells. Int J Mol Sci. 22 (16), 8847(2021).
  34. Fang, K., et al. Diosgenin ameliorates palmitic acid-induced lipid accumulation via AMPK/ACC/CPT-1A and SREBP-1c/FAS signaling pathways in LO2 cells. BMC Complement Altern Med. 19 (1), 255(2019).
  35. Wu, X., et al. MLKL-dependent signaling regulates autophagic flux in a murine model of non-alcohol-associated fatty liver and steatohepatitis. J Hepatol. 73 (3), 616-627 (2020).
  36. Scavo, M. P., et al. The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway. Cell Death Dis. 14 (9), 635(2023).
  37. Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease. BMC Gastroenterol. 12, 20(2012).
  38. Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).

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