Articolo metodologico

Modellazione in vitro della deposizione di grasso nella malattia epatica steatosica associata a disfunzione metabolica

DOI:

10.3791/66810

⸱

19 luglio 2024

 ,  ,  ,  , 
1Inner Mongolia Medical University, 2Xilin Gol League Mongolian Medical Hospital, 3National and local Joint Mongolian Medicine R & D Engineering Center, 4Inner Mongolia Minzu University, 5Affiliated Hospital of Inner Mongolia Minzu University, 6Traditional Chinese & Mongolian Medical Research Institute of Inner Mongolia

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo descrive l'uso di cellule HepG2 indotte da acido oleico come modello per la malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prevalenza della malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD) è aumentata a causa dei cambiamenti nei modelli economici e di stile di vita, portando a significative sfide per la salute. Rapporti precedenti hanno studiato la creazione di modelli animali e cellulari per MASLD, evidenziando le differenze tra di loro. In questo studio, è stato creato un modello cellulare inducendo l'accumulo di grasso in MASLD. Le cellule HepG2 sono state stimolate con l'acido grasso insaturo acido oleico a varie concentrazioni (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) per emulare la MASLD. L'efficacia del modello è stata valutata utilizzando i saggi del kit di conteggio cellulare-8, la colorazione Oil Red O e l'analisi del contenuto lipidico. Questo studio mirava a creare un modello cellulare semplice da usare per le cellule MASLD. I risultati dei saggi del kit di conteggio delle cellule-8 hanno mostrato che la sopravvivenza delle cellule HepG2 dipendeva dalla concentrazione di acido oleico, con un GI50 di 1,875 mM. La vitalità cellulare nei gruppi 0,5 mM e 1 mM era significativamente inferiore rispetto a quella del gruppo di controllo (P < 0,05). Inoltre, la colorazione con olio rosso O e l'analisi del contenuto lipidico hanno esaminato la deposizione di grasso a concentrazioni variabili di acido oleico (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) su cellule HepG2. Il contenuto lipidico dei gruppi 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM era significativamente superiore a quello del gruppo di controllo (P < 0,05). Inoltre, i livelli di trigliceridi nei gruppi OA erano significativamente più alti di quelli nel gruppo di controllo (P < 0,05).

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD) comprende una serie di condizioni, tra cui la steatosi semplice, la steatoepatite non alcolica (NASH), la cirrosi e il carcinoma epatocellulare 1,2,3,4,5,6, tutti attribuiti a fattori diversi dal consumo di alcol7. La MASLD è la malattia epatica più diffusa causata da danno epatico metabolico, che colpisce quasi un quarto della popolazione globale 8,9,10,11,12. Sebbene la patogenesi precisa della MASLD non sia stata ancora chiarita, varie teorie tentano di spiegarne lo sviluppo. Una nozione prevalente suggerisce un allontanamento dalla classica teoria dei "due colpi" verso un modello "a colpi multipli"1. Al centro di queste ipotesi c'è il ruolo dell'insulino-resistenza, che si ritiene sia fondamentale nella patogenesi13 della MASLD. La ricerca indica che l'insulino-resistenza negli epatociti porta ad un aumento dei livelli di acidi grassi liberi, formando successivamente i trigliceridi immagazzinati nel fegato14,15.

I ricercatori hanno utilizzato modelli sia in vivo che in vitro per simulare la deposizione di grasso in MASLD; Tuttavia, replicare completamente il suo meccanismo patologico rimane una sfida. Nonostante questa limitazione, questi modelli sono stati determinanti nello studio di potenziali bersagli terapeutici per MASLD. Tuttavia, lo sviluppo di un modello stabile di MASLD è fondamentale. Sebbene i modelli animali siano efficaci, richiedono tempo e denaro, evidenziando così il crescente interesse per i modelli cellulari in vitro . Questi modelli utilizzano spesso acidi grassi liberi singoli o multipli come l'acido oleico (OA) e l'acido palmitico per ricreare la MASLD indotta dalla dieta. Tra queste, la linea cellulare di epatoblastoma umano HepG2 viene spesso utilizzata per stabilire modelli cellulari in vitro di MASLD.

L'induzione dell'OA stimola le cellule HepG2 a replicare la deposizione di grasso in modo simile alla MASLD, un metodo con una storia ben consolidata. Lo scopo di questo studio era dimostrare la vitalità, la colorazione Oil Red O (ORO), il contenuto lipidico e il livello di trigliceridi (TG) delle cellule HepG2 trattate con 0,25 mM di OA. L'obiettivo di questo esperimento è stato quello di fornire ulteriori prove per lo sviluppo di studi di modellazione MAFLD.

Protocollo

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NOTA: Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Coltura cellulare

  1. Colture di cellule HepG2 in fiasche di coltura contenenti Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (contenenti il 10% di siero fetale bovino [FBS], 100 unità/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina). Mantenere i matracci di coltura a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .

2. Effetto dell'acido oleico sulla vitalità cellulare misurato dal kit per il conteggio delle cellule-8

  1. Sciogliere un volume specifico di OA in dimetilsolfossido (DMSO) per ottenere una concentrazione di 200 mM. Conservare la soluzione a -20 °C per un uso futuro.
  2. Seminare le cellule HepG2 in una piastra a 96 pozzetti con una densità cellulare di 6 × 103 celle per pozzetto. Aggiungere 100 μl di DMEM a ciascun pozzetto. Incubare e coltivare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per 24 ore. Dividi le cellule HepG2 in due gruppi:
    1. Gruppo di controllo: aggiungere il terreno di coltura cellulare.
    2. Gruppo OA: aggiungere OA al terreno di coltura cellulare per ottenere concentrazioni finali di 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM.
  3. Dopo 24 ore di incubazione iniziale, scartare il surnatante da ciascun pozzetto e aggiungere OA secondo il raggruppamento specificato, aggiungendo 100 μl per pozzetto. Per il gruppo di controllo, aggiungere 100 μL di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto. Continuare a incubare le celle per altre 24 ore.
    NOTA: Assicurarsi che ogni gruppo abbia sei pozzetti di replica. Per evitare l'evaporazione, aggiungere 100 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) all'anello esterno dei pozzetti nella piastra a 96 pozzetti.
  4. Dopo 24 ore di incubazione, aggiungere 10 μL di kit per il conteggio delle cellule-8 (CCK-8) a ciascun pozzetto, mescolare delicatamente e incubare per 2 ore al buio. Estrarre la piastra a 96 pozzetti dall'incubatore, inserirla nel lettore di micropiastre e misurare il valore di assorbanza a 450 nm (A450). I valori di IG50 sono stati contati in base all'OD.

3. Colorazione con olio rosso O per osservare la formazione di goccioline lipidiche intracellulari

  1. Seminare le cellule HepG2 in piastre di coltura cellulare a 6 pozzetti a una densità di 5 × 105 cellule per pozzetto e coltivare le piastre in un incubatore a temperatura costante per 24 ore. Fare riferimento alla Figura 1 per una rappresentazione visiva dei passaggi descritti.
  2. Dopo 24 ore di coltura cellulare, aggiungere 2 mL di terreno di coltura cellulare contenente OA a ciascun pozzetto, ottenendo concentrazioni finali di 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM. Dopo altre 24 ore, rimuovere il terreno di coltura cellulare da ciascun pozzetto e lavare due volte con PBS. Aggiungere 1 mL di fissativo ORO a ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti.
  3. Preparare la soluzione colorante ORO mescolando la soluzione colorante A con la soluzione colorante B in un rapporto di 3:2. Lasciare riposare il composto a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi filtrarlo una volta attraverso un filtro da 0,45 μm. Conservare la soluzione filtrata in una provetta da centrifuga al riparo dalla luce fino al momento dell'uso.
  4. Scartare il fissativo e lavare due volte con acqua distillata. Aggiungere 1 mL di isopropanolo al 60% in ciascun pozzetto e incubare per 30 s. Scartare il 60% della soluzione di isopropanolo e aggiungere 1 mL di soluzione colorante ORO appena preparata a ciascun pozzetto prima di incubare per 20 minuti. Scartare la soluzione colorante ORO, aggiungere 1 mL di isopropanolo al 60% in ciascun pozzetto e incubare per 30 s. Lavare 5 volte con acqua per rimuovere la tintura in eccesso.
  5. Coprire le cellule con acqua distillata e osservare al microscopio. Una volta raccolte le immagini, scartare il liquido nella lastra e lasciarla asciugare. Quindi, aggiungere 2 mL di isopropanolo a ciascun pozzetto e agitare la piastra su uno shaker orbitale per 10 minuti. Trasferire il liquido in una nuova piastra da 96 pozzetti, con 16 pozzetti in ciascun gruppo, aggiungendo 100 μl per pozzetto. Calcolare il contenuto lipidico misurando la densità ottica (OD) di ciascun pozzetto utilizzando un lettore di micropiastre a 510 nm (A510).

4. Effetti di diverse concentrazioni di acido oleico sui trigliceridi totali nel surnatante cellulare HepG2

  1. Equilibrare il kit a temperatura ambiente per 20 minuti e preparare le piastre necessarie per l'esperimento.
  2. Raccogliere il surnatante cellulare e centrifugare a 1.570 × g per 10 minuti. Impostazione di pozzetti standard e test di pozzetti campione. Aggiungere 50 μL di concentrazione standard ([S0 → S5] seguita da: 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 mmol/L) ai pozzetti standard. Oltre ai pozzetti bianchi e standard, aggiungere 10 μl di campioni diversi ai pozzetti, quindi aggiungere 40 μl di diluente per campioni a ciascun pozzetto. Aggiungere 100 μl di anticorpo di rilevazione-perossidasi di rafano a ciascun pozzetto, sigillare con una membrana a piastra e incubare a 37 °C per 1 ora in un forno a temperatura costante.
  3. Scartare il surnatante, asciugare su carta priva di polvere e lavare ogni pozzetto con 1 soluzione di lavaggio. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 1 min. Ripetere il processo di lavaggio 5 volte.
  4. Aggiungere 50 μl di substrato A e 50 μl di substrato B a ciascun pozzetto. Mescolare delicatamente e incubare per 15 minuti a 37 °C. Aggiungere 50 μL di soluzione di terminazione a ciascun pozzetto e misurare il valore OD di ciascun pozzetto a 450 nm (A450) entro 15 minuti.
  5. Tracciare la concentrazione dello standard lungo l'asse x e il corrispondente valore di assorbanza (OD) lungo l'asse y per eseguire la regressione lineare e derivare l'equazione della curva per calcolare il valore di concentrazione di ciascun campione.

5. Analisi statistica

  1. Determinare differenze significative nei dati quantitativi.
  2. Calcola la media ± la deviazione standard (SD) e rappresenta graficamente i dati. Considera P < 0,05 come statisticamente significativo.

Risultati

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Effetto dell'acido oleico sulla vitalità cellulare
Le cellule HepG2 sono state esposte a concentrazioni variabili di OA (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), con conseguente diminuzione dei tassi di sopravvivenza cellulare a 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM e 1 mM rispetto a 0 mM. La significatività statistica è stata osservata a 0,5 mM (P < 0,05) e 1 mM (P < 0,05) rispetto a 0 mM. I risultati dell'impatto dell'OA sulla vitalità cellulare, valutati dal kit CCK-8, sono mostrati nella Figura 2. Il valore GI50 per le cellule HepG2 trattate con OA è stato calcolato come 1,875 mM.

Colorazione Oil Red O per osservare la formazione di goccioline lipidiche intracellulari
La colorazione ORO è un metodo comunemente usato per la visualizzazione dei lipidi16,17. Di conseguenza, la formazione di goccioline lipidiche nelle cellule HepG2 incubate con OA per 24 ore è stata osservata al microscopio dopo la colorazione ORO. Come mostrato nella Figura 3 e nella Figura 4, l'intensità della colorazione rossa nelle cellule trattate con OA era maggiore rispetto alle cellule non trattate. Le goccioline lipidiche rosse erano presenti nel plasma delle cellule HepG2 dopo il trattamento con OA, con quantità di goccioline lipidiche e lipidi che aumentavano con l'aumentare delle concentrazioni di OA (Figura 5).

Effetti di diverse concentrazioni di acido oleico sui trigliceridi totali nel surnatante delle cellule HepG2
I risultati sperimentali, come illustrato nella Figura 6, hanno rivelato che, rispetto al gruppo di controllo, il trattamento di cellule HepG2 con concentrazioni variabili di OA (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) ha determinato un aumento significativo del contenuto di TG del surnatante cellulare nel gruppo OA (P < 0,05).

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Figura 1: Diagramma di flusso per la colorazione Oil Red O. Abbreviazioni: OA = acido oleico; OD = densità ottica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Effetto dell'acido oleico sulla vitalità cellulare, valutato utilizzando un saggio di conteggio delle cellule kit-8. Ogni barra rappresenta la media ± SD (n = 6). *P < 0,05. Abbreviazione: OA = acido oleico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Immagini di colorazione Oil Red O di più punti temporali (direzioni a ore 3, 6, 9 e 12). La formazione di goccioline lipidiche è stata rilevata utilizzando un microscopio invertito per colture cellulari con ingrandimento 40x. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Effetto dell'acido oleico sulle goccioline lipidiche nelle cellule, valutato attraverso la colorazione Oil Red O. La formazione di goccioline lipidiche è stata rilevata utilizzando un microscopio invertito per colture cellulari con ingrandimento 40x. Barra di scala = 250 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Effetto dell'acido oleico sul contenuto lipidico nelle cellule, valutato dal valore della densità ottica. Le variazioni relative delle pieghe sono presentate nei valori della densità ottica in diversi gruppi. Ogni colonna rappresenta la media ± SD (n = 16). *P < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 6: Effetti di varie concentrazioni di acido oleico sui livelli totali di trigliceridi nel surnatante delle cellule HepG2. Le variazioni relative delle pieghe sono presentate nel valore dei livelli di trigliceridi in diversi gruppi. Ogni colonna rappresenta la media ± SD (n = 3). *P < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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La MASLD è una sindrome clinicopatologica caratterizzata da un'eccessiva deposizione di grasso intracellulare negli epatociti dovuta a fattori diversi dall'alcol e da altri agenti dannosi per il fegato18. La MASLD è strettamente legata al danno epatico da stress metabolico acquisito, in particolare associato all'insulino-resistenza e alla suscettibilità genetica. Per studiare e selezionare efficacemente i farmaci per la MASLD, è fondamentale selezionare un modello sperimentale appropriato. La creazione di un modello cellulare è particolarmente importante nella ricerca MASLD, in quanto facilita una comprensione più profonda dei meccanismi patologici e la valutazione degli effetti di nuovi farmaci.

Questo protocollo descrive un modello in vitro di MASLD stabilito attraverso cellule HepG2 indotte da OA. La colorazione ORO e l'analisi del contenuto lipidico sono metodi critici per la creazione di questo modello. Inoltre, la valutazione della vitalità cellulare e del contenuto totale di TG nei surnatanti cellulari è essenziale per valutare la concentrazione appropriata di OA. Il criterio diagnostico per la MASLD prevede la presenza di oltre il 5% di TG immagazzinato nelle cellule epatiche19,20. I modelli cellulari MASLD si basano principalmente sulle cellule HepG2 21,22,23,24,25,26,27,28, note per il loro utilizzo di successo nella costruzione di modelli di degenerazione del fegato grasso in vari studi nazionali e internazionali. Nonostante abbiano origine da cellule di epatoma, le cellule HepG2 condividono molte caratteristiche fenotipiche con gli epatociti e sono facilmente coltivabili e propagate 29,30. Test come il kit CCK-8, la colorazione ORO, il contenuto lipidico e le misurazioni della TG totale offrono approcci semplici, oggettivi e ragionevoli per valutare la vitalità cellulare, l'accumulo di grasso e il contenuto lipidico nei soggetti dello studio. In questo contesto, l'OA si allinea con la patogenesi della MASLD31, in cui l'energia in eccesso viene immagazzinata sotto forma di lipidi quando l'assunzione di energia supera il consumo.

I ricercatori hanno utilizzato OA 23,28,31,32,33, acido palmitico34,35 e combinazioni di acido oleico/palmitico26,36 per replicare il modello MASLD. Sia l'acido palmitico che l'OA contribuiscono alla degenerazione grassa del fegato e all'accumulo di TG. L'acido palmitico, l'acido grasso saturo più abbondante nel corpo umano, mostra una lipotossicità significativa, che porta all'accumulo di lipidi negli epatociti, all'aumento dei radicali reattivi intracellulari dell'ossigeno e alla morte cellulare o necrosi37. Al contrario, l'OA porta a una deposizione intracellulare di TG più pronunciata (Figura 6) e a una minore modulazione cellulare38. Pertanto, i ricercatori utilizzano spesso cellule HepG2 indotte da OA per stabilire modelli MASLD in vitro. Come descritto nel passaggio 2.2.2 del protocollo, è fondamentale riscaldare la soluzione OA quando la si aggiunge. In questo studio, la colorazione ORO e l'analisi del contenuto lipidico si sono basate sulla deposizione lipidica di cellule HepG2, supportando efficacemente l'esplorazione di modelli in vitro di MASLD con meccanismi complessi e riducendo i tempi e i costi necessari per la ricerca.

ORO si lega facilmente a TG a forma di gocciolina, producendo una colorazione da arancione a rossa indicativa di grasso, con intensità del colore che dipende dalla concentrazione lipidica. Tuttavia, la soluzione colorante ORO è instabile e soggetta a precipitazioni, il che la rende inadatta per la preparazione anticipata. Pertanto, la soluzione colorante ORO è stata preparata dopo la fase 3.2 del protocollo, con precauzioni prese per evitare l'esposizione alla luce durante la preparazione e l'incubazione (fasi 3.2, 3.3 del protocollo). Nella fase 3.5 del protocollo, la selezione di immagini in più punti temporali (direzioni a ore 3, 6, 9 e 12) rappresenta una modifica chiave dell'esperimento che è essenziale per migliorare l'accuratezza dei risultati. Sebbene elevate concentrazioni di OA influenzino la sopravvivenza cellulare, rappresentando quindi un limite di questo metodo, è stato dimostrato che un'appropriata concentrazione di OA garantisce la vitalità cellulare.

Questo studio ha impiegato un approccio completo, utilizzando un kit CCK-8, la colorazione ORO, l'analisi del contenuto lipidico e la misurazione della TG totale per stabilire e convalidare il modello di MASLD. Il kit CCK-8 è stato utilizzato per valutare l'effetto dei farmaci sulla vitalità cellulare, fungendo da fase di convalida cruciale. In futuro, questo modello è promettente per lo screening dei farmaci e la ricerca sui meccanismi volti a comprendere la patogenesi della MASLD e a identificare potenziali bersagli terapeutici. Per garantire ulteriormente la qualità o l'affidabilità della validazione, i livelli di espressione delle proteine bersaglio implicate nel modello saranno analizzati utilizzando il western blotting e analisi quantitative della reazione a catena della polimerasi.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Il presente studio è stato finanziato da "Studio sulle questioni chiave dell'effetto curativo di Koumiss sulle malattie regionali della medicina mongola" nel 2018 Progetto supportato del programma scientifico e tecnologico del Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Regione Autonoma della Mongolia Interna.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 µ m filtroMillex
0,25% Tripsina-EDTA (1x) Tripsina-EDTAGibco25200-056
0,45 µ m filterMillex
2 mL Fiale crigenicheCORNING430659
25 cm2 Pallone per colture cellulariCORNING430639
6 pozzetti Piastra per colture cellulariCORNING3516
Piastra per colture cellulari a 96 pozzettiCORNING3599
Piastra per emocromoShanghai Jing Jing Reagente biochimico e Strumento Co.
Kit di conteggio delle cellule-8 saggiPechino Solarbio Science & Tecnologia Co., Ltd.CA1210-1000T
CO2 incubatoreNUAIRENU-5710E
  DMSO Dimetil solfossido Pechino Solarbio Scienza & Tecnologia Co., Ltd.D8371
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco8122691
Enzyme Labeling EquipmentTecanSpark
Fetal Bovine Serum,qualificata Gibco10099141
HepG2North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)221031
ELISA di trigliceridi umani (TG) istruzioniNanjing Jiacheng Bioengineering Institute20170301
Microscopio invertito per colture cellulariLeicaDMi1 
IsopropanoloTianjin Zhiyuan Reagente Chimico Co.
2021030141 Kit Macchia Rossa Olio, Per Cellule Coltivate PechinoSolarbio Scienza & Tecnologia Co., Ltd.G1262
Acido oleico Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Penicillina StreptomicinaGibco15140122
SPSS 24.0Software di statistica
02270113 linea cellulare Beijing A502071

Riferimenti

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