Modellazione avanzata dell'aneurisma dell'aorta addominale nei topi mediante combinazione di elastasi topica e ß-aminopropionitrile orale

Sommario

Questo protocollo descrive un approccio chirurgico metodico per modellare gli aneurismi dell'aorta addominale avanzata nei topi mediante una combinazione di applicazione diretta di elastasi all'aorta infrarenale e somministrazione di ß-aminopropionitrile attraverso l'acqua potabile.

Abstract

Il modello murino topico di elastasi dell'aneurisma dell'aorta addominale (AAA) è potenziato se combinato con acqua potabile integrata con ß-aminopropionitrile (BAPN) per produrre in modo affidabile veri aneurismi infrarenali con comportamenti che imitano gli AAA umani. L'applicazione topica di elastasi all'avventizia dell'aorta infrarenale provoca un danno strutturale agli strati elastici della parete aortica e avvia la dilatazione aneurismatica. La co-somministrazione di BAPN, un inibitore della lisil ossidasi, promuove la degenerazione prolungata della parete riducendo la reticolazione di collagene ed elastina. Questa combinazione si traduce in grandi AAA che si espandono progressivamente, formano trombi intraluminali e sono in grado di rompersi. Il perfezionamento delle tecniche chirurgiche, come l'isolamento circonferenziale dell'intero segmento aortico infrarenale, può aiutare a standardizzare la procedura per un'applicazione coerente e completa dell'elastasi pancreatica suina nonostante i diversi operatori e le variazioni anatomiche tra i topi. Pertanto, il modello elastasi/BAPN è un approccio raffinato per indurre chirurgicamente l'AAA nei topi, che può ricapitolare meglio gli aneurismi umani e fornire ulteriori opportunità per studiare la crescita dell'aneurisma e il rischio di rottura.

Introduzione

Un aneurisma è definito come una dilatazione patologica di un vaso sanguigno superiore al 50% del diametro del vaso sano¹. Nonostante gli aneurismi dell'aorta addominale (AAA) siano una condizione comunemente riscontrata nella popolazione anziana, con un'incidenza di circa il >5% dei maschi > i 65 anni di età, non esistono strategie terapeutiche dirette per il trattamento dell'AAA¹. L'attuale trattamento dell'AAA è limitato alla riduzione dei fattori di rischio e alla riparazione chirurgica con chirurgia a cielo aperto o endovascolare in base al diametro aortico o al tasso di crescita². Il pericolo maggiore di AAA è la rottura di un aneurisma, che è fatale se non trattata, e la riparazione in questo contesto emergente può comportare rischi di mortalità fino al 90%¹.

La fisiopatologia dell'AAA è complicata, multifattoriale e non completamente compresa³. Le caratteristiche dell'AAA umano includono la vera dilatazione aneurismatica della parete aortica con un'infiltrazione di cellule infiammatorie, la presenza di trombi intraluminali e la dilatazione progressiva che porta alla rottura finale ^3,4. Inoltre, gli AAA sono associati all'età avanzata, hanno una predominanza sessuale maschio/femmina di 9:1 e si verificano più comunemente nell'aorta infrarenale⁵. Modellare tutte le caratteristiche e i comportamenti degli AAA umani negli animali rimane una sfida continua⁶.

L'attuale modellazione dell'AAA è condotta principalmente nei topi e gli aneurismi sono comunemente indotti utilizzando uno dei tre metodi: mediante infusione di angiotensina II (AngII) tramite una pompa osmotica impiantata per via sottocutanea e mediante applicazione diretta di cloruro di calcio (CaCl₂) o elastasi all'aorta⁷. In quest'ultimo metodo, l'elastasi pancreatica suina (PPE) viene applicata a un segmento dell'aorta infrarenale e provoca la degradazione enzimatica delle fibre di elastina all'interno della lamella elastica della tunica media. Questo danno strutturale provoca l'indebolimento della parete aortica e la dilatazione aneurismatica verso l'esterno. L'uso della sola elastasi topica, tuttavia, produce aneurismi infrarenali relativamente piccoli, che non riescono ad allargarsi o rompersi progressivamente nel tempo. Più recentemente, Lu et al. hanno migliorato questo modello somministrando inoltre β-aminopropionitrile (BAPN), un inibitore irreversibile della lisil ossidasi, ai loro topi trattati con elastasi⁸. Impedendo la reticolazione delle fibre di elastina e collagene, l'integrazione di BAPN provoca la progressiva dilatazione delle aorte danneggiate dall'elastasi fino al punto di rottura. Il modello elastasi/BAPN ha inoltre un tasso di incidenza più elevato di AAA rispetto al modello di elastasi topica e gli aneurismi prodotti sono anche più grandi e contengono trombo intraluminale⁸.

Nel modello elastasi/BAPN, il grado di dissezione chirurgica e l'esposizione dell'aorta all'elastasi possono influire sul successo e sulla replicabilità di questo modello. In questo manoscritto, descriviamo che la co-somministrazione di acqua potabile BAPN e l'applicazione topica di elastasi all'aorta dopo l'isolamento circonferenziale dell'intero segmento aortico infrarenale migliora la replicabilità, tiene conto delle differenze anatomiche tra gli animali e si traduce in un maggiore tasso di induzione di AAA, dimensioni dell'aneurisma e incidenza di rotture. In questo articolo, descriveremo un approccio standardizzato per indurre in modo affidabile aneurismi dell'aorta addominale avanzata nei topi utilizzando una combinazione di acqua integrata con elastasi topica e BAPN.

Protocollo

I protocolli per gli animali sono approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (M005792) dell'Università del Wisconsin-Madison.

1. Mantenimento degli animali

1. Alleva i topi con il cibo di manutenzione standard. Usa topi adulti o topi giovani adulti (8-12 settimane).
   NOTA: L'utilizzo di adulti garantisce che gli animali abbiano raggiunto la piena maturità e limita qualsiasi possibilità che i cambiamenti nel diametro aortico possano essere correlati alla crescita degli animali. Per questo studio, abbiamo utilizzato topi C57BL/6J maschi e femmine di età compresa tra 22 e 24 settimane al momento dell'intervento chirurgico. Lu e colleghi non hanno osservato differenze significative nella risposta aneurismatica tra topi più giovani e più anziani⁸. Inoltre, mentre la maggior parte della modellazione dell'aneurisma viene eseguita nei topi maschi, questo modello induce con successo AAA sia nei topi maschi che nelle femmine⁹.
2. Determinare la durata dello studio e assegnare gli animali ai gruppi di trattamento o sham (controllo). Somministrare acqua potabile BAPN allo 0,2% ai topi del gruppo di trattamento e sottoporli a intervento chirurgico con applicazione topica di elastasi attiva all'aorta infrarenale. Somministrare acqua non trattata per controllare gli animali e sottoporli a intervento chirurgico con l'applicazione di elastasi denaturata all'aorta infrarenale.

2. Inizio dell'assunzione di acqua potabile integrata con B-aminopropionitrile (BAPN)

1. Due giorni prima dell'intervento, iniziare il trattamento con i topi con acqua potabile BAPN allo 0,2%. Preparare l'acqua BAPN in volumi maggiori e conservarla al buio a 4 °C per un massimo di 28 giorni. Assicurati che l'acqua BAPN raggiunga la temperatura ambiente prima di darla ai topi.
   NOTA: Si consiglia di sostituire l'acqua BAPN nelle gabbie ogni 7 giorni per tutta la durata dello studio.

3. Giorno dell'intervento preparazione del materiale

1. Tagliare i guanti chirurgici in strisce di 5 mm x 10 mm, che verranno utilizzate in seguito per isolare l'aorta prima del trattamento con elastasi. Preparare un telo chirurgico tagliando un ovale di ~ 1,5 cm x 3 cm al centro di un telo chirurgico. Aprire il 2 in x 2 in una garza e tagliarlo a metà per creare strisce di garza di circa 2,5 cm x 10 cm da utilizzare successivamente per la retrazione del contenuto addominale. Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici (vedi Tabella dei Materiali) e allestire un campo chirurgico sterile come mostrato nell'esempio in Figura 1.

Figura 1: Esempio di intervento chirurgico sterile in preparazione del modello murino di AAA con elastasi/BAPN. Abbreviazioni: BAPN = ß-amminopropionitrile; AAA = aneurisma dell'aorta addominale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Preparare una gabbia di recupero postoperatoria posizionando una gabbia pulita sotto una lampada riscaldante e posizionare la soluzione salina vicino alla lampada per riscaldarla alla temperatura corporea (37 °C). Assicurarsi che la lampada termica sia posizionata in modo sicuro in modo che la gabbia di recupero e la soluzione salina siano calde ma non superiori a 37 °C. Accendere la pompa dell'acqua per iniziare a far circolare l'acqua calda attraverso il termoforo.

4. Preparazione degli animali per l'intervento chirurgico

1. Metti i topi in una camera di induzione e anestetizzali con isoflurano al 5% a 200 mL/min utilizzando un vaporizzatore elettronico a basso flusso. Durante l'anestetismo, pesare ciascun topo e somministrare 0,6 mg/kg di buprenorfina ER e 20 mg/kg di carprofene per via sottocutanea per l'analgesia. Usa tagliacapelli elettrici per tagliare il pelo sull'addome, dal basso addome al inferiore del processo xifoideo. Usa una garza o una salvietta da laboratorio per spazzolare via i peli in eccesso. Rimetti i topi nella loro gabbia e attendi almeno 20 minuti affinché l'analgesia abbia effetto prima di procedere con l'intervento chirurgico.
2. Dopo almeno 20 minuti dalla somministrazione dell'analgesia, posizionare il topo in una camera di induzione dell'anestesia e somministrare nuovamente isoflurano al 5% a 200 ml/min utilizzando un vaporizzatore elettronico a basso flusso fino a quando il topo non viene sedato.
3. Rimuovere il topo sedato dalla camera di induzione e posizionarlo supino sul campo chirurgico. Applicare il gel oculare e fissare il cono nasale con nastro chirurgico. Ridurre l'isoflurano per via inalatoria erogato a un tasso di mantenimento dell'1-2% a 50 ml/min. Fissare le zampe anteriori e posteriori del topo con del nastro chirurgico.
4. Esamina il basso addome del topo per la vescica. Applicare delicatamente una pressione esterna sulla vescica tra il pollice, l'indice e il medio per indurre lo svuotamento; Nel frattempo, usa un pezzo di garza per allontanare l'urina.
   NOTA: Fare attenzione a non contaminare il campo operatorio.
5. Inizia a disinfettare l'addome applicando uno scrub a base di iodio o clorexidina e alcol al 70% con tamponi di cotone. Inizia dal centro dell'addome e lavora verso l'esterno con un movimento circolare 3 volte. Lasciare asciugare brevemente l'area tra un'applicazione e l'altra.
6. Verificare la mancanza di una risposta di pizzicamento delle dita dei piedi per assicurarsi che l'anestesia sia adeguata. Assicurarsi che il cono e gli arti siano fissati. Posizionare un telo chirurgico sul topo, con l'apertura direttamente sopra l'addome preparato chirurgicamente.
   NOTA: Non trascinare il telo sul mouse per evitare potenziali contaminazioni.

5. Induzione chirurgica di AAA

1. Entrare nella cavità addominale:
   1. Lavarsi le mani e indossare guanti chirurgici sterili o in nitrile puliti. Prima di entrare in contatto con il campo operatorio, spruzzare sempre i guanti con il 70% di EtOH e strofinare le mani guantate fino a quando non si asciugano.
   2. Usa una pinza smussata per tendere la pelle nell'addome della linea mediana. Usa le forbici chirurgiche per fare una piccola incisione nella pelle, quindi estendi l'incisione longitudinalmente, circa 2-3 cm di lunghezza.
   3. Usa una pinza per sollevare i muscoli retti per identificare la linea alba traslucida. Con le forbici si entra nella cavità addominale attraverso la linea alba, quindi si estende lungo la linea alba prossimalmente e distalmente.
2. Esposizione dell'aorta addominale:
   1. Inumidire una striscia di garza e due tamponi di cotone con soluzione fisiologica riscaldata. Crea un rotolo addominale arrotolando strettamente un'estremità della garza a metà, lasciando una coda generosa.
   2. Utilizzare un divaricatore cutaneo per ritrarre la parete addominale destra.
   3. Utilizzando tamponi di cotone inumiditi, eseguire una rotazione viscerale mediale destra spazzando delicatamente l'intestino tenue e crasso fino al quadrante superiore sinistro e visualizzare l'aorta e la vena cava inferiore (IVC). Usa un rullo addominale per ritrarre l'intestino fuori dalla vista: infila l'estremità arrotolata della garza sotto l'intestino, quindi porta l'estremità della coda intorno e fuori dal corpo per fasciare delicatamente l'intestino. Applicare una leggera tensione sulla coda della garza per tenere l'intestino fuori dal campo visivo. Regolare il rullo addominale e il divaricatore cutaneo per ottenere una visione ottimale degli organi retroperitoneali, come mostrato nella Figura 2A.
      NOTA: Il rullo addominale aiuta a mantenere umido l'intestino e a proteggerlo dai danni involontari degli strumenti chirurgici. Assicurati che la garza rimanga umida durante la procedura per evitare che l'intestino si secchi. Fare attenzione a non ritrarre con forza l'intestino in quanto ciò può causare l'attorcigliamento dell'arteria mesenterica superiore e della vascolarizzazione intestinale, che può potenzialmente causare danni ischemici. Inoltre, quando si spazza inizialmente l'intestino tenue, prestare attenzione a un sottile attacco traslucido tra l'intestino crasso e il fegato inferiore (legamento epatocolico), che se non si fa attenzione, può facilmente strappare la capsula epatica e causare sanguinamento. Se c'è tensione su questo legamento durante la retrazione, dividerlo bruscamente con le forbici.

Figura 2: Rappresentazione della retrazione addominale e la vista chirurgica ottimale per l'esposizione dell'aorta infrarenale del topo. (A) Il posizionamento di una garza addominale aiuta a ritrarre gli organi intraaddominali, mentre un divaricatore opposto aiuta a fornire la visualizzazione del retroperitoneo. Un telo chirurgico sterile (trasparente per mostrare l'orientamento dell'animale) viene posizionato sopra l'animale anestetizzato per aiutare a mantenere la sterilità. (B) La fascia retroperitoneale (riquadro verde) sovrasta anteriormente l'aorta. (C) Esempio dell'aorta infrarenale a seguito della dissezione della fascia retroperitoneale. L'isolamento dell'aorta dall'IVC può essere ottenuto iniziando da uno spazio potenziale tra l'aorta e l'IVC situato appena distalmente alla vena renale sinistra mentre si incrocia anteriormente (cerchio giallo). Abbreviazione: IVC = vena cava inferiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Dissezione circonferenziale e isolamento dell'aorta infrarenale:
   1. Verificare che l'IVC e l'aorta infrarenale siano in piena vista. Iniziare a esporre l'aorta entrando e dividendo prima la fascia retroperitoneale (RP) (Figura 2B). Identificare le arterie gonadiche (testicolari o ovariche) che corrono parallele lungo l'aorta infrarenale anteriore (Figura 2B e Figura 3). Usa una pinza per dividere bruscamente la fascia tra le arterie gonadiche e continua longitudinalmente per esporre l'aorta anteriormente (Figura 2C).
      NOTA: La fascia RP è uno strato sottile e traslucido di tessuto connettivo che contiene linfatici e il plesso splancnico. È necessario sezionare attraverso la fascia RP per esporre l'aorta. Tuttavia, non sezionare attraverso il tessuto connettivo dell'avventizia aortica. Una lacerazione nell'avventizia (tessuto connettivo bianco) esporrà il mezzo (appare rosso vivo) e l'aorta probabilmente si romperà in questo sito una volta applicata l'elastasi.
   2. Quindi, inizia a isolare l'aorta addominale dall'IVC. Iniziare questa dissezione in un piccolo spazio tra l'IVC e l'aorta, situato appena sotto il bordo inferiore della vena renale sinistra mentre attraversa l'aorta (Figura 2C). Usa le punte delle pinze per allargare delicatamente le fibre del tessuto connettivo tra l'aorta e l'IVC e continua a lavorare circonferenzialmente attorno all'aorta a questo livello.
      NOTA: L'IVC ha una parete molto sottile e aderisce strettamente all'aorta da un sottile strato di tessuto connettivo fibroso. Fare attenzione a evitare di maneggiare l'IVC o di pulirlo il più possibile. Sezionare prima il lato destro dell'aorta dall'IVC (prima di sezionare il lato sinistro dell'aorta dalla muscolatura circostante) aiuterà l'aorta a "staccarsi" dall'IVC.
   3. Continuare a sezionare senza mezzi termini il piano tra l'aorta e l'IVC, lavorando caudalmente verso la biforcazione aortica. Interrompere l'ulteriore dissezione distale una volta raggiunta la biforcazione aortica.
      NOTA: Prendere ulteriori precauzioni durante la dissezione intorno all'arteria mesenterica inferiore (IMA), che si trova tipicamente vicino alla sezione centrale dell'aorta infrarenale e viaggia lateralmente attraverso l'IVC.
   4. Una volta che il bordo destro dell'aorta è separato dall'IVC, tornare prossimalmente al livello della vena renale sinistra. Sezionare la fascia RP dal bordo laterale sinistro dell'aorta, lavorando circonferenzialmente fino a quando l'aorta non è completamente isolata. Vedere la Figura 3 per l'anatomia pertinente della dissezione retroperitoneale.
      NOTA: Fare attenzione a sezionare dietro l'aorta poiché vi è un'elevata variabilità nella posizione e nel numero di vene e arterie lombari. Vedere la Figura 4 per il riferimento delle aree ad alto rischio di sanguinamento con questa dissezione.
   5. Ispezionare attentamente che l'aorta sia isolata circonferenzialmente dall'IVC e dalla muscolatura circostante il più possibile, con un'attenta dissezione attorno ai segmenti aortici legati dall'IMA e dalle arterie lombari.
   6. Posizionare una striscia di guanto lungo i bordi destro e sinistro dell'aorta, come mostrato nella Figura 5A. Cerca di coprire il più possibile l'IVC.
   7. Utilizza i calibri portatili per misurare il diametro aortico più ampio e registrare tre misurazioni. Spruzzare le punte dei calibri con il 70% di EtOH prima e dopo le misurazioni. Evitare di toccare direttamente l'aorta con le punte della pinza per evitare contaminazioni.
      NOTA: È possibile utilizzare anche foto con un microscopio calibrato compatibile con la fotocamera.

Figura 3: Anatomia dell'afflusso di sangue al basso addome, al bacino e al retroperitoneo del topo. Abbreviazioni: R = destra; L = sinistra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Siti ad alto rischio di lesioni ed emorragie durante la dissezione retroperitoneale e l'isolamento circonferenziale dell'aorta infrarenale. Abbreviazioni: L = sinistra; IMA = arteria mesenterica inferiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Risposte intraoperatorie all'applicazione di elastasi o sham durante il modello AAA murino elastasi/BAPN. (A) Segmenti di guanto vengono posizionati lungo la lunghezza dell'aorta prima dell'applicazione dell'elastasi per aiutare a proteggere l'IVC e l'intestino dall'esposizione all'elastasi, mantenendo l'aorta imbevuta di elastasi (B) L'applicazione di elastasi denaturata non provoca la dilatazione dell'aorta (blue box). Il diametro aortico massimo misurava 0,627 mm al basale, quindi 0,607 mm dopo 5 minuti di elastasi denaturata topica. (C) L'applicazione di elastasi provoca la dilatazione aortica dopo 5 minuti di trattamento. In questo esempio, l'aorta (verde) si è dilatata a 0,953 mm da 0,607 mm, con un aumento del diametro del 57%. Abbreviazioni: BAPN = ß-amminopropionitrile; AAA = aneurisma dell'aorta addominale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Applicazione dell'elastasi:
   1. Usa un tampone di cotone per tamponare il sangue o il liquido in eccesso dall'aorta.
   2. Quindi, posiziona un pezzo di garza asciutta di 10 mm x 2 mm sopra l'aorta. Utilizzare una pipetta per erogare 5 μL di elastasi (o controllare l'elastasi denaturata) per saturare la garza e l'aorta. Piegare delicatamente i pezzi del guanto attorno all'aorta.
      NOTA: Per preparare l'elastasi denaturata per l'uso in gruppi fittizi o di controllo, far bollire l'elastasi a 100 °C per 30 minuti.
   3. Attendere 5 minuti affinché l'elastasi agisca sull'aorta. Durante questo periodo di incubazione, se necessario, rilasciare parte della tensione posta dal rullo addominale e dal divaricatore cutaneo.
      NOTA: A causa dell'effetto batch con l'elastasi, incoraggiamo i ricercatori a utilizzare lo stesso flacone di elastasi per tutti gli esperimenti all'interno di un determinato studio. Con ogni nuovo flacone di elastasi, si consiglia di eseguire una dose-risposta per assicurarsi che non vi sia un numero eccessivo di rotture precoci (prima delle 4 settimane). La durata dell'applicazione dell'elastasi può anche essere regolata tra 4 e 6 minuti a seconda della risposta all'elastasi.
   4. Dopo 5 minuti, ripristinare la retrazione intestinale e aprire i pezzi del guanto. Irrigare la cavità addominale con 1 mL di soluzione fisiologica calda sterile allo 0,9%, rimuovendo con cura la garza e i pezzi di guanto dall'aorta. Assorbire la soluzione salina nell'addome con una garza di 10 cm x 10 cm. Ripetere l'irrigazione dell'addome per un totale di 3 x 3 ml.
   5. Utilizzare calibri portatili per rimisurare il diametro aortico più ampio dopo l'applicazione dell'elastasi e registrare 3 volte. Vedere la Figura 5B, C per esempi della dilatazione aortica al trattamento con sham ed elastasi attiva.
      NOTA: Le medie delle tre misurazioni pre e post elastasi possono essere utilizzate per calcolare la variazione percentuale del diametro aortico con il trattamento. In genere, c'è una notevole dilatazione ~30-50% subito dopo il trattamento con elastasi, che può aiutare a garantire che l'elastasi sia funzionale e che l'aorta sia stata adeguatamente trattata. Il diametro dell'aorta non deve cambiare con l'applicazione di elastasi denaturata o può essere leggermente più piccolo (probabilmente a causa dello spasmo).
5. Chiusura della cavità addominale:
   1. Rimuovere con cautela il rotolo addominale da sotto l'intestino e fuori dal corpo. Se necessario, applicare ulteriore soluzione salina sull'intestino per evitare che si attacchi al rullo addominale durante la rimozione. Controlla che l'intestino appaia rosa e adeguatamente perfuso.
      NOTA: Non è necessario cercare di riposizionare l'intestino nella sua posizione originale; Tentare di farlo può rischiare la torsione dell'intestino o ernie interne.
   2. Riapprossimare la fascia addominale utilizzando una sutura monofilamento non assorbibile 5-0 in esecuzione. Chiudere la pelle con 3-4 graffette per la pelle.

6. Cura degli animali postoperatoria

1. Posiziona il mouse nella gabbia di recupero con una lampada termica. Assicurarsi che la temperatura della gabbia sia calda, non calda.
2. Somministrare un bolo di liquido sottocutaneo da 0,5-1 mL di soluzione fisiologica normale allo 0,9%.
3. Lasciare che il topo si riprenda da solo nella gabbia riscaldata per ~20 minuti fino a quando non è attivo come da protocollo istituzionale, quindi tornare in una gabbia di stabulazione.
4. Secondo il protocollo istituzionale, somministrare carprofene 20 mg/kg 24 ore dopo l'intervento chirurgico il giorno 1 postoperatorio e continuare quotidianamente per 3 giorni.

7. Misurazione aortica e prelievo di tessuto

1. Dopo l'eutanasia con isoflurano e lussazione cervicale, riaprire la cavità addominale. Estendere l'incisione attraverso lo sterno per accedere al torace. Asportare gli atri destri e perfondere il ventricolo sinistro con 10 mL di soluzione fredda di DPBS all'1% in 2 minuti. Resecare i polmoni, il fegato e la milza.
   NOTA: Fare attenzione a non ferire l'intestino; La fuoriuscita di contenuto enterico può influire sull'analisi dei tessuti.
2. Esporre l'aorta addominale e misurare il diametro massimo dell'aorta infrarenale, come descritto sopra. Continuare a sezionare l'intera aorta e il cuore. Una volta isolati il cuore e l'aorta, tagliare tutti i rami arteriosi e le arterie iliache comuni lasciando intatti i segmenti corti sull'aorta. Posiziona il cuore e l'aorta su uno sfondo contrastato accanto a un righello e un'immagine.

8. Analisi dei dati e reportistica

1. Per tenere conto dell'errore umano, misurare i diametri aortici almeno 3 volte ciascuno quando si utilizzano calibri portatili, quindi riportare il diametro come valore medio.
2. Definisci AAA come un aumento del 50% del diametro dell'aorta sana. Assicurati di includere sia i diametri aortici lordi che la variazione percentuale del diametro nei risultati dello studio.

Risultati

In questo studio sono stati utilizzati topi C57BL/6J maschi e femmine di età compresa tra 22 e 24 settimane. Le aorte infrarenali sono state trattate con 5 μL di enzima elastasi (6,9 mg di proteine/mL, 6 unità/mg di proteine) o elastasi denaturata per 5 minuti. I topi maschi trattati con elastasi hanno dimostrato un aumento del 43,4% del diametro aortico dopo 5 minuti di esposizione all'elastasi rispetto ai diametri aortici basali non trattati, mentre le aorte femminili trattate sono aumentate del 33,6% (P = 0,0342). I diametri aortici delle simore non hanno mostrato variazioni relativamente nulle nell'arco di 5 minuti di esposizione all'elastasi denaturata (maschi 0,5%; femmine -2,8%). Non ci sono stati decessi correlati chirurgicamente tra i 12 topi trattati e i 6 topi fittizi. I dati per lo studio di 28 giorni sono dimostrati nella Tabella 1. Delle femmine di topo trattate, 3 su 6 sono morte per rottura dell'AAA; uno il giorno 20 postoperatorio e due il giorno 25 (Figura 6). Non ci sono state rotture AAA tra i maschi trattati. Gli AAA (definiti come un aumento >50% del diametro dell'aorta basale o la morte per rottura dell'AAA) sono stati indotti con successo in tutti i topi trattati (12 su 12). A 28 giorni, il diametro medio AAA dei maschi trattati era di 2,86 ± 0,31 mm, con una variazione percentuale media di 257 ± 54%, mentre i diametri AAA delle femmine sopravvissute di topi trattati erano 3,60 ± 1,87 mm, con una variazione percentuale media di 417 ± 286% (Figura 7). I topi fittizi non hanno mostrato relativamente alcun cambiamento nei diametri aortici.

Figura 6: Sopravvivenza di topi B6 maschi e femmine durante un modello di AAA con elastasi/BAPN di 28 giorni. (A) La rottura dell'AAA si è verificata in 3 dei 6 topi femmina trattati (un topo a 20 giorni, poi due topi a 25 giorni) mentre non ci sono state rotture tra i 6 topi maschi trattati a 28 giorni. (B) Immagini rappresentative all'autopsia di una femmina di topo morta per rottura di AAA. La rottura dell'AAA è dimostrata da un grande ematoma retroperitoneale (a sinistra) e dalla presenza di un AAA infrarenale con un difetto di parete (a destra). Abbreviazioni: BAPN = ß-amminopropionitrile; AAA = aneurisma dell'aorta addominale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Diametri aortici massimi di elastasi/BAPN e topi B6 maschi e femmine fittizi a 28 giorni. (A) I topi trattati mostrano diametri infrarenali significativamente più grandi a 28 giorni rispetto agli sham. (B) La combinazione di elastasi e BAPN produce con successo grandi AAA infrarenali sia nei topi B6 maschi che in quelli femmine. Abbreviazioni: BAPN = ß-amminopropionitrile; AAA = aneurisma dell'aorta addominale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

			86 maschio Sham	86 femmina Sham	86 Elastasi maschile/8APN	86 Elastasi femmina/8APN
Numero di topi			3	3	6	6
Età (settimane)			22,3 ± 0,0	22,7 ± 0,7	23,1 ± 0,2	23,2 ± 0,2
Peso (g; all'intervento chirurgico)			36,3 ± 2,5	23,7 ± 1,2	32,8 ± 1,7*	23,7 ± 0,8
Diametro aortico pre-trattamento (mm)			0,89 ± 0,02	0,75 ± 0,04	0,81 ± 0,07	0,73 ± 0,09
Diametro aortico post-trattamento (mm)			0,90 ± 0,03	0,73 ± 0,01	1,15 ± 0,03**	0,98 ± 0,12**
Variazione percentuale dopo 5 minuti di trattamento (%)			0,5 ± 4,4	-2,8 ± 5,3	43,4 ± 10,2***	33,6 ± 4,5***
Incidenza AAA (%)			0 / 3	0 / 3	6 / 6	6 / 6
AAA si rompe di 28 giorni			0 / 3	0 / 3	0 / 6	3 / 6
Sopravvivenza a 28 giorni			3 / 3	3 / 3	6 / 6	3 / 6
Diametro aortico massimo a 28 giorni (mm)			0,85 ± 0,01	0,64 ± 0,01	2,86 ± 0,31*	3,60 ± 1,87**
Variazione percentuale del diametro aortico a 28 giorni (%)			-4 ± 2	-16 ± 2	257 ± 54*	417 ± 286**

Tabella 1: Risultati di un modello murino a 28 giorni di elastasi/BAPN di AAA. I dati sono medi ± SD. *P<0,05, **P<0,005, ***P<0,0001 rispetto a sham dello stesso sesso tramite il test di Fischer ANOVA a una via. Abbreviazioni: BAPN = ß-amminopropionitrile; AAA = aneurisma dell'aorta addominale.

Discussione

Comprendere la complessa fisiopatologia dell'AAA è fondamentale per migliorare la gestione della malattia da aneurisma aortico. Mentre le nuove strategie vengono sviluppate attivamente per migliorare i risultati chirurgici, gli AAA rimangono prevalenti nella nostra società che invecchia e la rottura dell'aneurisma rimane una delle principali cause di morte negli Stati Uniti¹⁰. Pertanto, le esigenze insoddisfatte nelle strategie di rilevamento, prevenzione e trattamento dell'AAA giustificano ulteriori ricerche fondamentali sull'aneurisma¹¹.

I modelli animali che ricapitolano in modo accurato ed efficiente le caratteristiche e i comportamenti degli AAA umani sono essenziali per gli studi meccanicistici della fisiopatologia dell'aneurisma e per l'identificazione di potenziali bersagli terapeutici. Mentre gli attuali modelli animali possono imitare gli aspetti principali dei cambiamenti aneurismatici che si verificano nelle malattie umane, nessun singolo modello rappresenta pienamente la vera complessità degli AAA umani. Attualmente, i topi sono la specie più ampiamente accettata per la modellazione animale AAA. I ricercatori dovrebbero considerare i vari punti di forza e di debolezza di ciascun modello murino per il loro particolare studio sull'aneurisma, come quelli sapientemente descritti nelle revisioni di Daugherty et al. e Busch et ^al.12,13.

L'uso dell'elastasi per indurre l'AAA nei roditori è stato descritto per la prima volta da Anidjar et al. nel 1990¹⁴. La perfusione dell'aorta con l'elastasi pancreatica suina utilizzando una pompa a siringa crea una dilatazione iniziale all'incirca tra il 50% e il 70% e i segmenti dilatati dimostrano favorevolmente caratteristiche patologiche simili agli AAA umani, come la degenerazione mediale e l'infiammazione avventiziale. Il modello di perfusione classico, tuttavia, è probabilmente il modello di aneurisma tecnicamente più impegnativo e gli aneurismi che si formano tipicamente entro la seconda settimana iniziano a risolversi gradualmente in seguito. Bhamidipati et al. nel 2012 hanno poi dimostrato che l'applicazione avventiziale di elastasi potrebbe anche indurre con successo aneurismi simili che sono più riproducibili nella taglia¹⁵. Un modello molto meno impegnativo, il modello topico dell'elastasi è stato ampiamente adottato nella ricerca sull'aneurisma. Ulteriori metodologie e vantaggi del modello topico dell'elastasi sono discussi nell'articolo sui metodi di Xue e colleghi¹⁶.

Il modello elastasi/BAPN dell'AAA murino è stato sviluppato da Lu e colleghi nel 2017⁸. L'introduzione di acqua potabile BAPN allo 0,2% ha migliorato molte delle critiche al classico modello topico dell'elastasi, producendo ora aneurismi che si espandono continuamente fino al punto di rottura dell'AAA. Nel loro studio del 2017, hanno dimostrato che i topi nel gruppo trattato con elastasi/BAPN avevano tassi di formazione di AAA significativamente più elevati rispetto al gruppo elastasi (93% vs 65%, P < 0,01), che erano anche AAA in stadio più avanzato. Per un periodo di studio di 100 giorni, gli AAA nel gruppo elastasi/BAPN hanno continuato a dilatarsi fino a raggiungere il >800% del diametro basale e hanno formato trombi intraluminali (53,8%) e il 46,2% si è rotto spontaneamente prima della fine dell'esperimento. Questo modello ha permesso ai ricercatori di studiare i fattori che possono influire sulla progressione e sulla stabilità dell'aneurisma nel tempo.

Berman et al. hanno ulteriormente esplorato il modello elastasi/BAPN variando la concentrazione di elastasi topica, la durata dello studio, i tempi di somministrazione di BAPN e l'impatto del sesso animale⁹. Il trattamento con 5 μL di elastasi concentrata più elevata (5 mg/mL o 10 mg/mL) ha prodotto aneurismi più grandi di 2,5 mg/mL in 56 giorni. La prevalenza della formazione di trombi intraluminali dipendeva anche dalla concentrazione di elastasi, che si è verificata nel 28,6% dei topi trattati con 5 mg/mL e nel 62,5% dei topi trattati con 10 mg/mL. Hanno anche dimostrato che il modello elastasi/BAPN potrebbe indurre aneurismi nei topi femmina. Sebbene siano stati studiati solo pochi topi femmina (n = 5), hanno scoperto che gli aneurismi nelle femmine erano più inclini alla rottura (2 su 5 topi) ed erano significativamente più grandi degli AAA maschi a 56 giorni.

In questo articolo, miriamo a fornire un metodo per affrontare uno dei maggiori limiti della modellazione chirurgica, che è la variazione nella procedura chirurgica. Senza un chiaro consenso sul grado di dissezione e sull'area dell'aorta trattata con elastasi, i risultati di questo modello potrebbero variare notevolmente tra animali, ricercatori e istituzioni. Abbiamo osservato numerose variazioni anatomiche tra i topi, tra cui il numero e le dimensioni delle arterie e delle vene lombari e la posizione dell'IMA, il decollo della vena gonadica sinistra, tra gli altri, che possono essere limitanti quando si tenta di trattare solo una porzione o un segmento specifico dell'aorta infrarenale. Qui, dimostriamo che sezionare circonferenzialmente l'intera lunghezza dell'aorta infrarenale dall'arteria renale sinistra prossimalmente alla biforcazione aortica distalmente aiuta a fornire gradi riproducibili di esposizione aortica nonostante le differenze anatomiche, aumentando al contempo il successo dell'induzione dell'aneurisma e fornendo confini chiari per l'operatore. Inoltre, le dimensioni e la posizione più anteriore dell'IVC tendono a coprire la maggior parte dell'aorta, il che può influenzare la quantità di aorta trattata se non isolata dall'IVC. Sebbene sia necessario rimuovere la fascia retroperitoneale per esporre l'aorta, è importante non sezionare completamente il tessuto connettivo dell'avventizia dall'aorta ed esporre uno qualsiasi degli strati multimediali, poiché ciò provoca tipicamente la rottura durante il periodo di incubazione dell'elastasi di 5 minuti. Questo potrebbe servire come un ulteriore controllo interno al grado di dissezione con questo modello, ma può essere una curva di apprendimento frustrante quando si adotta questo modello. Gli operatori impareranno inoltre le aree a rischio più elevato (Figura 4) che possono essere facilmente ferite durante l'intervento chirurgico e portare a un'emorragia incontrollabile.

Sebbene sia importante che le fasi procedurali di questo modello siano coerenti, la durata dello studio e la tempistica dell'ecografia a intervalli possono variare a seconda dell'obiettivo della ricerca. La dilatazione aortica inizia immediatamente con l'applicazione di elastasi, ma gli studi che utilizzano questo modello seguono comunemente i topi per 28 giorni dopo l'intervento^{chirurgico 7}, come in questo esperimento di esempio. L'estensione della durata dello studio deve essere presa in considerazione quando si studiano AAA avanzati, crescita a lungo termine, formazione di trombi intraluminali o rottura.

Ulteriori misure perioperatorie, come il mantenimento della temperatura corporea e dello stato di idratazione dell'animale, possono aiutare a migliorare la sopravvivenza degli animali di questa procedura invasiva. L'uso di un termoforo durante l'intervento chirurgico e il posizionamento in una gabbia di recupero calda può aiutare a evitare l'ipotermia. La soluzione salina deve essere riscaldata prima di essere utilizzata per irrigare la cavità addominale. Un bolo di liquido sottocutaneo subito dopo l'intervento chirurgico può spiegare perdite di liquidi insensibili durante l'operazione e aiutare l'animale a mantenere un'adeguata idratazione durante l'immediata fase di recupero. Con un'attenta manipolazione dei tessuti e un approccio metodico coerente, il modello elastasi/BAPN può essere eseguito da un operatore esperto tra i 30 e i 45 minuti per topo e produrre in modo affidabile AAA con complicanze perioperatorie molto basse.

I nostri risultati dimostrano che la combinazione di BAPN in aggiunta alla dissezione circonferenziale dell'aorta infrarenale prima dell'applicazione dell'elastasi produce AAA grandi e in continua espansione, con diametri maggiori e incidenza di rottura in periodi più brevi. In questo esperimento, gli AAA sono stati indotti con successo in tutti i topi maschi (6 su 6) e femmine (6 su 6) trattati con elastasi attiva. L'esposizione all'elastasi per 5 minuti ha provocato un aumento immediato del diametro aortico di circa il 30-40%, il che è utile per confermare il successo e la coerenza dell'applicazione dell'elastasi tra i gruppi di trattamento. Analogamente a Berman et al., abbiamo dimostrato che questo modello può indurre AAA nei topi femmine, che hanno anche una risposta di rottura maggiore rispetto ai maschi. La metà dei topi femmina (3 su 6) si è rotta entro 28 giorni, rispetto a 0 su 6 dei maschi, tuttavia, i topi femmine pesano meno dei maschi. I topi maschi hanno dimostrato un aumento del diametro dell'AAA del 257% rispetto al -4% dei controlli maschi, mentre le femmine sopravvissute hanno mostrato un aumento del diametro del 417%, rispetto al -16% dei controlli femmine. I diametri aortici non erano significativamente diversi tra i topi maschi e femmine sopravvissuti trattati a 28 giorni a causa del maggior numero di rotture nel gruppo femminile. Ipotizziamo che i topi fittizi mostrino diametri aortici più piccoli entro la fine dello studio, poiché l'aorta tende a dilatarsi leggermente durante la dissezione iniziale e quindi forma tessuto cicatriziale entro 28 giorni.

Il modello elastasi/BAPN presenta alcune limitazioni. La dissezione circonferenziale dell'aorta richiede competenze chirurgiche fini, ma aiuta a migliorare la replicabilità e il grado di induzione dell'aneurisma. Simile al modello topico dell'elastasi, c'è anche un effetto batch nell'attività dell'enzima elastasi, che, come accennato in precedenza, è quindi importante per utilizzare lo stesso flacone di elastasi per tutti gli animali in un determinato esperimento. Sebbene l'incidenza del trombo intraluminale AAA e della rottura aumenti con il tempo e la gravità dell'aneurisma, questi non sono garantiti né completamente prevedibili in questo modello.

In sintesi, il modello elastasi/BAPN produce grandi AAA infrarenali reali sia nei topi maschi che nelle femmine, che si espandono progressivamente nel tempo, formano trombi intraluminali e sono in grado di rompersi. Questi punti di forza di questo modello murino aiutano a ricapitolare meglio alcuni dei comportamenti e delle caratteristiche degli aneurismi nell'uomo. Sebbene tecnicamente difficile, un'attenta e completa dissezione dell'aorta può aumentare la risposta aneurismatica. Attualmente, il metodo elastasi/BAPN è un modello avanzato per lo studio degli aneurismi dell'aorta addominale infrarenale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,5 L	Kent Scientific Corporation	SOMNO-0530XXS Camera per induzione per	anestesia
Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%, USP, 20 mL	Hospira	NDC 0409-4888-03	soluzione salina normale
Siringa da 3 mL Punta Luer-Lok con ago BD PrecisionGlide 22 G x 3/4	BD	REF 309569	siringa, ago da 22 G
3-Aminopropionitrile fumarato	TCI	A0796	BAPN
3-Aminopropionitrile fumarato sale	Sigma-Aldrich	A3134-25G	BAPN
Avant Delux garze spugne, 2 "x 2" 4 strati	Medline	NON26224	garze balde
Balding clipper	Whal Clipper Corporation	8110	tagliacapelli
betadine scrub chirurgico (povidone-iodio, 7,5%)	Avrio	NCD 67618-154-16	betadine
pinza smussata	ROBOZ	RS-5130	pinza smussata
Buprenorfina ER-lab	ZooPharm	BERLAB0.5	buprenorfina
carprofene	Norbrook	NDC 55529-131-11	carprofene
CASTROVIEJO 5.75" dritto con blocco	ROBOZ	RS-6412	Castroviejo cacciatore ad ago
applicatori in legno con punta in cotone, 6"	Dynarex	No. 4302	applicatori in legno con punta in cotone
DESMARRES 5.5' rectractor	Trattorizzatore di pelle	ROBOZ	RS-6672
calibro digitale, 0-150 mm	World Precision Instruments	501601	calibro digitale
DPBS (1x)	Gibco	14190-144	DPBS
Elastasi da pancreas suino Tipo I	Sigma-Aldrich	E1250-10MG	elastasi >4,0 unità/mg di
proteina Etanolo 200 proof	Decon Labs, Inc	2701	etanolo diluito al 70%
di lubrificante per gli occhi	Optixcare	14716	lubrificante per gli occhi
Germinator 500 sterilizzatore a secco	CellPoint Scientific, Inc	5-1450	sterilizzatore a perline secche
tappetino per terapia del calore	Adroit Medical Systems	V016	per terapia del
calore pompa per terapia del calore	Adroit Medical Systems	HTP-1500
isoflurano, USP	Akorn Animal Health	NCD 59399-106-01	isoflurano
Pipetta L-10	Pipetta Rainin	LTS 0,5-10 uL
Maschera per anestesia a basso profilo, piccola	Kent Scientific Corporation	SOMNO-0801	per anestesia
	ROBOZ	RS-5619	forbice per micro dissezione
Microscopio	Leica	S9i
Illuminatore LED ad alta intensità Nii-LED Luce esercitante	Nikon Instruments, Inc	83359 NII-LED
monofilamento leggero di nylon 5-0 per dissezione esterna, sutura nera non assorbibile	Oasis	MV-661-V	5-0
GAMMEX Non-Latex PI Micro, misura 7,5	Ansell	20685975	guanti chirurgici non in lattice Clip per
ferite in acciaio inossidabile Reflex da 7 mm	CellPoint Scientific, Inc	203-1000	ferita clip
scala	Ohaus	Compass CR2200	scala
SomnofFlo Kit	Kent Scientific Corporation	10-8000-71	tubo per vaporizzatore elettronico
Vaporizzatore elettronico SomnoFlo	Kent Scientific Corporation	SF2992	vaporizzatore elettronico a basso flusso
Deviatore di flusso SomnoPath	Kent Scientific Corporation	SP1016	deviatore di flusso per vaporizzatore elettronico
SS/45 pinza affilata	ROBOZ	RS-4941
forbici chirurgiche
ROBOZ RS-6010SCpinza per vasi	Dumont	VES 0,35	pinza per vasi