Questo protocollo presenta un metodo completo ed efficiente per l'analisi della riparazione dell'osso mandibolare. Descriviamo una tecnica riproducibile per la frattura mandibolare non stabilizzata in un modello murino, che consente l'analisi del processo di riparazione ossea endocondrale con un danno tissutale e una perdita ossea minimi.
Articolo metodologico
Tecnica meno invasiva per la frattura mandibolare non stabilizzata in modelli murini
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le fratture non stabilizzate possono essere praticate nei siti mandibolari nei topi, rendendo così possibile analizzare la riparazione ossea utilizzando una modalità di ossificazione endocondrale. Per riflettere nel modo più accurato questo processo in vivo, è necessario disporre di un protocollo standardizzato per evitare un'eccessiva perdita ossea e danni ai tessuti molli, in particolare nel sito mandibolare, un sito anatomico caratterizzato da un accesso minimo. Per quanto ne sappiamo, descriviamo per la prima volta un protocollo meno invasivo di frattura mandibolare non stabilizzata nei topi. I topi adulti vengono anestetizzati con isoflurano e ricevono una dose preoperatoria di buprenorfina mediante iniezione sottocutanea. Viene eseguito un approccio sottomandibolare, con un'incisione cutanea praticata lungo il bordo inferiore della mandibola. Il muscolo massetere è elevato in un piano sottoperiostale lungo il ramo mandibolare con un elevatore periostale. Una frattura verticale e completa del ramo viene eseguita dal bordo basilare all'incisura coronoidea (tra i processi condilare e coronoideo), utilizzando un dispositivo di chirurgia ossea piezoelettrica sotto irrigazione di siero salino sul bordo basilare e forbici per completare la frattura del ramo mandibolare. L'approccio cutaneo è chiuso da suture di seta. Questa procedura dettagliata per le fratture mandibolari non stabilizzate offre una procedura efficiente che consente una perdita ossea minima e danni ai tessuti molli. Questa tecnica garantisce risultati coerenti e di successo per riflettere accuratamente il processo di riparazione dell'osso endocondrale nei modelli murini.
Introduzione
La riparazione ossea implica processi di ossificazione sia membranosi che endocondrali, a seconda della frattura o della stabilizzazione dell'osteotomia. La riparazione ossea a seguito di osteotomie ossee stabilizzate o fratture si basa sull'ossificazione membranosa, mentre le fratture non stabilizzate o le osteotomie scarsamente stabilizzate si consolidano secondo una modalità di ossificazione endocondrale1. La riparazione ossea membranosa è caratterizzata dalla formazione ossea mediante differenziazione diretta delle cellule mesenchimali in osteoblasti, mentre la riparazione ossea endocondrale comporta la formazione di un modello cartilagineo transitorio, che si differenzia in osteoblasti per formare il callo osseo2.
La riparazione ossea dipende da molteplici interazioni tra tessuti e cellule; È anche influenzata da fattori sito-specifici e dalla forza esercitata sul callo3. L'osso mandibolare è un osso mobile che supporta le forze masticatorie, formato principalmente da osso corticale. Il processo di riparazione dell'osso mandibolare è influenzato dal sito e dalla direzione della frattura. È noto che le lesioni muscolari e del periostio possono influire sul consolidamento osseo e su un'importante perdita ossea nel sito di frattura 4,5,6.
L'analisi della riparazione dell'osso endocondrale mandibolare implica protocolli standardizzati e riproducibili per confronti preziosi e non distorti. Per quanto riguarda la letteratura, solo pochi autori riportano protocolli per fratture mandibolari non stabilizzate in modelli murini 3,7, e per lo più con una direzione anteriore a livello molare8. Sviluppando questa tecnica, miriamo a evitare lesioni muscolari e periostiali e a limitare la perdita ossea nel sito della frattura per analizzare al meglio il processo di riparazione ossea endocondrale senza fattori confondenti. Inoltre, lo scopo dello sviluppo di una nuova tecnica per la frattura mandibolare nei topi era quello di ridurre al minimo il dolore post-operatorio e la morte degli animali frequenti in tali interventi chirurgici nei piccoli animali. Per la prima volta, descriviamo un protocollo meno invasivo per la frattura mandibolare non stabilizzata a livello del ramo nei topi. Questo protocollo in vivo evita eccessivi danni muscolari e periostici o perdite ossee nel sito della frattura e aiuta a ridurre il livello di dolore postoperatorio e il rischio di morte dell'animale.
Protocollo
Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell'Imagine Institute ed è stato convalidato dai comitati etici e dal ministero francese (APAFIS 26995).
1. Animali
- Determina il numero di animali per gruppo. Si consigliano 12 animali per gruppo. Determina il sesso e l'età dei topi. Questo protocollo è adattato per topi C57BL/6J di 6 settimane (maschi o femmine).
- Somministrare agli animali, almeno 1 settimana prima della procedura, un integratore alimentare in gel per l'acclimatazione.
2. Procedura chirurgica
- Preparare il materiale necessario. Autoclavare gli strumenti: forbici, caccia-ago, pinze, inserto e manipolo del dispositivo piezoelettrico per la chirurgia ossea ed elevatore. Preparare guanti sterili, suture di seta (4/0), rasoio, garza di cotone, soluzione di iodio povidone al 10%, tavolo riscaldante, isoflurano e maschera per il muso per l'inalazione di isoflurano.
- Preparare buprenorfina a 0,1 mg/kg, diluita in siero fisiologico sterile iniettabile. Somministrare buprenorfina per iniezione sottocutanea con un ago da 25G 30 minuti prima dell'intervento.
- Preparare la piastra riscaldante (37 °C), posizionare su di essa un supporto in schiuma e fissare la maschera per il muso con piccoli aghi o nastro adesivo.
- Posizionare il topo nella vasca di isoflurano per l'induzione, con diffusione dell'isoflurano (4%). Testare la profondità dell'anestesia eseguendo un pizzicamento delle dita dei piedi. In caso di induzione sufficiente, si osserverà una mancanza di riflesso del pedale.
- Posizionare il topo anestetizzato sulla schiena sulla piastra riscaldante coperta da un campo sterile mantenuto a 37 °C durante l'intera procedura. Posizionare la maschera sul muso per l'inalazione continua di isoflurano (mantenimento al 2,5%). Fissare le estremità del mouse con del nastro adesivo.
- Applicare il lubrificante per gli occhi bilateralmente per prevenire la secchezza oculare indotta dall'anestesia generale. Radere i peli sottomandibolari, indossare guanti sterili e disinfettare la pelle con diverse spruzzi di soluzione di iodio povidone al 10% e alcol.
- Eseguire l'approccio cutaneo sottomandibolare come descritto di seguito.
- Eseguire un'incisione cutanea dall'angolo mandibolare alla giunzione 1/3 posteriore - 2/3 anteriore del ramo orizzontale della mandibola con micro forbici.
- Sezionare i tessuti sottocutanei per esporre il muscolo massetere.
- Disinserire il muscolo massetere attaccato con l'uso di un elevatore periostale dal bordo inferiore della mandibola.
- Elevare il muscolo massetere su un piano sottoperiostale lungo il ramo mandibolare con l'elevatore.
- Creare una piccola osteotomia (3 mm di lunghezza) sul bordo inferiore della mandibola utilizzando il dispositivo piezoelettrico per la chirurgia ossea sotto irrigazione con siero salino (10 ml/min massimo) sul bordo inferiore della mandibola, anteriormente all'angolo mandibolare, nella parte posteriore della concavità (Figura 1, Figura 2).
- Individuare il bordo posteriore della mandibola e l'incisura coronoidea (con le micro forbici o la pinza) e completare la frattura con l'uso di piccole forbici diritte inserite lungo il ramo mandibolare per evitare ulteriori aperture e lesioni del muscolo massetere. Per consentire il corretto orientamento della frattura, posizionare le forbici perpendicolarmente al bordo inferiore della mandibola.
- Verificare che la frattura sia totalmente completa: la mobilità totale tra i due segmenti ossei deve essere osservata durante la mobilizzazione morbida dei 2 segmenti con la pinza.
- Chiudere l'approccio cutaneo con suture di seta (4/0) con suture separate. Non è necessaria alcuna sutura nel periostio.
NOTA: In alternativa, l'approccio cutaneo può essere suturato con altre suture non adsorbibili (ad es. suture in polipropilene). - Eseguire radiografie laterali cefaliche per confermare la direzione della frattura (Figura 3).
- Posizionare nuovamente il mouse nel serbatoio di isoflurano per una breve reinduzione prima di eseguire i raggi X. Quindi, posizionare il mouse in estensione, sul lato laterale, con la testa leggermente in iperestensione per l'analisi a raggi X.
- In caso di frattura troppo anteriormente posta a livello di un molare mandibolare o quando la frattura ha staccato l'angolo mandibolare (Figura 4), osservare un aumento anomalo del volume del callo osseo. In questi casi, escludere gli animali dallo studio per evitare distorsioni nell'analisi.
- Controlla i topi finché non riprendono conoscenza prima di rimetterli nella gabbia.
3. Assistenza post-operatoria
- Prepara una gabbia per topi senza crocchette e arricchimento duro per evitare qualsiasi forza masticatoria.
- Isolare il topo operato in una singola gabbia per la 1asettimana fino a quando la pelle non è completamente guarita. A 1 settimana dopo l'intervento, il gruppo ha operato topi femmine insieme nella stessa gabbia.
- Somministrare buprenorfina (0,1 mg/kg) mediante iniezioni sottocutanee a 4 ore, 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo la procedura.
- Nutrire i topi con gel dietetico morbido durante tutti i periodi post-operatori dal giorno 0 alla fine del periodo di consolidamento (cioè 28 giorni) per evitare dolore e spostamento secondario della frattura.
- Pesare quotidianamente i topi dal giorno 0 al giorno 4 dopo la frattura, al mattino, prima dell'iniezione di buprenorfina, e poi 3 volte a settimana fino al sacrificio animale (14 giorni dopo la frattura).
- Valutare il benessere degli animali post-operatori per ottimizzare la cura degli animali post-operatori. Utilizzare la scala di punteggio nella Tabella 1 per valutare lo stato postoperatorio dell'animale e adattare il follow-up. Quando il punteggio è > 1, viene somministrata l'iniezione di buprenorfina, e quando il punteggio è > 3 e/o in caso di perdita di peso > 20% del peso preoperatorio nonostante l'arricchimento alimentare, l'eutanasia deve essere discussa (Tabella 1).
Risultati
Per quanto riguarda le procedure chirurgiche in vivo , per eseguire in modo ottimale questa procedura di frattura mandibolare non stabilizzata in un modello murino, sono necessari un apprendimento e una formazione specifici.
Questa tecnica per la frattura mandibolare non stabilizzata consente lo studio del processo di riparazione dell'osso endocondrale. Dopo l'eutanasia, sono stati raccolti campioni mandibolari in paraformaldeide al 4% (24 ore). Dopo la decalcificazione completa con EDTA pH 8, le sezioni sono state incorporate nella paraffina. Le sezioni seriali sagittali sono state eseguite, deparaffinate in soluzione di deparaffinazione e quindi reidratate prima della colorazione con Sirus Red/Alcian Blue, utilizzando protocolli standard. Le immagini istologiche hanno confermato la formazione di un callo molle con stampo cartilagineo (Figura 5). La guarigione ossea si completa a 4 settimane dalla frattura, come dimostrato dalle analisi micro-CT. Si consiglia di studiare il processo di riparazione ossea in diversi punti chiave dall'inizio della formazione del callo (ad esempio, ogni 7 giorni (giorno 7, 14, 21) o più a seconda dell'obiettivo dello studio) fino alla fine della guarigione ossea (ad esempio, giorno 28), con analisi istomorfologiche e morfometriche micro-CT.
Sulla base di un'analisi retrospettiva di questa procedura eseguita su 58 topi wild-type (background C57BL/6J), il tasso di successo del protocollo è dell'86,3% e un tasso di esclusione del 13,7%. L'esclusione era dovuta alla morte spontanea prematura nel primo periodo postoperatorio (3%), alla decisione di eutanasia per i topi che presentavano un punteggio critico (1%; punteggio > 3 e/o in caso di perdita di peso > 20%), o in caso di posizione anomala dell'osteotomia, con anormale divisione dell'angolo mandibolare (5%), o quando la frattura era a livello molare (n=1/58). In quest'ultimo caso è stata osservata un'infezione, con la spaccatura anomala della frattura a livello molare (n= 1/58; Tabella 2).
Figura 1: Immagine dell'approccio cutaneo sottomandibolare del ramo ascendente mandibolare. Il bordo inferiore della mandibola è fratturato con un inserto piezotomico, consentendo una perdita ossea minima (freccia). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Colorazione della mandibola del topo. Vista laterale di una mandibola di topo wild type di 6 settimane (colorata con colorazione rosso alizarina / blu alciano): 1. Condilo, 2. Processo coronoideo, 3. Tacca coronoidea, 4. Processo angolare, 5. Bordo posteriore del ramo, 6. Bordo basilare (o inferiore) della mandibola. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Radiografia del cranio del topo. Radiografie laterali del cranio di un topo selvatico di 6 settimane (vista sagittale) che mostrano l'aspetto della mandibola di un topo non fratturato (a sinistra) e l'aspetto della mandibola di un topo fratturato e la direzione della frattura mandibolare non stabilizzata (frecce), dal bordo inferiore alla tacca coronoidea, posta anteriormente al condilo (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Radiografia del cranio del topo in condizioni non ottimali. Radiografie laterali del cranio di un topo selvatico di 6 settimane (vista sagittale) che mostrano una frattura anomala dell'angolo mandibolare (frecce). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati rappresentativi. Risultati al giorno 14 dopo la frattura in un topo wild-type (C57BL/6J). Viste coronali 3D rappresentative di una scansione μCT ricostruita del sito della frattura mandibolare, che mostra il callo osseo (frecce bianche). Immagini rappresentative della cartilagine del callo (colorazione Sirus Red/Alcian Blue) che confermano la presenza di un processo di riparazione ossea endocondrale. Abbreviazioni: B = osso, C = cartilagine. Barra della scala: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 0 | 1 | 2 | |
| Aspetto animale | Normale | Riduzione WC | Peli arruffati, schiena arcuata |
| Comportamento | Normale | Ipomobilità | Ipomobilità, riduzione dell'assunzione di cibo, perdita di peso > 10 % |
| Segni clinici | Normale | Infiammazione cicatriziale | Cicatrice aperta, infezione |
Tabella 1. Scala di punteggio del benessere post-operatorio.
| n = 58 topi | |
| Percentuale di successo | 86.3 % |
| Tasso di esclusione : | 13.7 % |
| Morte spontanea prematura | 3% |
| Punteggio critico < 3 e/o perdita di peso > 20 % | 1% |
| Frattura anomala divisa all'angolo mandibolare | 5% |
| Frattura anomala, a livello molare | 1.7 % |
Tabella 2. Tassi di successo e di esclusione del protocollo.
Discussione
La tecnica consente la realizzazione di fratture mandibolari non stabilizzate in un modello murino con un approccio aperto minimo in un breve tempo di procedura (circa 10 minuti o meno). Questa procedura di breve durata limita il rischio di morbilità e morte degli animali, soprattutto nei piccoli animali come i topi. Per ottenere risultati comparabili nell'analisi del processo di riparazione ossea endocondrale, è necessario prestare particolare attenzione a eseguire le fratture mandibolari nella stessa direzione senza una divisione anomala dell'angolo mandibolare, poiché questo effetto indesiderato può aumentare in modo anomalo il volume del callo osseo e ritardare il periodo di consolidamento. Questo protocollo per la frattura mandibolare non influisce sulla crescita degli incisivi mandibolari dopo l'intervento chirurgico. Per migliorare l'efficacia di questo protocollo, consigliamo allo sperimentatore di fare prima esercizio su animali sottoposti a eutanasia di età simile e di sezionare immediatamente dopo la frattura della mandibola per visualizzare direttamente la direzione della frattura, se necessario.
I progenitori mesenchimali che migrano dai muscoli adiacenti al callo contribuiscono alla riparazione ossea6. È stato dimostrato che il periostio e le lesioni muscolari influiscono sul consolidamento osseo 5,6. Inoltre, sezioni muscolari estese portano ad un aumento del rischio di sanguinamento e possono portare a infezioni post-operatorie. La piezochirurgia è stata ampiamente sviluppata nel campo della chirurgia ossea craniofacciale; È stato riportato che ha tassi più bassi di lesioni dei tessuti molli e dolore postoperatorio rispetto alle osteotomie convenzionali 7,9. Per ridurre al minimo la lesione del muscolo massetere e del periostio, abbiamo utilizzato la piezochirurgia per iniziare la frattura al bordo inferiore della mandibola e abbiamo completato la frattura con le forbici al livello superiore del ramo per evitare un'estesa sezione del muscolo massetere. Ciò implica il controllo della posizione del bordo posteriore della mandibola e dell'incisura coronoidea prima di fratturare la parte superiore del ramo con le forbici. Non abbiamo incontrato alcuna difficoltà a completare la frattura con l'uso di piccole forbici diritte dopo averla iniziata con la piezochirurgia al bordo inferiore della mandibola. Abbiamo sperimentato questa procedura in topi adulti con diversi background genetici (C57BL/6J, CD1 (risultati non mostrati)), con diverse densità ossee e dimensioni mandibolari (prognatismo, micrognazia). Tuttavia, si consiglia di verificare che la lunghezza delle forbici sia adatta a fratturare il ramo superiore una sola volta per evitare fratture anomale.
Il rischio di sanguinamento è ridotto al minimo in questa procedura grazie a questo approccio aperto minimo. In caso di sanguinamento eccessivo che può verificarsi durante l'elevazione muscolare, una breve compressione del sito chirurgico con una garza arresta l'emorragia. Un potenziale rischio di infezione del sito operatorio può verificarsi in caso di frattura del dente molare quando la frattura mandibolare è posizionata troppo anteriormente; questo effetto avverso può essere rilevato sulle radiografie laterali postoperatorie. In questo caso, l'animale deve essere escluso dallo studio. L'infezione post-operatoria del sito operatorio può anche essere dovuta a un ematoma; Ciò può essere evitato eseguendo suture cutanee separate, consentendo l'evacuazione spontanea quando si verifica un sanguinamento anomalo prima dell'intervento. L'anestesia generale con isoflurano rispetto all'iniezione intraperitoneale evita tassi di mortalità eccessivi legati agli effetti traumatici avversi delle iniezioni intraperitoneali. Nella nostra esperienza, non abbiamo osservato alcuna morte animale direttamente collegata all'anestesia generale con isoflurano.
I topi possono presentare una riduzione post-operatoria dell'assunzione di cibo. In caso di assunzione insufficiente di cibo o aumento di peso insufficiente, è possibile aggiungere al gel crocchette in polvere setacciate. Per migliorare l'assunzione di cibo postoperatorio, si consiglia di somministrare un integratore alimentare in gel con crocchette almeno 1 settimana prima della procedura di accomodamento. Si consiglia di eseguire ulteriori radiografie durante il follow-up (ogni settimana, durante il follow-up) e al momento del sacrificio per valutare il potenziale spostamento della frattura. In condizioni non patologiche, il consolidamento osseo è completo 4 settimane dopo la frattura.
Diversi autori hanno descritto diversi protocolli per fratture non stabilizzate della mandibola nei topi 3,10,11. Gli strumenti utilizzati per eseguire l'osteotomia possono essere diversi, ovvero trapani, pinzette chirurgiche, ecc. Tuttavia, l'uso di frese può portare a una maggiore perdita ossea e lesioni ai tessuti molli. Per quanto ne sappiamo, questa procedura di fratture mandibolari non stabilizzate è la prima ad associare la piezochirurgia e le forbici per completare l'osteotomia. Questa tecnica ha il vantaggio di preservare i tessuti molli consentendo un'osteotomia precisa con una perdita ossea minima.
Come per tutte le tecniche, questo metodo ha alcune limitazioni. Abbiamo preferito eseguire la frattura con l'uso di forbici dopo averla iniziata con un inserto di chirurgia piezoelettrica per evitare qualsiasi sezione muscolare massetere estesa e lesioni del periostio che potrebbero esacerbare un potenziale ritardo di consolidamento e/o formazione di pseudoartrosi. Tuttavia, questa tecnica implica il controllo della posizione dell'incisura coronoidea senza la visualizzazione totale del ramo mandibolare per eseguire la frattura nella stessa direzione. Ci si aspetta quindi una curva di apprendimento, a seconda dell'esperienza chirurgica. Inoltre, la direzione della frattura mandibolare sui raggi X può essere difficile da visualizzare a seconda del dispositivo a raggi X. Non abbiamo utilizzato la micro-CT in vivo per confermare la direzione della frattura, in quanto potrebbe compromettere il recupero del topo a causa della maggiore durata dell'anestesia generale.
Lo studio del processo di riparazione ossea endocondrale implica la realizzazione di fratture non stabilizzate, consentendo così una migliore comprensione del processo di riparazione ossea. Questo passaggio è necessario se si vogliono considerare studi preclinici in modelli murini con difetti di riparazione ossea con l'obiettivo di sviluppare nuove applicazioni cliniche per il trattamento di riparazione ossea difettosa e pseudoartrosi in pazienti nel contesto di malattie genetiche o in caso di sequele post-traumatiche o post-tumorali.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Lo studio è supportato in parte dal Dipartimento di Filantropia di Mutuelles AXA attraverso la Head and Heart Chair e l'ANR BonyBrain. Ringraziamo tutti i membri della piattaforma SFR Necker INSERM US24, LEAT Imagine, Parigi, Francia, per il loro contributo alla realizzazione della procedura.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Buprenorfina : Buprecare 0,3 mg/kg | Animalcare | ||
| Elevator OBWEGESER larghezza 6 mm Lunghezza 17,5 cm | Collin Medical | HA 5905 | |
| Pinze : Piastra Pad MORIA 11 cm N° 5 | MORIA | 9906 | |
| Tavolo riscaldante Bioseblab 55 cm x 33 cm | Bioseblab | 707 | |
| Ago HOLDER : Micro Halsey Needle Holder - Metallo | LABODERM | 21.100 | |
| Neo Clear | Merck Millipore, Darmstadt, Germania | 109843 | |
| Ocry Gel Tubo 10 g (lubrificante per gli occhi) | tvm lab | 3.70045E+12 | |
| Piezotomo 2 ASS FINAL | ACTEON | X57402 | |
| Inserto piezotomo Piezocision PZ3 | ACTEON | F87574 | |
| Forbici micro | MORIA | MC52 | |
| Suture in seta PERMA HAND SEIDE / MERSILK | ETHICON | REF 18501G | |
| Forbici dritte | MORIA | 4877A | |
| Vetflurano (isoflurano) 250 ml | VIRBAC | VET066 (Centravet) |
Riferimenti
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