Uso della somministrazione di farmaci guidata da micropipette come metodo alternativo alla sonda gastrica orale nei modelli di roditori

Sommario

Qui, descriviamo la somministrazione di farmaci guidata da micropipette (MDA) come un metodo alternativo alla sonda gastrica orale che incentiva l'animale da ricerca a ingerire prontamente i trattamenti con il minimo stress e disagio.

Abstract

La sonda orale (OG) con l'uso di una cannula collegata a una siringa è uno dei metodi più comuni utilizzati per fornire un dosaggio preciso di composti allo stomaco degli animali da ricerca. Sfortunatamente, questo metodo presenta difficoltà sia per l'operatore che per l'animale da ricerca. Gli studi hanno dimostrato che l'OG può portare a complicanze, tra cui esofagite, perforazione dell'esofago e somministrazione involontaria di farmaci tracheali. Inoltre, l'OG è associato ad un aumento dei livelli plasmatici e di corticosterone fecale (a causa dello stress), all'alterazione della pressione sanguigna e all'aumento della frequenza cardiaca, che potrebbero influenzare negativamente o influenzare i risultati dello studio. Un metodo alternativo precedentemente sviluppato, chiamato somministrazione di farmaci guidata da micropipette (MDA), incentiva l'animale a consumare prontamente i trattamenti in modo minimamente invasivo. In questo articolo, presentiamo esempi dell'uso della tecnica MDA con trattamenti ricostituiti in diversi veicoli e dimostriamo l'efficacia della somministrazione dei vari trattamenti a più ceppi di topi diversi. Dimostriamo inoltre che l'MDA è una tecnica che riduce i tempi e l'invasività della somministrazione del farmaco e non influisce sulla composizione del microbioma intestinale valutata mediante analisi quantitativa delle specie microbiche intestinali principali. Nel complesso, l'MDA può offrire un'alternativa meno stressante ed efficace all'OG.

Introduzione

La somministrazione di farmaci a modelli di roditori avviene comunemente tramite sonda orale (OG), che consiste nella somministrazione di un preparato liquido direttamente nello stomaco utilizzando una cannula collegata a una siringa contenente la soluzione. Questa tecnica si traduce in un dosaggio costante e preciso del trattamento all'animale, ma comporta anche molteplici svantaggi. OG è stato esaminato per non aver modellato adeguatamente le esposizioni alimentari umane ^1,2. Inoltre, l'OG aumenta il rischio di lesioni non intenzionali all'apparato digerente superiore (perforazione dell'esofago e dello stomaco), all'aspirazione del trattamento somministrato e alle lesioni del tratto respiratorio³. L'OG è anche associato a disagio⁴, aumento della pressione sanguigna e della frequenza cardiaca⁵, nonché stress ^6,7 e talvolta morte⁸ a causa della ridotta tolleranza al gavage da parte dell'animale. Questi cambiamenti fisiologici potrebbero interferire o confondere i risultati sperimentali; Pertanto, sono state esplorate nuove procedure per evitare questi effetti collaterali. Gli studi hanno utilizzato procedure alternative all'OG, come l'uso della gelatina come veicolo farmacologico⁹, strisce a dissoluzione orale (ODS)¹⁰, aghi per sonda gastrica rivestiti di saccarosio¹¹, tubi di alimentazione flessibili, biscotti di grano¹², miele¹³ e pellet di burro di arachidi¹⁴. Sfortunatamente, ci sono limitazioni con queste modifiche alla tecnica OG, tra cui l'incompatibilità con i farmaci insolubili in acqua, un tempo di preparazione più lungo per il trattamento¹⁵, l'appetibilità e la stabilità del farmaco¹⁵ e la familiarizzazione dell'animale con il cibo. Inoltre, c'è la possibilità di un dosaggio meno preciso quando gli animali si nutrono ad lib.

Scarborough et ^al.7 hanno precedentemente sviluppato un metodo di trattamento orale alternativo nei topi, che hanno chiamato somministrazione di farmaci guidata da micropipette (MDA). Questo metodo di somministrazione si basa su una soluzione di latte condensato zuccherato come veicolo per sostanze farmacologiche, motivando gli animali dello studio a consumare prontamente il veicolo preparato e/o le soluzioni farmacologiche dispensando la soluzione con una pipetta a canale singolo e un puntale per pipetta. Per introdurre questa tecnica, i roditori vengono sottoposti a una sessione di addestramento (minimo 2 giorni) per ridurre i tempi di manipolazione e per consentire all'animale in studio di familiarizzare con l'assunzione dal puntale della pipetta⁴. Gli studi iniziali di validazione di Scarborough et ^al.7 e Schalbetter et ^al.16 suggeriscono che la procedura MDA è facile da implementare, economica, minimamente invasiva e meno stressante per gli animali rispetto ai metodi convenzionali di gavage orale. Scarborough et al. hanno introdotto l'uso della tecnica MDA in un modello murino di attivazione immunitaria materna (MIA) dei disturbi dello sviluppo neurologico⁷. Questo studio ha dimostrato che i profili farmacocinetici dei topi trattati con il farmaco antipsicotico risperidone utilizzando MDA erano paragonabili all'uso di OG. Inoltre, l'MDA non ha indotto un aumento dei livelli di corticosterone (un ormone dello stress) nei topi e il trattamento cronico con risperidone con la tecnica MDA ha portato a una diminuzione dose-dipendente dei deficit di interazione sociale indotti da MIA e dell'ipersensibilità alle anfetamine⁷. Ulteriori studi hanno esplorato l'efficacia dell'MDA rispetto all'OG sia nel topo¹⁷ che nel ratto¹⁸ . L'MDA è stato anche confrontato con l'iniezione intraperitoneale e si è dimostrato altrettanto efficace nel somministrare clozapina-N-ossido ai topi¹⁶. A causa del successo riportato dell'MDA nel ridurre lo stress animale e l'efficacia terapeutica, ora miriamo a esplorare ulteriormente la tecnica MDA come metodo efficace di somministrazione di farmaci utilizzando ulteriori modelli murini. Qui, descriviamo l'implementazione del metodo MDA per trattare diversi ceppi di topo, inclusi i ceppi FVB/NJ e C57BL/6J immunocompromessi e il ceppo immunocompromesso NOD.Cg-Prkdc^{scid Il2rg tm1Wjl}/SzJ (NSG) con diversi trattamenti orali, tra cui batteri vivi, composti sperimentali somministrati in soluzioni insolubili in acqua (olio di mais) e controlli del veicolo. Abbiamo valutato l'attività e la presenza dei diversi trattamenti nel siero e nelle feci e abbiamo valutato le alterazioni del microbiota intestinale centrale in relazione al metodo MDA.

Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti seguendo le linee guida istituzionali e secondo i protocolli M021M197 e M023M195 approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Johns Hopkins University. I ceppi di topi utilizzati (topi maschi, di 7 settimane) sono descritti nella Tabella dei Materiali. L'uso di topi maschi era dovuto al loro uso negli studi in corso sul cancro alla prostata. Il metodo MDA ha precedentemente dimostrato di essere efficace anche nei topi femmina ^7,17. I topi sono stati randomizzati nelle rispettive gabbie/gruppi di trattamento. I topi sono stati trattati in gabbie e senza un ordine particolare. Lo sperimentatore che somministrava i trattamenti era all'oscuro del gruppo di trattamento. Il numero assegnato a un topo si riferiva al suo ID e non all'ordine in cui veniva trattato. I dati sono stati raccolti durante tutta la durata dello studio e analizzati alla fine per evitare qualsiasi pregiudizio. I saggi sperimentali sono stati tenuti in cieco al gruppo di trattamento fino a quando non sono stati raccolti tutti i dati.

NOTA: Questo protocollo è stato modificato da Scarborough et ^al.7.

1. Preparazione dei trattamenti

1. Preparare una soluzione di latte condensato zuccherato (ingredienti: latte e zucchero) e acqua di biologia molecolare utilizzando un rapporto 3:10 tra latte e acqua. Misurare il latte condensato zuccherato utilizzando una provetta conica da 15 ml a causa della viscosità del latte.
2. Utilizzando una provetta conica da 50 ml, mescolare acqua di biologia molecolare con il latte condensato zuccherato mescolando lentamente 5 ml di acqua alla volta con il latte.
   NOTA: Questa fase viene eseguita in condizioni sterili utilizzando una cappa di biosicurezza.
3. Preparare le aliquote della soluzione di latte (conservate come aliquote da 500 μl) e conservare le aliquote a 4 °C fino a quando non si combinano con il trattamento di interesse.
4. Risospendere i trattamenti nei rispettivi veicoli alla concentrazione corretta in base al peso corporeo dell'animale prima di combinarli con la soluzione di latte condensato/acqua zuccherata.

2. Sessione di formazione MDA

NOTA: Questa sezione descrive i modelli murini; tuttavia, la tecnica MDA potrebbe essere ampliata secondo necessità con volumi/puntali per pipette più grandi per modelli di roditori più grandi.

1. FACOLTATIVO: Trattenere delicatamente l'animale in studio tenendo la collottola con una mano.
2. Offrire all'animale in studio 100 μl di soluzione di latte/acqua condensata zuccherata (senza l'aggiunta del trattamento sperimentale) utilizzando una pipetta a canale singolo e un puntale per pipetta da 200 μl che viene guidato verso la bocca.
3. Erogare lentamente la soluzione di latte/acqua per evitare di perdere la bocca dell'animale. Assicurarsi che l'animale consumi prontamente la soluzione di latte tra 5-15 secondi.
   NOTA: Questo allenamento si svolge per un minimo di 2 giorni consecutivi (una sessione di allenamento al giorno), senza modifiche al volume somministrato. Per le sessioni di formazione MDA è stata necessaria una leggera moderazione con la collottola. Scarborough et ^al.7 raccomandano la contenzione completa dell'animale il primo giorno di addestramento MDA e poi la contenzione per la coda il secondo giorno. Il metodo di contenzione può differire per i modelli di roditori più grandi. Al contrario, Vanhecke et ^al.17 hanno tenuto i topi solo leggermente per la coda durante l'addestramento.

3. Trattamenti dei topi con il metodo MDA

1. Combinare il trattamento in studio con la soluzione di latte condensato/acqua zuccherata (vedere esempi con esperimenti di convalida [sezione 4 e sezione 5] di seguito).
2. FACOLTATIVO: Trattenere delicatamente l'animale in studio tenendo la collottola con una mano.
   NOTA: Scarborough et ^al.7 riportano che i topi non hanno più bisogno di contenzione oltre il periodo di allenamento e berranno prontamente dalla punta della pipetta. Al contrario, Vanhecke et ^al.17 riportano che per alcuni trattamenti (ad esempio, il tamoxifene) che potrebbero avere una lieve avversione al gusto, l'MDA viene eseguito al meglio trattenendo delicatamente i topi tramite collottola durante tutti i trattamenti. Questo studio ha anche stabilito che posizionare l'animale sulla schiena con una collottola delicata migliora il tempo e l'efficacia del consumo del trattamento.
3. Somministrare 100 μL di trattamento utilizzando una pipetta a canale singolo e una punta da 200 μL guidata verso la bocca dell'animale, come eseguito durante le sessioni di addestramento.
4. Tratta un singolo animale alla volta.
5. Rimetti ogni animale nella rispettiva gabbia dopo il trattamento.
   NOTA: I trattamenti con il metodo MDA possono essere somministrati quotidianamente o in modo ripetuto ^7,17.

4. Esperimento di validazione #1 - somministrazione orale di batteri intestinali ai topi utilizzando MDA

NOTA: Questa sezione descrive l'uso del metodo MDA per somministrare per via orale batteri vivi per studi di colonizzazione intestinale nei topi. In questo esperimento pilota rappresentativo, il batterio gram-positivo Clostridium scindens viene somministrato ai topi C57BL/6J. I topi sono stati trattati con antibiotici (cefoxitina) per due giorni consecutivi nell'acqua potabile prima dell'inoculazione batterica con MDA.

1. Coltura batterica
   1. Coltura del ceppo ATCC 35704 di C . scindens in brodo di clostridi rinforzato (RCB) utilizzando un brodo di glicerolo congelato per inoculare 500 μL di batteri in una provetta RCB da 7 mL. Coltivare anaerobicamente durante la notte a 37 °C.
   2. Utilizzare 500 μl di coltura batterica notturna per inoculare una nuova provetta RCB e incubare anaerobicamente per 24 ore. Rimuovere questo tubo dalla camera anaerobica e utilizzarlo per preparare il trattamento batterico per l'MDA. Utilizzare questa stessa provetta per calcolare le unità formanti colonie per millilitro (CFU/mL).
2. Calcolo di C. scindens CFU/mL
   1. Creare una diluizione 1:3 della coltura di C. scindens utilizzando 3,5 mL di coltura inoculata in 7 mL di terreno RCB. Utilizzare un campione di questa diluizione per ottenere un 20% di stock di glicerolo da 1 ml (1:1) che viene conservato a -80 °C.
   2. Piastra 100 μl della diluizione 1:3 su piastre di agar clostridiale rinforzato (RCA). Utilizzare la prima diluizione per poi effettuare le successive diluizioni seriali e placcare per un totale di altre tre volte.
   3. Dopo l'incubazione delle piastre RCA, contare le colonie e calcolare i CFU. Utilizzare la seguente equazione per calcolare la concentrazione di cellule batteriche nei campioni diluiti e originali:
      CFU in campione diluito (cellule/mL) = (numero di colonie contate sulla piastra RCA)/(quantità di campione diluito aggiunta alla piastra RCA in mL)
      CFU nel campione originale (cellule/mL) = (CFU nel campione diluito)/(diluizione della piastra RCA)
3. Preparazione del trattamento con C. scindens per l'MDA
   1. Combinare una soluzione di 50 μl (1,265 x 10,⁶ CFU/mL in questo esempio) di C. scindens + 50 μl di soluzione di latte condensato/acqua zuccherata.
      NOTA: Se è necessaria una CFU specifica, è possibile utilizzare un metodo alternativo di quantificazione delle cellule batteriche, come la creazione di una curva standard con misure di densità ottica (OD) a 600 nm.
4. Trattamento orale di topi con C. scindens mediante MDA
   1. Nei giorni 1-3, familiarizzare i topi con la soluzione di latte come descritto nella sezione 2 (sessione di formazione MDA).
   2. Il giorno 4, somministrare 100 μL di C. scindens + soluzione di latte o PBS (controllo) + soluzione di latte tramite MDA a topi C57BL/6J. Trattare i topi una volta per tutta la durata dello studio.
5. Raccolta di campioni fecali
   1. Tieni il topo con una collottola delicata e attendi che scarichino un pellet fecale. Raccogliere i pellet fecali direttamente dal retto in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 ml. Conservare i campioni a -80 °C fino al momento dell'uso.
6. PCR quantitativa (qPCR) di C. scindens
   1. Eseguire l'estrazione del DNA fecale utilizzando un protocollo precedentemente pubblicato^19,20.
   2. Determinare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorimetro per DNA per un rilevamento ad alta sensibilità. Normalizzare i campioni di DNA a 10 ng/μL e conservarli a -20 °C fino al momento dell'uso.
   3. Utilizzare la qPCR per studiare l'abbondanza di: (i) batteri C. scindens utilizzando primer conservati contro il gene desA del ceppo ATCC 35704 di C. scindens, (ii) batteri totali utilizzando primer progettati contro la regione ipervariabile V6 del gene batterico 16S rRNA come precedentemente descritto^20,21.
      NOTA: Le condizioni qPCR e i primer utilizzati sono elencati nella Tabella 1. Una curva standard utilizzando il DNA del ceppo ATCC 35704 di C. scindens è stata utilizzata per stimare le copie dei batteri desA+.

5. Esperimento di validazione #2 - somministrazione sperimentale di farmaci ai topi utilizzando MDA

NOTA: Questa sezione descrive l'uso del metodo MDA per somministrare un composto sperimentale ai topi. In questo esperimento pilota rappresentativo, il metabolita della soia equolo (S-equolo) viene somministrato a topi NSG e FVB/NJ.

1. Preparazione del trattamento con S-equolo
   NOTA: Sia l'S-equolo che il dimetilsolfossido (DMSO) vengono aliquotati e conservati a -20 °C fino all'uso.
   1. Ricostituire l'S-equolo in DMSO combinato con olio di mais (90%). Miscelare l'S-equolo aliquotato in olio di mais (220 μl) con 480 μl di soluzione di latte condensato/acqua zuccherata. Unire e mescolare questa soluzione nella stanza degli animali per evitare la separazione dell'olio dal latte.
      NOTA: Se si osserva la separazione della soluzione, mescolare la soluzione prima del trattamento. La dose di S-equolo somministrata è di 25 mg/kg/die. I topi utilizzati in questo studio avevano tutti un peso simile, quindi hanno ricevuto la stessa dose. Potrebbe essere necessario aggiustare la dose del trattamento e suddividerla in più preparazioni in base al peso dell'animale in studio.
   2. Combina il veicolo DMSO con l'olio di mais (90%). Miscelare il DMSO aliquotato in olio di mais (220 μl) con 480 μl della soluzione di latte condensato/acqua zuccherata. Unire e mescolare questa soluzione nella stanza degli animali per evitare la separazione dell'olio dal latte.
      NOTA: Se si osserva la separazione della soluzione, mescolare la soluzione prima del trattamento.
2. Trattamento orale di topi con S-equolo utilizzando MDA
   1. Nei giorni 1 e 2, familiarizzare i topi con la soluzione di latte come descritto nella sezione 2 (sessione di formazione MDA).
      NOTA: Per l'esperimento di convalida #1, è stato seguito il tempo di addestramento descritto in Scarborough et al., che suggeriva un tempo di acclimatazione di 3 giorni. In questo esperimento, è stato testato un tempo di allenamento più breve (2 giorni), e si è riscontrato che non alterava la somministrazione dei trattamenti di interesse.
   2. Nei giorni 3-43, trattare i topi con (i) controllo PBS, (ii) veicolo DMSO o (iii) S-equolo, il tutto combinato con la soluzione di latte condensato/acqua zuccherata. Effettuare una miscela master della soluzione per fornire una soluzione omogenea dei trattamenti a tutti gli animali dello studio. Somministrare un volume totale di 100 μl a ciascun topo una volta al giorno, 5 giorni alla settimana, per un totale di 43 giorni.
3. Prelievo di sangue
   1. Raccogliere il sangue dopo l'eutanasia (overdose di anidride carbonica) tramite puntura cardiaca. Trasferire il sangue in una provetta separatore di siero microtainer, mescolare e conservare a temperatura ambiente (RT) fino a ulteriore lavorazione.
   2. Centrifugare il campione di sangue per completare la separazione a 254 x g per 5 min. Raccogliere il siero (strato superiore di separazione) e conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.
4. Cromatografia liquida di S-equolo con saggio di spettrometria di massa tandem (LC/MS/MS)
   1. Fare riferimento alla tabella dei materiali file per le sostanze chimiche e i reagenti utilizzati per questo esperimento.
   2. Standard di taratura e controllo qualità: Preparare soluzioni madre di S-equolo e standard interno (equolo racemico-d4) in DMSO a concentrazioni di 1 mg/mL e conservare a -20 °C.
   3. Diluire le soluzioni standard madre con acetonitrile:acqua (50:50) per preparare una soluzione di lavoro mista con diverse concentrazioni. Preparare lo standard interno in acetato di etile come soluzione di estrazione ad una concentrazione di 100 ng/mL. Conservare le soluzioni di stoccaggio e di lavoro a 4 °C e utilizzarle quotidianamente, diluite o direttamente.
   4. Estrazione del campione
      1. Preparare il campione utilizzando la soluzione di precipitazione delle proteine mediante estrazione (acetato di etile più standard interno, cfr. punto 5.4.3), seguita dalla centrifugazione e dall'evaporazione del surnatante in azoto secco (50 °C).
      2. Ricostituire il campione in 100 μl di acetonitrile al 50% e trasferirlo in fiale dell'autocampionatore per l'analisi LC/MS/MS.
   5. Separazione dei campioni
      1. Ottenere la separazione con una colonna C18, 2,1x50 mm, 1,7 μm. Utilizzare lo 0,1% di acido formico come fase mobile A e lo 0,1% di acido formico nella fase mobile B dell'acetonitrile.
      2. Utilizzare un gradiente e mantenere la fase mobile B al 40% con una portata di 0,3 mL/min per 0,5 min. Quindi, aumentare la portata al 100% in 1 minuto, tenerla lì per 2 minuti e poi tornare al 40% B per 1 minuto.
      3. Monitorare l'effluente della colonna utilizzando un rivelatore a spettrometria di massa che utilizza la ionizzazione elettrospray, che funziona in modalità negativa. Programmare lo spettrometro per monitorare le seguenti transizioni di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM): 241 → 119,1 per l'S-equolo e 245 → 123 per lo standard interno, l'equolo-d4.
      4. Calcolare la curva di calibrazione per l'S-equolo utilizzando il picco del rapporto di area dell'analisi rispetto allo standard interno utilizzando un'equazione quadratica con una funzione di ponderazione 1/x² utilizzando gli intervalli di calibrazione di 5-500 ng/mL.

6. Misurare l'effetto del trattamento con MDA sul microbiota intestinale centrale

NOTA: Questa sezione descrive l'uso della qPCR per misurare i livelli di microbiota intestinale centrale dopo il trattamento con MDA.

1. Eseguire la raccolta del campione fecale e l'estrazione del DNA come descritto nei passaggi 4.5.1 e 4.6.1.
2. Determinare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorimetro per DNA per un rilevamento ad alta sensibilità. Normalizzare i campioni di DNA a 10 ng/μL e conservarli a -20 °C fino al momento dell'uso.
3. Utilizzare la qPCR per studiare l'abbondanza di membri del microbiota intestinale: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp. e (v) batteri totali utilizzando primer progettati contro la regione ipervariabile V6 del gene batterico 16S rRNA come precedentemente descritto 20,21,22.
   NOTA: Le condizioni qPCR e i primer utilizzati sono elencati nella Tabella 2.

Risultati

L'MDA può essere utilizzato nella somministrazione orale di ceppi batterici in modelli murini. I topi C57BL/6J sono stati trattati con antibiotici (cefoxitina nell'acqua potabile) per 2 giorni per eliminare le comunità microbiche commensali prima di iniziare la sessione di formazione MDA. La soluzione di latte/acqua condensata zuccherata è stata somministrata una volta al giorno consecutivamente per 3 giorni prima della somministrazione del trattamento. I topi sono stati brevemente trattenuti con una leggera collottola durante la somministrazione del trattamento con MDA. Il giorno 4, i topi sono stati trattati una volta con PBS (controllo negativo, n = 4) o una coltura anaerobica di C. scindens (batteri desA+, n = 4) che era stata precedentemente risospesa nella soluzione di latte condensato/acqua zuccherata. Tutti i topi generalmente hanno assunto i trattamenti in pochi secondi e hanno bevuto l'intera dose (100 μL). Per convalidare la consegna e la presenza dei batteri anaerobi, abbiamo confrontato i campioni fecali raccolti dopo il trattamento antibiotico con i campioni fecali raccolti 24 ore dopo il trattamento con PBS o C. scindens (Figura 1). Il DNA fecale è stato isolato, quantificato e normalizzato a 10 ng/μL per eseguire la qPCR utilizzando i primer specifici per il gene C . scindens ATCC 35704 desA (Tabella 1). Abbiamo osservato che i topi trattati con antibiotici avevano un batterio desA + minimo o nullo. Come previsto, abbiamo osservato una quantità sostanzialmente più elevata di batteri desA+ nei topi trattati con C. scindens, che era significativamente diversa da quelli del gruppo di controllo PBS (p = 0,0286, Figura 1).

Consegna di un composto sperimentale (S-equolo) utilizzando il metodo MDA. I topi NSG (n = 15) e FVB/NJ (n = 18) sono stati sottoposti a training con la soluzione di latte condensato zuccherato/acqua due giorni prima della somministrazione del trattamento. I topi NSG sono stati sottoposti a trattamento antibiotico (cefoxitina nell'acqua potabile) per eliminare i batteri intestinali produttori di equolo e, quindi, la produzione endogena di equolo. I topi FVB/NJ sono stati alimentati con una dieta priva di soia per eliminare la produzione endogena di equolo. Tutti i topi sono stati brevemente trattenuti con una leggera collottola per somministrare i trattamenti. Il gruppo di controllo ha ricevuto la soluzione di latte/acqua condensata zuccherata in combinazione con olio di mais, il gruppo DMSO (controllo del veicolo per l'S-equolo) ha ricevuto la soluzione di latte/acqua condensata zuccherata e il DMSO in olio di mais e il gruppo equolo ha ricevuto una soluzione di latte/acqua condensata zuccherata ed equolo in olio di mais. I topi sono stati trattati cinque giorni alla settimana con la tecnica MDA per un totale di 43 giorni. I topi generalmente assumevano i trattamenti in pochi secondi e bevevano l'intera dose (100 μL). Nel complesso, tutti i topi hanno consumato almeno la metà della dose in un determinato giorno (dose parziale in un determinato giorno, ma dose completa il giorno prima o il giorno successivo). Nessuno dei topi ha rifiutato completamente il trattamento nel corso dello studio. Abbiamo osservato che dopo la collottola, posizionare i topi sulla schiena ha migliorato il tempo di consumo del trattamento e ha assicurato che l'animale assumesse l'intera dose.

I livelli di equolo circolanti dimostrano un'efficace somministrazione di farmaci MDA. I campioni di sangue sono stati prelevati dai topi NSG dopo l'eutanasia alla fine dello studio per convalidare che la somministrazione di equolo da parte dell'MDA ha portato alla circolazione dei livelli di equolo negli animali dello studio. Non abbiamo recuperato abbastanza sangue da uno dei topi trattati con equolo per eseguire il test LC/MS/MS. I livelli sierici di equolo sono stati misurati mediante LC/MS/MS presso l'Analytical Pharmacology Shared Resource presso la Johns Hopkins University School of Medicine. Non abbiamo osservato equolo circolante nei gruppi di controllo e DMSO (veicolo dell'equolo), mentre i topi trattati con equolo avevano equolo circolante rilevabile (Figura 2). È importante sottolineare che ci aspettiamo alcune variazioni nei livelli di equolo circolanti nei topi trattati con equolo a causa di date e orari diversi di sacrificio animale in questo esperimento.

Le comunità microbiche intestinali rimangono invariate dopo il trattamento con MDA. L'effetto della soluzione di latte MDA (con e senza equolo) sul microbiota intestinale è stato valutato utilizzando i topi FVB/NJ. Abbiamo quantificato la composizione microbica dei campioni prelevati al basale (nessun trattamento/nessun MDA) e dei campioni prelevati 7 giorni dopo l'inizio del trattamento (9 giorni dopo l'inizio dell'MDA, compresi i giorni di formazione). Non sono stati osservati cambiamenti significativi nella carica batterica totale o nella composizione microbica complessiva del microbiota intestinale centrale (Akkermansia muciniphila, Bifidobacterium spp., Streptococcus salivarius, Lactobacillus spp.) come valutato mediante analisi qPCR specie-specifica (Figura 3) come precedentemente descritto^21,22. Una gabbia ha mostrato una differenza significativa di Lactobacillus tra il basale e dopo il trattamento con MDA; tuttavia, questo risultato è stato osservato nel controllo del veicolo DMSO e non era coerente in tutte le gabbie.

Figura 1: L'MDA rilascia batteri anaerobi nell'intestino del topo che possono essere quantificati tramite qPCR fecale. I topi C57BL/6J sono stati trattati con antibiotici per due giorni consecutivi nell'acqua potabile. I topi sono stati quindi trattati con il batterio anaerobio C. scindens utilizzando il metodo MDA. La carica batterica fecale di C. scindens (desA+) è stata misurata mediante qPCR per il gene desA sia dopo il trattamento antibiotico che 24 ore dopo il trattamento con MDA (PBS o C. scindens). (A) La quantificazione del gene desA specifica per C. scindens è dimostrata tra topi trattati con PBS e C. scindens dopo il trattamento antibiotico e 24 ore dopo il trattamento con MDA. (B) Gli stessi dati mostrati per 24 ore dopo l'MDA in (A) sono mostrati come un grafico a colonne. La significatività statistica è stata determinata utilizzando un test di Mann-Whitney non parametrico. (*) p = 0,0286, barre di errore = SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi dei livelli di equolo circolanti in topi NSG trattati con equolo tramite la tecnica MDA. I livelli sierici di equolo sono stati quantificati tramite LC/MS/MS nei topi trattati con controllo (n = 5), DMSO (veicolo, n = 5) ed equolo (n = 4). Non è stato recuperato abbastanza sangue da uno dei topi trattati con equolo per eseguire LC/MS/MS. Questi trattamenti sono stati somministrati utilizzando il metodo MDA. L'equolo sierico era rilevabile solo nel gruppo trattato con equolo. Il limite di quantificazione < 5 ng/mL. La significatività statistica è stata determinata utilizzando un'ANOVA unidirezionale non parametrica con confronti multipli (correzione di Dunn). (**) p = 0,0053, barre di errore = SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: I batteri intestinali centrali e i livelli di carica batterica totale sono invariati nei topi FVB/NJ dopo il trattamento con MDA. Non sono stati osservati cambiamenti significativi nei valori di qPCR Cq per le comunità microbiche target prima e dopo la somministrazione del trattamento con il metodo MDA. Il Lactobacillus ha mostrato una differenza significativa (*, p = 0,0321) solo nella gabbia 3 tra il basale e il trattamento con MDA. Questo risultato non era coerente tra le gabbie. I numeri della gabbia sono contrassegnati come C1-C4. La significatività statistica è stata determinata utilizzando un'ANOVA unidirezionale con confronti multipli (correzione di Tukey). Barre di errore = SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome del primer	Sequenze di primer	Condizioni PCR
DesA_CS_F	5'-GGACAGGGTCGGCTTTATG-3'	93 °C 3 min, 34 cicli (95 °C 30 s, 54 °C 30 s)
DesA_CS_R	5'-TTACTTCACCTTCGCCAGTTTCTG-3'

Tabella 1: Primer e condizioni qPCR per i batteri desA+ (C. scindens).

Nome del primer	Sequenze di primer	Condizioni PCR
V6_F V6_R	5'-CAACGCGWRGAACCTTACC-3' 5'-CRACACGAGCTGACGAC-3'	95 °C, 3 min 36 cicli 95 °C, 30 s 53 °C, 30 s
A.muc_F A.muc_R	5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3' 5'-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3'	50 °C, 5 min 95 °C, 10 min 40 cicli 95 °C, 15 s 60 °C, 1 min
Bifido_F Bifido_R	5'-CGGGTGAGTAATGCGTGACC-3' 5'-TGATAGGACGCGACCCCA-3'	95 °C, 3 min 36 cicli 95 °C, 30 s 53 °C, 30 s
S. salivarius_F S. salivarius_R	5'-CACGCCATGCTGGAAGTG-3' 5'-GCGATGAGCCAAGCTGAAG-3'	95 °C, 10 min 44 cicli 95 °C, 15 s 60 °C, 1 min
Lacto_F Lacto_R	5'-TGGAAACAGRTGCTAATACCG-3' 5'-GTCCATTGTGGAAGATTCCC-3'	50 °C, 2 min 95 °C, 10 min 40 cicli 95 °C, 15 s 62 °C, 1 min

Tabella 2: Primer e condizioni qPCR utilizzate per misurare l'effetto dell'MDA sul microbiota intestinale centrale.

Discussione

L'OG può essere una fonte significativa di stress negli animali da ricerca che può creare una variabile confondente, come precedentemente valutato in diversi studi 7,9,11,12,13,14,15,23. A causa dell'invasività dell'OG, sono state impiegate tecniche alternative per ridurre al minimo le sfide associate all'OG 9,10,12,13,14,15. La somministrazione di farmaci guidata da micropipette (MDA) è una nuova tecnica che consente la somministrazione del farmaco in modo meno invasivo utilizzando una pipetta a canale singolo e una miscela del farmaco di interesse con una soluzione di latte condensato zuccherato⁷. Un passaggio critico per questa tecnica è la sessione di addestramento (minimo 2 giorni) che consente all'animale di acquisire maggiore familiarità con la punta della pipetta e il sapore del latte condensato zuccherato e, nel complesso, riduce i tempi di manipolazione e l'angoscia. Questa sessione di allenamento consente inoltre ai topi di consumare prontamente i farmaci incorporati nella soluzione di latte condensato zuccherato molto più velocemente rispetto ad altre tecniche e con un dosaggio preciso.

I nostri studi hanno seguito da vicino la preparazione e la somministrazione della soluzione di latte condensato/acqua zuccherata presentata in Scarborough et ^al.7. Durante la durata dello studio, i topi non sono stati privati di acqua o cibo prima della somministrazione. Sono stati tenuti nelle rispettive gabbie di stabulazione e la tempistica dei trattamenti è stata inferiore a 1 minuto. Una differenza fondamentale nei nostri studi è stata che, probabilmente a causa del potenziale di disabilità visiva nei ceppi di topi albini che abbiamo utilizzato e del potenziale di leggera avversione al gusto con il trattamento farmacologico, tutti i topi hanno richiesto una breve contenzione con una leggera collottola come parte del protocollo di addestramento e trattamento. Questa modifica ai trattamenti con MDA è raccomandata da Vanhecke et ^al.16. La collottola delicata, insieme al posizionamento dei topi sulla schiena, ha incoraggiato i topi a consumare avidamente la soluzione di latte. Concludiamo che la necessità di strofinare delicatamente come parte delle fasi di formazione e trattamento è facoltativa e dipenderà dallo studio. La somministrazione dei trattamenti (corretti per il peso corporeo dell'animale, a seconda dei casi) è stata somministrata in un volume standardizzato e i topi non hanno mostrato cambiamenti nel comportamento. Altre lievi modifiche allo studio iniziale⁷ includevano una diminuzione del numero di sessioni di allenamento e dei volumi somministrati ad ogni sessione. Alcune delle limitazioni che abbiamo riscontrato in questo studio includono la resistenza di alcuni topi a bere l'intera dose (100 μL) della soluzione di latte il primo giorno di allenamento e in momenti durante lo studio. Questo è stato superato posizionando i topi sulla schiena mentre venivano trattenuti. Questo studio non ha valutato l'interazione del farmaco con la soluzione di latte condensato zuccherato, le differenze nel consumo tra i sessi dei topi (sebbene l'MDA abbia precedentemente dimostrato di essere efficace anche nei topi femmine ^7,17) o l'aumento dei marcatori di stress, come i livelli di corticosterone ^7,11,14, associati all'OG.

In questo studio, ci siamo concentrati sulla capacità della tecnica MDA di erogare una dose precisa di un trattamento sperimentale e quindi abbiamo valutato i livelli fecali e/o circolanti dei trattamenti di interesse negli animali in studio. Allo stesso modo, abbiamo valutato se il trattamento con MDA altera il microbiota intestinale e abbiamo osservato alterazioni minime o nulle nel microbiota fecale centrale o nella carica batterica fecale totale degli animali in studio. Allo stesso modo, non abbiamo osservato lesioni negli animali a causa del trattamento con MDA. In conclusione, l'MDA può fungere da metodo alternativo per la somministrazione di trattamenti a breve e lungo termine nei modelli di roditori. Nel complesso, l'MDA è in grado di avere un impatto positivo sul benessere degli animali riducendo il rischio di lesioni associate agli OG. L'MDA supera alcuni dei limiti di altre tecniche e proponiamo che possa essere ampiamente utilizzato nella ricerca traslazionale in molti diversi modelli di roditori²⁴.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
200 µ L puntali per pipette	Mettler Toledo	17005860
AB SCIEX Triple QTRAP 5500 rivelatore per spettrometria di massa	Sciex	N/A
Akkermansia muciniphila ceppo muc genomico DNA	di tipo americano Collezione di colture	BAA-835D-5
Acetato di ammonio	Sigma– Aldrich	5.43834
C57BL / 6J topi	Jackson Laboratories	ceppo # 000664
C. scindens< / em> ceppo 35704	American Type Culture Collection	35704
Cefoxitin	Sagent	NDC25021-109-10
Olio di mais	MedChemExpress	HY-Y1888
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
etanolo	Fisher Scientific	AC611050040
Acido formico	Sigma... Aldrich	5.33002
FVB/NJ topi	Jackson Laboratories	Ceppo # 001800
Glicerolo	Sigma– Aldrich	G5516
Hexane	Fisher Scientific	02-002-996
Acqua di grado LC-MS	Fisher Scientific	14-650-357
Metanolo	Fisher Scientific	02-003-340
Tubo separatore di siero Microtainer	Becton Dickinson	02-675-185
Acqua di biologia molecolare	Corning	46-000-CI
NSG topi	Jackson Laboratories	Strain# 005557
PBS	Corning	21-031-CV
Qubit DNA HS kit	Invitrogen	Q32851
Racemico  equol-d4	Santa Cruz Biotechnology	sc-219827
agar clostridiale rinforzato	Sistemi anaerobi	AS-6061
Brodo clostridiale rinforzato	Sistemi anaerobi	AS-606
S-equolo	MedChemExpress	HY-100583
Standard di riferimento S-equolo per LC-MS	Cayman Chemical	10010173
singolo pipetta a canale	Rainin	17008652
Streptococcus salivarius DNA genomico	Collezione di colture di tipo americano	BAA-1024D-5
Latte condensato zuccherato	California Farms	B09TGQ7WV8
VSL#3 VSL	#3	B07WX1LVHL
β-glucuronidasi da Helix pomatia	Sigma– Aldrich	G7017