Articolo metodologico

Il protocollo Mouse Stroke Unit con punteggio neurologico standardizzato per studi traslazionali sull'ictus del topo

DOI:

10.3791/66847

⸱

7 febbraio 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology Medical School of Athens, National and Kapodistrian University of Athens, 2Institute for Stroke and Dementia Research (ISD), University of Munich Medical Center, 3Department of Neurointensive Care, Schoen Clinic Bad Aibling

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo presenta un protocollo per l'esecuzione del concetto di Stroke Unit (mSU) di topo altamente traslazionale e testato in modo indipendente in topi a grande corsa. Fornisce inoltre un protocollo standardizzato per l'esecuzione della scala sperimentale focale dell'ictus nei topi, che valuta i deficit focali dell'ictus rilevati anche a lungo termine.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il modello a filamento di occlusione dell'arteria media (fMCAo) è forse il modello di ictus del topo più traslazionale, che consente un'ischemia controllata con riperfusione/ricanalizzazione intravascolare. Tuttavia, manca di allineamento con gli attuali progressi clinici per la cura dell'ictus (ad esempio, Stroke Units), di solito impiega punteggi neurologici soggettivi o vaghi tra i laboratori e mostra un'elevata mortalità in fase acuta. In questo caso, risolviamo queste limitazioni con protocolli videoguidati convalidati. Presentiamo il protocollo mSU (Stroke Unit) del topo con video didattici e un algoritmo decisionale (Risk Stratification Score), colmando il divario tra la modellazione clinica e quella dell'ictus nel topo. Per aumentare l'accuratezza e la sensibilità del punteggio neurologico dell'ictus, presentiamo per la prima volta un formato video-standardizzato della Experimental Stroke Scale focale (fESS) e ne dimostriamo il valore fino a 6 mesi dopo l'ictus. Inoltre, vengono presentati i protocolli per il test Ladder-rung dei topi, così come il noto test del cilindro, per una valutazione quantitativa imparziale della funzione motoria degli arti. I risultati evidenziano l'efficacia traslazionale dell'mSU. L'ESS focale (fESS) eccelle rispetto ad altre scale note nel rilevare i deficit di ictus focale, catturare il recupero e mantenere la sensibilità fino a 6 mesi dopo l'ictus. I test a pioli e cilindri quantificano e monitorano oggettivamente i deficit motori degli arti anteriori e posteriori, a lungo termine. In sintesi, l'integrazione di mSU, fESS e test di funzionalità motoria fornisce un quadro solido per indagini sull'ictus clinicamente rilevanti. I nostri protocolli migliorano il valore traslazionale nella ricerca sull'ictus del topo.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'ictus ischemico di grandi dimensioni è una delle principali cause di morbilità e disabilità in tutto il mondo1. Tuttavia, la ricerca sull'ictus del topo si trova di fronte a un blocco traslazionale in quasi tutti i trattamenti preclinicamente testati finora2. Le molteplici ragioni di questo problema e gli sforzi per superarlo sono stati esaminati in dettaglio nella precedente pubblicazione2. Queste sfide derivano dalla limitata integrazione dei progressi clinici nei modelli animali rilevanti2 e dalle debolezze dei sistemi di punteggio comportamentali e neurologici nel rilevare i deficit post-ictus in modo accurato e sensibile2.

Recenti scoperte3 supportano che il modello a filamento di occlusione dell'arteria media (fMCAo) nei topi ha significativi vantaggi traslazionali rispetto ad altri modelli con lesioni craniche aperte e traumi 2,4. Inoltre, questo è l'unico che modella la riperfusione e la trombectomia meccanica delle impostazioni cliniche dell'ictus 5,6,7. Tuttavia, il modello affronta un'elevata mortalità subacuta tra 3-7 giorni dopo l'ictus, il che vieta studi a lungo termine di grandi ictus ed è stato considerato fino a poco tempo fa l'artefatto intrinseco e insormontabile del modello. Inoltre, il rilevamento di deficit neurologici post-ictus è relativamente difficile e distorto nei topi a causa delle loro piccole dimensioni, specialmente tra i non clinici o i ricercatori inesperti 8,9. Per affrontare questo problema, diversi gruppi hanno sviluppato varie scale per rilevare i deficit. Le scale più utilizzate e conosciute includono la scala di Bederson a 3 punti (BS)10, la scala di Bederson modificata a 5 punti (mBS)11, il punteggio Longa a 5 punti (LS) (che è simile a mBS)6, la scala dell'ictus neurologico modificata (mNSS)12,13, la scala Garcia a 18 punti (GS)9 e la più dettagliata DeSimoni14 o altrimenti nota come "Neuroscore" (NS)9, Scala 15. Sfortunatamente, alcune di queste scale sono troppo grezze e sono limitate solo ai pochi giorni di fase acuta successivi all'ictus (BS, mBS e LS)8,9 o la loro interpretazione è offuscata da deficit generali (NS).

Con questo background, abbiamo precedentemente sviluppato e convalidato il protocollo di supporto mSU (Stroke Unit) del topo, insieme alla scala sperimentale della corsa (ESS) per i topi13. La logica della mSU era quella di adattare le conoscenze della routine clinica (cioè le unità di ictus umano) alla ricerca preclinica sull'ictus, mentre l'ESS consolidava criticamente le scale di ictus precedentemente esistenti ma "insensibili" o ridondanti in una pratica, raffinata, sensibile ed efficiente in termini di tempo. L'mSU consiste in un monitoraggio frequente e adattato dei parametri clinici di base del topo con un'applicazione adattata del supporto animale per migliorare la sopravvivenza13.

Infatti, i dati del nostro laboratorio e di altri verificano il valore di entrambi i metodi. L'mSU traduce le misure cliniche di supporto di base e avanza7 dall'uomo ai topi, riduce significativamente la mortalità dell'fMCAo nei topi dal 60-70% al 10-15%13 consentendo così studi su ictus più grandi e può essere efficacemente applicato in laboratori indipendenti da allora 16,17,18,19. Inoltre, l'ESS è in grado di distinguere tra deficit e sintomi post-ictus focali (componente focale di ESS, fESS) e generali (componente generale di ESS, gESS), modella il punteggio clinico umano (differenziazione tra segni e sintomi focali e generali nell'uomo), è linearmente correlato alle dimensioni della lesione da ictus ed è sensibile a lungo termine ai deficit13,20. Tuttavia, nonostante il valore e l'efficacia comprovati sia dell'mSU che dell'ESS, la mancanza di istruzioni chiare, visualizzate e standardizzate anche per i ricercatori inesperti lascia diverse domande aperte sull'applicazione dell'mSU e una significativa soggettività sul punteggio dei deficit focali su fESS.

Pertanto, il nostro presente articolo mira a fornire istruzioni chiare e videoassistite per i protocolli mSU e fESS. Crediamo fermamente che supporterà i ricercatori sull'ictus ad aumentare l'efficienza traslazionale dei loro studi sull'ictus, ridurre significativamente la perdita di animali durante i primi 3-10 giorni dopo l'ictus, ridurre i costi della sperimentazione e, infine, valutare in modo riproducibile i deficit neurologici per mesi dopo l'ictus13. Inoltre, la combinazione aggiuntiva del test del piolo a scala e del cilindro può facilmente quantificare la paresi focale degli arti (arti anteriori e posteriori) dovuta a fMCAo.

Per mostrare l'efficienza di mSU e fESS, forniamo dati a medio (14 giorni) e a lungo termine (6 mesi) sui topi dopo fMCAo. Topi maschi C57Bl/6J di dodici settimane (n= 31) sono stati utilizzati e alloggiati a temperatura controllata (22 ± 2 °C), con un periodo di ciclo luce-buio di 12 ore e accesso a cibo pellettato e acqua ad libitum. I topi sono stati divisi in due coorti seguite rispettivamente per 14 giorni (n=10, coorte 1) e 6 mesi (n=15, coorte 2). Questi topi sono stati sottoposti a un'ischemia cerebrale di 60 minuti utilizzando il modello ben descritto di fMCAo 13,20,21 in anestesia con isoflurano. Gli animali operati con sham (n=6, operati come le due coorti precedenti, ma non è stata indotta alcuna ischemia) seguiti per 6 mesi sono serviti come controlli. La buprenorfina è stata utilizzata come analgesico pre e 3 giorni dopo l'intervento. I test del gradino e del cilindro Ladder sono stati eseguiti anche per la coorte di 6 mesi come parte del punteggio neurologico.

Tutti gli animali sono stati controllati quotidianamente per gli endpoint umanitari durante i primi 14 giorni dopo l'ictus, definiti come: 1) grave ipotermia (<33 °C) e/o immobilità (ad esempio, punteggio 4 nel test 6 di fESS o test di "attività spontanea" di gESS) che non è stata migliorata dal trattamento "Stroke Unit di topo" (ad esempio, riscaldamento passivo e alimentazione attiva, vedi 1.4, 1,6, 1,8) entro un'ora, 2) segni di dolore o comportamento ansioso (ad es. punteggio >2 nel test "ansia/comportamento automatico" di gESS), anche dopo analgesia post-operatoria come da protocollo.

In questo protocollo, il supporto post-ictus dei topi sotto forma di mSU inizia immediatamente dopo il recupero del topo dall'operazione fMCAo. Questo ha 3 fasi: fase A (0-48 ore dopo la riperfusione), fase B (>48 ore e fino alla "fine del supporto attivo necessario", di solito al giorno 10-14, a seconda della fase B del singolo animale) e fase C (dal giorno 14 in poi). Ha cinque interventi significativi (visite/punteggio di stratificazione del rischio, alimentazione, fluidi, temperatura e disinfezioni locali; vedi da 1.1 a 1.8. di seguito) su misura per ogni animale, in base a ciascuna fase (A, B o C) e al suo stato clinico effettivo giornaliero valutato dal punteggio di stratificazione del rischio (RSS), vedi Figura 1 supplementare e Tabella 1 con tre esempi tipici. I materiali e gli strumenti necessari per l'mSU sono mostrati nella Figura 1a e descritti nella Tabella dei materiali. Forniamo anche un modello per il monitoraggio degli animali durante l'mSU (vedi File supplementare 1).

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Protocollo

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Gli esperimenti riportati in questo articolo sono stati condotti seguendo le linee guida nazionali ed europee per l'uso di animali da esperimento e sono stati approvati dai comitati governativi greci (Atene, Licenza n. "843895_06-09-2022").

1. L'"unità di corsa del mouse" (mSU)

  1. Valutare quotidianamente lo stato clinico dell'animale ("visite") e calcolare il suo punteggio RSS
    1. Stampare il File Supplementare 1, preferibilmente prima dell'intervento chirurgico dell'animale, per la registrazione dei dati e il monitoraggio.
    2. Valutare clinicamente ogni animale in orari standard (visite): la mattina presto (intorno alle 08:00), a mezzogiorno (tra le 14:00 e le 16:00) e a tarda notte (intorno alle 22:00 - 23:00).
      NOTA: Adattare queste visite standard in base alla fase di follow-up dell'animale: controllare lo stato dell'animale 2 volte al giorno (mattina-sera) per la Fase A, 3 volte al giorno per la Fase B e una volta al giorno per la Fase C. Adattare ulteriormente la frequenza delle visite in base al punteggio RSS (vedi 1.1.6). Lavorare preferibilmente in un team di >2 persone per ridurre il carico di lavoro. Le visite mattutine e notturne sono fondamentali per il successo, il supporto, il monitoraggio e la riduzione della mortalità perché la fase notturna (attiva) dei topi aumenta le richieste metaboliche ed energetiche 13,22,23 ed è collegata all'aumento della mortalità notturna post-ictus.
    3. Pesare il mouse utilizzando una bilancia standard sensibile durante la visita mattutina.
    4. Misurare la temperatura con un termometro senza contatto posizionato sopra il centro ventrale del corpo durante la visita mattutina. Tieni premuto e immobilizza il mouse con la schiena. Effettuare la lettura entro i primi secondi dopo l'immobilizzazione (vedere la Figura 1f).
      NOTA: Non utilizzare un termometro rettale a causa di una potenziale rottura intestinale dopo misurazioni ripetute con peritonite concomitante.
    5. Valutare e registrare le condizioni cliniche generali del topo (mobilità, ferite, cappuccio uretrale, reattività, pelo, stato di idratazione, ecc.) durante la visita mattutina per tutte le fasi, ogni giorno fino al giorno 14.
    6. Calcola il punteggio RSS durante la visita mattutina sommando i punti in base al peso, alla temperatura e al punteggio fESS dell'animale, come descritto nella Figura 1 supplementare. Per il calcolo automatico dell'RSS in una tabella di fogli di calcolo, utilizzare e adattare la formula che si trova nella Tabella 1. Eutanasia dell'animale con un metodo approvato dall'istituto, se sono presenti endpoint umanitari (vedi sopra).
    7. Adattare sia la frequenza delle visite che l'intensità del supporto, quotidianamente in base al punteggio RSS e alla fase post-ictus dell'animale.
      NOTA: La fase B è la più critica per la mortalità. Aumentare la frequenza delle visite e l'intensità del supporto per RSS ≥3 (per la definizione e le istruzioni, vedere la Tabella 1). Se l'animale continua a mostrare un RSS >3 nella Fase C, visitalo e supportalo come nella Fase B. Usa l'RSS e le descrizioni generali (come recupero, stabile, malattia bassa/media e malattia critica) per descrivere le sue condizioni cliniche all'interno del team di supporto. Dopo il 14° giorno, ridurre le visite degli animali solo a quelle richieste dal protocollo sperimentale (ad es. per valutazioni comportamentali/neurologiche).
  2. Preparazione del cibo in gel per il supporto nutrizionale
    1. Polverizzare i comuni pellet di cibo utilizzando un frullatore (Figura 1a).
    2. Aggiungi zucchero commerciale al 5-10% per aumentare il contenuto calorico dell'alimento.
    3. Aggiungere acqua per creare una consistenza liquida gelatinosa (Figura 1b).
    4. Usa questo alimento in gel per un supporto nutrizionale sia passivo che attivo.
      NOTA: Opzionalmente, utilizzare un alimento in gel commerciale pronto all'uso. Il cibo preparato può rimanere in frigorifero per 2-3 giorni.
  3. Supporto nutrizionale passivo dei topi
    1. Riempi una capsula di Petri con cibo in gel e posizionala sul pavimento della gabbia (supporto nutrizionale passivo mediante fornitura di cibo in gel per un facile accesso al topo). Lascia 2-3 pellet di cibo accanto alla capsula di Petri.
    2. Rinfrescare quotidianamente la capsula di Petri con cibo in gel. Durante i primi giorni, i topi possono riempire o coprire la capsula di Petri con lettiera in gabbia. Alcuni inizieranno a mangiarsene (Figura 1c).
  4. Supporto nutrizionale attivo (alimentazione attiva)
    NOTA: L'alimentazione attiva avviene durante la Fase B. La frequenza di alimentazione standard è di 3 volte al giorno e viene adattata a più volte in base al punteggio RSS (ad esempio, anche 4-5 volte al giorno). Occasionalmente, per i topi che hanno costantemente un punteggio RSS di 0-1 (cioè un piccolo ictus) e mangiano attivamente da soli, riduci la frequenza a 1-2 / giorno.
    1. Pre-riempire le siringhe da 1 ml con gel alimentare.
    2. Afferrare e tenere il topo delicatamente ma saldamente dal pelo del collo, come mostrato nella Figura 1d (punta di freccia rossa).
    3. Stabilizzare la guancia del mouse con il dito medio, come mostrato dalle frecce rosse nella Figura 1d: tenendo saldamente il mouse, far scorrere il dito lateralmente verso il naso del topo contro la sua guancia. Mantieni la posizione.
    4. Posizionare la punta della siringa nella bocca del topo tra i denti e dirigere la punta verso il lato interno della guancia (freccia rossa, Figura 1e).
    5. Somministrare circa 40-50 μL di cibo in gel ogni volta (un boccone).
    6. Rimetti delicatamente il mouse nella griglia della gabbia. Lasciare il tempo per la masticazione.
    7. Ripetere la somministrazione dopo 1-2 minuti, fino a quando ogni topo non ha mangiato 1-1,5 ml di cibo in gel.
      NOTA: Nutrire 5-10 topi per corsa (1-2 gabbie); Gli altri mangiano e ingoiano il cibo in gel mentre a ogni topo viene dato un boccone. Il processo non conferisce stress ai topi. È stato anche osservato che alcuni animali alla fine si posizionano per afferrare e nutrirsi.
  5. Normale integrazione salina
    1. Pesare il topo durante la visita mattutina (vedi 1.1.2 e 1.1.3).
    2. Calcola la sua perdita/aumento di peso rispetto alla misurazione precedente sottraendo i valori.
    3. Integrare il suo deficit di peso (in grammi) con ml di soluzione fisiologica normale (per via sottocutanea).
      NOTA: Evitare a tutti i costi il sovraccarico di liquidi e l'edema. Non superare 1-2 ml per dose e 3-4 ml di liquidi al giorno. Inizia dopo 36 ore post-fMCAo.
  6. Integrazione di glucosio
    1. Controlla il punteggio RSS calcolato del mouse e il suo movimento complessivo.
    2. Iniettare 0,5 - 1 mL di glucosio al 5% per via sottocutanea se RSS >3 e il topo mostra segni concomitanti di ipotermia (<34°C) o immobilizzazione/bradicinesia. Iniettare preferibilmente solo durante la visita notturna.
      NOTA: Evitare a tutti i costi l'iperglicemia dopo l'ictus. L'iperglicemia post-ictus è tossica7. Pertanto, integrare il glucosio solo dopo l'alimentazione attiva e in caso di grave condizione clinica o per prevenire l'ipoglicemia durante l'attività notturna. L'alimentazione attiva (vedi 1.4) dovrebbe essere la principale misura di supporto, in quanto fornisce un supporto energetico più fluido e duraturo e traduce le linee guida cliniche 7. Non integrare il glucosio prima del giorno 3.
  7. Gestione della temperatura (passiva)
    1. Misurare la temperatura corporea superficiale dell'animale prima dell'intervento al basale e dopo l'intervento ad ogni visita (Figura 1a). Misurare come mostrato nella Figura 1f e descritto in 1.1.4. Annotare i valori.
      NOTA: L'ipotermia nei topi è definita come la temperatura corporea <35 °C 24,25. I dati precedenti13 indicano che qualsiasi temperatura inferiore a 34 °C è un segnale di avvertimento per il supporto dopo l'ictus (vedi sotto).
    2. Quando si osserva ipotermia tra 33 e 34 °C, riscaldare passivamente il topo in una gabbia su una piastra riscaldante (o qualsiasi altro dispositivo di riscaldamento passivo) fino a raggiungere una temperatura corporea >34 °C. Nutrire attivamente il topo per fornire energia per la produzione attiva di calore da parte dell'animale (fornitura di energia più duratura).
      NOTA: Tenere l'animale in riscaldamento passivo per 1 o alcune ore. Evita a tutti i costi l'ipertermia passiva.
    3. Quando si osserva ipotermia, <33 °C, aumentare il supporto con un'ulteriore somministrazione di glucosio per via sottocutanea (apporto di energia rapido ma di breve durata; vedere 1.6 sopra).
  8. Pulizia dei genitali e/o della ferita al collo ("disinfezione" locale)
    NOTA: Occasionalmente, si può osservare una deiscenza della ferita o un tappo uretrale. La deiscenza della ferita è rara. Il tappo dell'uretra è un tappo duro sulla punta dei genitali del topo (Figura 1g) e si osserva più comunemente, specialmente negli animali con una maggiore gravità dell'ictus. Quando l'ostruzione ostruisce l'uretra, può verificarsi una sindrome urinaria ostruttiva che può portare a morbilità e morte26. Pertanto, dovrebbe essere pulito bene.
    1. Immergere il tappo uretrale, se presente, con soluzione fisiologica normale per facilitarne la rimozione.
    2. Rimuovere delicatamente il tappo uretrale con un piccolo tampone o una semplice pinzetta ad ogni controllo/visita dell'animale. Disinfettare l'uretra utilizzando un manometro o un tampone, imbevuto di una soluzione antisettica.
    3. Se è presente una deiscenza della ferita, disinfettarla localmente con qualsiasi soluzione antisettica chirurgica comune (ad es. Octanisept) e suturare regolarmente la ferita utilizzando preferibilmente una sutura di seta 5/0.

2. La componente focale della Experimental Stroke Scale (fESS)

  1. Preparare il campo di prova
    1. Pulire un banco con alcol al 70% per rimuovere gli stimoli esterni (ottici o odori) e preparare i materiali di prova, come mostrato nella Figura 2a.
    2. Stampa il foglio di punteggio ESS fornito come file supplementare 2 e segui i test uno per uno.
  2. Paresi degli arti anteriori (Test 1)
    1. Solleva e tieni delicatamente il mouse dalla base della coda.
    2. Controllare e valutare visivamente l'estensione in avanti simmetrica e la mobilità simmetrica degli arti anteriori mentre il mouse si muove (Figura 2c).
    3. Punteggio in base ai risultati visivi come segue: 0 per l'estensione e il movimento normali e simmetrici degli arti anteriori; 1 per "lieve asimmetria" definita come lieve flessione e/o riduzione del movimento dell'arto controlesionale o rigidità dell'arto; 2 per "marcata flessione" dell'arto controlesionale; 3 per l'aderenza dell'arto controlesionale al tronco; Punteggio 4 per nessun movimento del corpo o degli arti.
      NOTA: Il test rileva la paresi dell'arto anteriore controlesionale. Fa anche parte delle scale BS, LS, mNSS e NS. Il punteggio 1 può essere difficile da definire a causa delle manovre di fuga dell'animale.
  3. Paresi degli arti posteriori (Test 2)
    1. Continua a tenere il mouse per la base della coda, come descritto Test 1.
    2. Controllare visivamente l'estensione e il movimento simmetrici degli arti posteriori e delle dita dei piedi (Figura 2c).
    3. Punteggio in base ai risultati come segue: 0 per posizione/estensione simmetrica normale e movimento degli arti posteriori e delle dita dei piedi; 1 per una chiara asimmetria, quando il movimento è significativamente diminuito e la posizione/estensione asimmetrica dell'arto posteriore controlaterale (destro) (Figura 2d).
      NOTA: Il test rileva la paresi dell'arto posteriore controlesionale. Fa anche parte della scala mNSS. Questo test può essere difficile da valutare con precisione.
  4. Simmetria del tronco (Test 3)
    1. Continua a tenere il topo per la base della coda (seguendo 2.3.) e valuta i suoi movimenti del tronco.
    2. Punteggio in base ai risultati come segue: 0 per normale, nessuna flessione del tronco o lieve flessione/movimento simmetrico del tronco su entrambi i lati (come manovra di "fuga"); 1 per una marcata flessione testa/tronco (>30°) prevalentemente controlesionaria (a destra), entro i primi 10 secondi dal mantenimento.
      NOTA: Il test rileva l'asimmetria dovuta a lesioni motorie unilaterali. Fa anche parte del punteggio mNSS.
  5. Comportamento in cerchio (Test 4)
    1. Posiziona delicatamente il mouse su una superficie piana e lascialo muovere liberamente per almeno 1 minuto. Osserva il suo schema di movimento.
    2. Punteggio in base ai risultati come segue: 0 per il movimento esplorativo, vivido e lineare senza comportamento circolare; 1 per la tendenza a girare da un lato ma non in cerchi chiusi; 2 per il movimento incostante in cerchi chiusi da un lato; 3 per il movimento costante in cerchi chiusi da un lato; 4 per rotazione, oscillazione o nessun movimento.
      NOTA: Il test rileva deficit sensomotori e di navigazione spaziale. Fa anche parte di NS.
  6. Simmetria corporea (Test 5)
    1. Continua dal Test 4 e lascia che il mouse si muova liberamente sulla superficie piana. Osserva il suo asse naso-coda.
    2. Il punteggio in base ai risultati è il seguente: 0 per una postura normale con tronco sollevato dalla panchina e coda dritta; 1 per "lieve asimmetria" se il corpo si piega leggermente da un lato e la coda piegata distalmente; 2 per "asimmetria moderata" se il corpo si piega o si inclina verso il lato controlesionale con la coda piegata prossimalmente e/o gli arti si estendono fuori dal corpo; 3 per "asimmetria prominente" se il corpo è marcatamente piegato, un lato giace incostantemente sul banco e la coda è chiaramente piegata prossimalmente (più del punteggio 2); 4 Per "estrema asimmetria" se il corpo è piegato, un lato giace costantemente sulla panca e la coda è molto piegata.
      NOTA: Rileva i deficit sensomotori unilaterali del tronco e della coda. Fa anche parte della scala NS.
  7. Valutazione dell'andatura (Test 6)
    1. Continua dal test 5 e lascia che il mouse si muova liberamente sulla superficie piana. Osservare ora la sua andatura e verificare la presenza di deficit motori dell'andatura come paresi, rigidità degli arti, andatura spastica, rami.
    2. Punteggio in base ai risultati come segue: 0 per l'andatura normale se esplorativa, simmetrica e rapida con arti flessibili che si muovono "nascosti" sotto il corpo; 1 per l'andatura rigida, inflessibile e più lenta di un mouse che si muove liberamente senza zoppicare; 2 per zoppicare chiaramente con movimenti asimmetrici (sinistra-destra); 3 per tremore, deriva o caduta dopo una leggera spinta; 4 per nessuna camminata spontanea (cammina non più di 3 passi se stimolata da una leggera spinta).
      NOTA: Rileva i deficit combinati dell'andatura. Fa anche parte di NS.
  8. Cerchiatura obbligatoria (Test 7)
    1. Tieni il topo per la base della coda per sollevarlo dalla superficie e lascialo camminare solo sugli arti anteriori. Osserva il suo movimento.
    2. Punteggio in base ai risultati come segue: 0 per il movimento lineare normale; 1 per tendenza a girare da un lato; 2 per girare da un lato in cerchi chiusi; 3 se si ruota su un lato con movimenti goffi o non si riesce lentamente a completare un cerchio; 4 se non avanza e la parte anteriore del tronco giace sulla panca.
      NOTA: Il test integra il test del comportamento circolare (test 4, vedere 2.5). Probabilmente rileva deficit sensomotori e spaziali. Fa anche parte del sistema di punteggio NS.
  9. Postura contro le forze laterali (Test 8)
    1. Posizionare il mouse sul palmo della mano, con l'asse del naso della coda (longitudinale) parallelo all'asse del palmo sagittale.
    2. Far oscillare il mouse in avanti o indietro a una velocità costante per indurre forze perpendicolari al suo asse longitudinale.
      NOTA: Questo costringe il mouse a mantenere la sua posizione verticale e a bilanciarsi contro le forze laterali durante l'oscillazione. Il suo corpo normalmente non entra in contatto con il palmo o le dita.
    3. Osserva visivamente e senti eventuali contatti del palmo dei lati sinistro-destro del mouse mentre si bilancia contro l'oscillazione. Verificare la presenza di eventuali cadute asimmetriche, tocchi sul palmo della mano o indicazioni di debolezza laterale.
    4. Il punteggio in base ai risultati è il seguente: 0 se il mouse si trova in una normale posizione eretta con la parte posteriore parallela al palmo e può bilanciarsi contro l'oscillazione senza toccare pesantemente il palmo; 1 se il mouse appiattisce il corpo durante l'oscillazione per guadagnare stabilità; 2 se una parte del mouse si sdraia o tocca brevemente il palmo durante lo swing; 3 se il mouse giace su un lato, riesce a malapena a recuperare la posizione eretta; 4 Se il mouse si trova in posizione prona, non è in grado di recuperare la posizione eretta.
      NOTA: Il test rileva deficit posturali contro l'accelerazione laterale, ma il suo punteggio può essere soggettivo. Fa anche parte di mNSS, NS.
  10. Posizionamento mirato dell'arto anteriore (Test 9)
    1. Tieni il mouse dalla parte posteriore o dalla base della coda. Dirigerlo perpendicolarmente verso il raggio, che funge da "bersaglio da raggiungere". Osservare la simmetria per "allungarsi" e afferrare.
    2. Una volta afferrato saldamente il raggio, tiralo via delicatamente e osserva il "rilascio" simmetrico degli arti anteriori.
    3. Punteggio in base ai risultati come segue: 0 per "allungare", afferrare e "rilasciare" simmetrici; 1 per qualsiasi asimmetria nel "raggiungere e/o nel "rilasciare", indicativa di debolezza controlesionale degli arti anteriori.
  11. Deficit sensomotorio degli arti anteriori (Test 10)
    1. Tenere saldamente il mouse per la schiena e rivoltarlo ventralmente (vedere il video o la Figura 1e).
    2. Stimolare le zampe anteriori in successione con una punta sottile (ad es. stuzzicadenti di legno) da un angolo cieco. Osserva la reazione della zampa anteriore.
    3. Punteggio in base ai risultati come segue: 0 per un movimento di presa normale e rapido su entrambi i lati; 1 per presa contralesionistica assente o chiaramente ritardata.
      NOTA: Sia il test 2.10 che 2.11 per i deficit sensomotori fini degli arti anteriori. Fanno anche parte di mNSS.
  12. Camminata alla trave (Test 11)
    1. Posizionare una trave di legno di 1 m di lunghezza (Tabella dei materiali) per collegare due superfici rialzate (es. panche, tavoli) ad un'altezza di 1-1,5 m dal suolo. Stabilizzare i bordi della trave per evitare vibrazioni o instabilità.
    2. Posizionare il mouse al centro della trave con l'asse naso-coda parallelo alla trave (Figura 2e). Consentire l'equilibrio o camminare liberamente sulla trave. Osserva il suo equilibrio o la paresi degli arti e le cadute.
      NOTA: Il mouse dovrebbe guadagnare equilibrio sulla trave prima di segnarla. Tenere un guanto spesso sotto l'animale (a una distanza di circa 15-20 cm) per proteggerlo in caso di caduta.
    3. Punteggio in base ai risultati come segue: 0 se il topo è in equilibrio e cammina con una postura stabile verso un lato della trave; 1 se si aggrappa al lato della trave e non vi cammina sopra; 2 se un arto cade dalla trave; 3 se due arti cadono dalla trave; 4 se il mouse tenta di stare in equilibrio sulla trave ma cade (dopo 40 secondi); 5 se cade tra i 20 e i 40 secondi; Segna 6 se cade senza alcun tentativo di bilanciarsi o di appendersi alla trave (<20 secondi).
      NOTA: Il test rileva deficit motori combinati di arti anteriori, posteriori e tronco. Fa anche parte della scala mNSS.
  13. Sensazione di baffi (Test 12)
    1. Posizionare il mouse su un banco di lavoro aperto (come nei test 4 e 5). Concedi un po' di tempo per l'alloggio.
    2. Stimola i baffi sinistro e destro in successione, con un batuffolo di cotone sottile e a punta lunga, da un "angolo cieco". Osservare una pronta risposta di rotazione della testa verso la stimolazione.
    3. Il punteggio in base ai risultati è il seguente: 0 per un normale e veloce giro della testa dopo la stimolazione, bilateralmente; 1 per una risposta controlesionale più lenta alla stimolazione; 2 per assenza di risposta controlesionale (nessun turno); 3 per assenza di risposta controlesionale e più lenta della risposta ipsilesionale; 4 per mancata risposta bilaterale.
      NOTA: Evitare il rilevamento visivo del cotone perché ciò causerebbe erroneamente una rotazione omolaterale della testa. Il test è tecnicamente corretto solo quando il topo viene "sorpreso" dalla stimolazione dei baffi. Il test fa anche parte della NS e rileva i deficit sensomotori dei baffi (corteccia a botte).
  14. Arrampicata (Test 13)
    1. Utilizzare una superficie inclinata rivestita in gomma, angolata a 45° (Figura 2a) e posizionare il mouse al centro. Osserva lo sforzo del topo per arrampicarsi.
    2. Punteggio in base ai risultati come segue: 0 (normale) se il mouse sale rapidamente e senza sforzo in cima alla superficie; 1 se si arrampica con sforzo, con debolezza degli arti; 2 se si mantiene sul pendio senza scivolare o arrampicarsi; 3 se scivola lungo il pendio nonostante gli sforzi per evitare la caduta; 4 se scivola senza alcuno sforzo per evitare la caduta.
      NOTA: Il test fa anche parte della NS e rileva la forza generale del motore.
  15. Calcola il punteggio di fESS sommando tutti i punteggi dei test da 1 a 13
    NOTA: il punteggio fESS di 0 indica un mouse normale, il punteggio massimo è 42. Gli infarti di grandi dimensioni con lesioni striatali e corticali di solito inducono punteggi >7-9. Esaminare e valutare diversi topi normali prima di iniziare a valutare quelli accarezzati, per adattarsi alle variazioni del comportamento normale e ridurre il punteggio fESS falso positivo. Utilizzare costantemente il protocollo video fornito per standardizzare il punteggio durante l'intero esperimento.

3. Componente generale dell'ESS (gESS)

NOTA: Valutare la gESS per rilevare i segni di "malattia generale del topo", ad esempio infiammazione o infezione, solitamente presenti durante le prime 1-2 settimane dopo la fMCAo. Utilizzare il foglio di punteggio nel file supplementare 2. Valutare la gESS preferibilmente dopo aver completato la fESS.

  1. Posizionare il mouse su una superficie piana (panca) e lasciarlo muovere liberamente come in 2.5. Valutare in sequenza i punteggi seguenti.
  2. Osserva la sua pelliccia. Punteggio secondo la scheda di valutazione gESS (punteggi 0-2, vedi File supplementare 2).
  3. Controlla la risposta di sorpresa del mouse: sorprendi il mouse con un battito improvviso da un angolo cieco, quando è rilassato. Controllare e valutare la reazione delle orecchie del topo secondo la scheda di punteggio gESS (punteggi 0-2, vedi File supplementare 2).
  4. Valutare visivamente gli occhi del topo rilassato: verificare la presenza di occhi aperti/chiusi o di muco. Punteggio secondo la scheda di valutazione gESS (punteggi 0-4, vedi file supplementare 2).
  5. Osserva l'attività spontanea generale e la vigilanza del topo. Punteggio secondo la scheda di valutazione gESS (punteggi 0-4, vedi file supplementare 2).
  6. Osservare il comportamento spontaneo generale del topo per qualsiasi presenza di ansia, ipereccitabilità, aggressività o rotazione lungo il suo asse durante qualsiasi manipolazione. Punteggio secondo la scheda di valutazione gESS (punteggi 0-4, vedi file supplementare 2).
  7. Calcolare il punteggio di gESS sommando i punteggi di tutti i passaggi precedenti (punteggio osservazionale, passaggi da 3.2. a 3.6).
    NOTA: Il punteggio gESS non rileva i deficit focali indotti dalle lesioni da ictus né è influenzato da mSU, come precedentemente mostrato 13. Tutti i test sono adattati dalla scala NS 9,15.

4. Quantificazione dei deficit degli arti anteriori con il Cylinder Test

NOTA: Il test del cilindro è precedentemente descritto in dettaglio 9,15,27 e non sarà descritto in dettaglio qui. Il test del cilindro è un test comportamentale indipendente che quantifica in modo imparziale i deficit degli arti anteriori (vedi 4.2).

  1. Eseguire il test seguendo le istruzioni fornite qui15. Cattura video e analizzali come in 15. Misurare i primi contatti dei primi arti destro e sinistro con le pareti. La Figura 3a, b mostra le immagini dell'installazione.
  2. Calcolare la lateralizzazione dell'uso dell'arto a causa della paresi controlesionale (destra) in percentuale percentuale. Utilizzare la formula: % preferenza per i passi a sinistra = [(sinistra - destra) primi contatti / (destra + sinistra) contatti] x 100.
    NOTA: Eseguire un test del cilindro di base per ciascun mouse prima di indurre un ictus. Esegui i test in base ai punti temporali in base a ciascun piano sperimentale.

5. Quantificazione dei deficit degli arti anteriori e posteriori con il Ladder-rung Test

NOTA: Costruire l'apparato per topi in plexiglas (mostrato nella Figura 3c): un corridoio lungo 1 m con pareti alte 20 cm, pioli di plastica (3 mm di diametro) posti a intervalli regolari di 15 mm (Figura 3c1) e una scatola "rifugio" all'estremità distale. Metti la lettiera degli animali nella scatola del rifugio per familiarità e alcuni pellet di cibo o burro di arachidi come ricompensa. La larghezza del corridoio deve essere di 10 cm e deve essere rialzata di circa 30 cm da terra.

  1. Addestrare i topi sull'apparecchio 1-3 giorni prima del basale dell'esperimento. Eseguire l'allenamento come nei passaggi da 5.1.1 a 5.1.4.
    NOTA: L'addestramento è necessario per consentire agli animali di camminare a velocità costante e normale attraverso il corridoio del piolo, senza fermate, svolte o comportamenti esplorativi. Eseguire l'allenamento per 2 giorni consecutivi (2 sessioni). Ogni sessione di allenamento è composta da 3 corse (corsa = una sola passeggiata attraverso l'intero corridoio verso il box rifugio). La raccolta dei dati di base è necessaria per il follow-up.
    1. Pulisci i pioli e le pareti prima di ogni corsa con alcol al 70%, per evitare odori e distrazioni/soste "esplorative" del mouse.
    2. Posiziona il mouse all'inizio del corridoio piolo, di fronte alla scatola di rifugio, per iniziare una corsa. Lascia che il topo cammini liberamente verso la scatola del rifugio alla fine del corridoio. Non costringere l'animale a camminare.
      NOTA: Le corse durante l'allenamento sono normalmente molto variabili in termini di durata e ritmo di camminata. L'obiettivo dell'allenamento è una camminata stabile verso il box di rifugio, di solito entro <10 s, senza fermate/curve, che si ottiene di solito entro la fine del secondo giorno di allenamento. Maneggiare sempre delicatamente l'animale per evitare l'induzione di stress che distrarrà un addestramento adeguato. Rimuovi gli animali dal corridoio e ripeti la corsa se rimangono nel corridoio ed esplora localmente per >1 minuto, per evitare l'assuefazione.
    3. Eseguire la 1acorsa di allenamento . Lasciare riposare l'animale nel box del rifugio per 5 minuti dopo la1a corsa.
      NOTA: Questo tempo di riposo prolungato consente al mouse di familiarizzare con la scatola di rifugio e percepirla come un obiettivo "riposante/gratificante" da raggiungere. Ottenere una "percezione gratificante" della cassetta di rifugio è fondamentale per il successo delle corse.
    4. Togliete il mouse dalla cassetta di rifugio ed eseguite la seconda e la terza corsa di allenamento come in 5.1.2. Prevedere un tempo di riposo più breve nel box rifugio alla fine di queste corse (30-60 s), per evitare l'assuefazione.
      NOTA: L'allenamento è completato il giorno 2. Entro il giorno 2 quasi tutti gli animali imparano a camminare attraverso il corridoio a un ritmo costante. Prendi in considerazione l'idea di escludere gli animali da ulteriori sperimentazioni se non stanno imparando.
  2. Esegui l'esperimento su topi addestrati. Testa i topi per 2 esecuzioni ogni volta durante tutti i punti temporali dell'esperimento e della linea di base.
    1. Eseguire le esecuzioni come descritto nei passaggi 5.1.1 e 5.1.2. Prevedere un massimo di 5 minuti di riposo tra le 2 corse nel box di rifugio.
    2. Utilizzare uno smartphone (o una fotocamera equivalente) e un "selfie-stick" per catturare video (dati) degli animali con un leggero angolo ventrale e "cieco" da una certa distanza (come mostrato nella Figura 3c2). Assicurati di catturare gli arti mentre l'animale cammina nel corridoio. Non distrarre visivamente il mouse durante la sua corsa e seguire i suoi arti durante la sua corsa (Figura 3c2).
    3. Registra entrambe le esecuzioni ma utilizza e analizza i dati della seconda esecuzione.
    4. Misurare il numero di passaggi di guasto (cadute) tra i pioli di ciascun arto (sinistra/destra, arto anteriore/posteriore) (Figura 3c3), esaminando il video utilizzando qualsiasi software di riproduzione multimediale con opzioni al rallentatore. Calcolare la differenza assoluta o % tra i gradini di faglia dell'arto destro e sinistro, separatamente per gli arti anteriori e posteriori.
      NOTA: La seconda esecuzione fornisce risultati più affidabili. Un topo sano di solito ha 0-1 passaggi di errore arbitrari per arto (destro o sinistro) durante la sua seconda esecuzione, che normalmente fornisce un intervallo di differenza di 0 ±1. Un topo accarezzato farà passi di errore con il suo arto paretico destro (controlesionale) (arto anteriore o posteriore), risultando in una lateralizzazione positiva "verso destra". Un animale gravemente accarezzato può essere più lento o non completare la corsa durante i primi 7-10 giorni dopo l'ictus, tuttavia, in seguito raggiungerà corse adeguate e mostrerà gravi deficit.

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Risultati

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L'mSU, come descritto in precedenza, inizia dopo l'operazione fMCAo. I nostri risultati rappresentativi nelle due coorti di topi indipendenti di fMCAo stroke e sham (Figura 4a) confermano il valore precedentemente dimostrato di mSU, in particolare durante il periodo critico tra i giorni 3 e 1013. Nelle nostre coorti, la mortalità si è verificata per 3/15 animali della coorte 1 (ictus, 6 mesi di follow-up), 2/10 della coorte 2 (ictus, 14 giorni di follow-up) e 0/6 degl...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo è una guida completa al protocollo di supporto mSU, progettato per ridurre la mortalità artefattuale tra i giorni 3-10 nei topi sottoposti a grandi ictus territoriali dal modello fMCAo13. Inoltre, il presente protocollo include una guida video standardizzata per la componente focale della scala ESS (fESS) per ridurre la soggettività estesa e la distorsione del punteggio focale neurologico nei topi dopo l'ictus. Parallelamente, introduciamo i...

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Dichiarazioni

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Nessuna divulgazione da segnalare.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare Nikolaos Plakopitis e Ioannis Tatsidis per il prezioso supporto chirurgico durante alcune parti dello studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Strumenti per mSU
5% Soluzione di destrosio VIOSER S.Ana (non applicabile)Qualsiasi genericon
Termometro digitale senza contattoAVRONYTC20095Qualsiasi genericon
Bilancia digitaleKERN & Sohn GmbhFCB6K1Qualsiasi generico
Pellet alimentareMucedola srlnaQualsiasi generico, utilizzare il normale cibo della tua struttura animale
Piastra riscaldantePhotaxnaPhotax scaldapiatti 2
Liquido antisetticoSchü lke & Mayr GmbHnaOctenisept®
FrullatorenaPer polverizzare pellet. Qualsiasi generico
Soluzione salina normaleDEMO S.A.naIniezione di cloruro di sodio 0,9%
Pinsetter e cotton fiocnaQualsiasi genericon
ZuccheronaAny genericon
Siringhe (1ml) con agonaAny genericon. Per la somministrazione di alimenti (senza ago) e per la somministrazione di fluidi sottocutanei (con ago)
Tools per ESS
superficie angolata costruitonarealizzato in plexiglas o altro materiale, con superficie in gomma, per prove di arrampicata
tampone di cotone Qualsiasi genericonaauricolare commerciale cotton fioc, fare la sua punta di cotone lungo e assottigliato
bordo affilato bastoncino di legnoQualsiasi genericonnaad esempio stuzzicadenti
Fascio lungo Dimensioni: 1 x 1 x1cm, lungo circa 100cm, in legno. Posizionare tra due bordi del tavolo per il test di camminata del fascio
Guanto spesso Qualsiasigenerico naper prevenire traumi animali durante la caduta dalla trave
per alimenti normale calibro 27 45&

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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