Metodi per abilitare la trascrittomica spaziale dei tessuti ossei

Summary

Qui descriviamo un metodo che consente la decalcificazione dei tessuti ossei appena ottenuti e la conservazione di RNA di alta qualità. Viene inoltre illustrato un metodo per il sezionamento di campioni FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embedded) di ossa non demineralizzate per ottenere risultati di buona qualità se i tessuti freschi non sono disponibili o non possono essere raccolti.

Abstract

Comprendere la relazione tra le cellule e la loro posizione all'interno di ciascun tessuto è fondamentale per scoprire i processi biologici associati al normale sviluppo e alla patologia della malattia. La trascrittomica spaziale è un potente metodo che consente l'analisi dell'intero trascrittoma all'interno di campioni di tessuto, fornendo così informazioni sull'espressione genica cellulare e sul contesto istologico in cui risiedono le cellule. Sebbene questo metodo sia stato ampiamente utilizzato per molti tessuti molli, la sua applicazione per l'analisi di tessuti duri come l'osso è stata impegnativa. La sfida principale risiede nell'incapacità di preservare l'RNA di buona qualità e la morfologia dei tessuti durante l'elaborazione dei campioni di tessuto duro per il sezionamento. Pertanto, qui viene descritto un metodo per elaborare campioni di tessuto osseo appena ottenuti per generare efficacemente dati di trascrittomica spaziale. Il metodo consente la decalcificazione dei campioni, garantendo sezioni di tessuto di successo con dettagli morfologici preservati ed evitando la degradazione dell'RNA. Inoltre, vengono fornite linee guida dettagliate per i campioni precedentemente inclusi in paraffina, senza demineralizzazione, come i campioni raccolti dalle banche dei tessuti. Utilizzando queste linee guida, vengono mostrati dati di trascrittomica spaziale di alta qualità generati da campioni di banche di tessuti di tumore primario e metastasi polmonari dell'osteosarcoma osseo.

Introduction

L'osso è un tessuto connettivo specializzato composto principalmente da fibre di collagene di tipo 1 e sali inorganici¹. Di conseguenza, l'osso è incredibilmente forte e rigido pur essendo allo stesso tempo leggero e resistente ai traumi. La grande forza dell'osso deriva dal suo contenuto di minerali. Infatti, per ogni dato aumento della percentuale di contenuto di minerali, la rigidità aumenta di cinque volte². Di conseguenza, i ricercatori si trovano di fronte a problemi significativi quando analizzano, mediante sezionamento istologico, la biologia di un campione osseo.

L'istologia ossea non decalcificata è fattibile e talvolta richiesta, a seconda del tipo di indagine (ad esempio, per studiare la microarchitettura dell'osso); È, tuttavia, molto impegnativo, soprattutto se gli esemplari sono di grandi dimensioni. In questi casi, il processamento tissutale a fini istologici richiede diverse modifiche dei protocolli e delle tecniche standard³. In generale, per eseguire le comuni valutazioni istologiche, i tessuti ossei vengono decalcificati subito dopo la fissazione, un processo che può richiedere da alcuni giorni a diverse settimane, a seconda delle dimensioni del tessuto e dell'agente decalcificante utilizzato⁴. Le sezioni decalcificate sono spesso utilizzate per l'esame del midollo osseo, la diagnosi di tumori, ecc. Esistono tre tipi principali di agenti decalcificanti: acidi forti (ad es. acido nitrico, acido cloridrico), acidi deboli (ad es. acido formico) e agenti chelanti (ad es. acido etilendiamminotetracetico o EDTA)⁵. Gli acidi forti possono decalcificare l'osso molto rapidamente, ma possono danneggiare i tessuti; gli acidi deboli sono molto comuni e adatti per le procedure diagnostiche; Gli agenti chelanti sono di gran lunga i più utilizzati e appropriati per l'applicazione della ricerca poiché, in questo caso, il processo di demineralizzazione è lento e delicato, consentendo il mantenimento di una morfologia di alta qualità e la conservazione delle informazioni geniche e proteiche, come richiesto da molte procedure (ad esempio, ibridazione in situ , immunocolorazione). Tuttavia, quando l'intero trascrittoma deve essere preservato, ad esempio per le analisi dell'espressione genica, anche una demineralizzazione lenta e delicata può essere dannosa. Pertanto, sono necessari approcci e metodi migliori quando l'analisi morfologica dei tessuti deve essere abbinata all'analisi dell'espressione genica delle cellule.

Grazie ai recenti miglioramenti nel sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) e nella trascrittomica spaziale, è ora possibile studiare l'espressione genica di un campione di tessuto anche quando l'inclusione di paraffina per fissazione in formalina (FFPE) è stata utilizzata per conservare i campioni di tessuto ^6,7,8. Questa opportunità ha permesso di accedere a un numero maggiore di campioni, come quelli conservati nelle banche dei tessuti di tutto il mondo. Se lo scRNA-seq deve essere impiegato, l'integrità dell'RNA è il requisito più importante; tuttavia, nel caso della trascrittomica spaziale di campioni FFPE, sono necessarie sia sezioni di tessuto di alta qualità che RNA di alta qualità per visualizzare l'espressione genica nel contesto istologico di ciascuna sezione di tessuto. Mentre questo è stato facilmente ottenuto con i tessuti molli, lo stesso non si può dire per i tessuti duri come le ossa. Infatti, per quanto ne sappiamo, nessuno studio che utilizzi la trascrittomica spaziale è mai stato condotto su campioni ossei FFPE. Ciò è dovuto alla mancanza di protocolli in grado di elaborare efficacemente i tessuti ossei FFPE preservandone il contenuto di RNA. In questo caso, viene fornito prima un metodo per elaborare e decalcificare i campioni di tessuto osseo appena ottenuti, evitando la degradazione dell'RNA. Quindi, riconoscendo la necessità di un'analisi trascrittomica dei campioni FFPE raccolti nelle banche dei tessuti di tutto il mondo, vengono presentate anche le linee guida sviluppate per gestire correttamente i campioni FFPE di ossa non demineralizzate.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali descritte di seguito sono state approvate in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio presso la School of Dental Medicine dell'Università di Pittsburgh.

1. Metodo per preparare blocchi FFPE di campioni di tessuto osseo che richiedono demineralizzazione

1. Preparazione dei reagenti e dei materiali
   1. Preparare EDTA 20% pH 8.0. Per 1 L, sciogliere 200 g di EDTA in 800 mL di acqua ultrapura, regolare il pH a 8,0 con idrossido di sodio 10 N e infine portare il volume a 1L con acqua ultrapura. Conservare a temperatura ambiente.
      NOTA: Utilizzare sempre EDTA 20% pH 8.0 appena preparato. L'idrossido di sodio (NaOH) 10 N viene preparato sciogliendo 400 g di NaOH in 1 L di acqua ultrapura.
   2. Preparare la paraformaldeide (PFA) al 4% in una cappa aspirante utilizzando 1x PBS senza calcio e magnesio.
      NOTA: Designare un'area in una cappa aspirante per lavorare con soluzioni concentrate di paraformaldeide o solidi di paraformaldeide ed etichettarla come tale. Per evitare l'esposizione, tenere i contenitori chiusi il più possibile. Utilizzare nelle quantità minime necessarie per l'esperimento in corso. Se la pesata della polvere di paraformaldeide e la bilancia non possono essere utilizzate in una cappa aspirante, prendere prima un contenitore, quindi aggiungere la polvere di PFA nella cappa e coprire prima di tornare alla bilancia per pesare la polvere. Utilizzare sempre il 4% di PFA appena preparato.
   3. Utilizzare un contenitore adatto per ogni campione.
      NOTA: Ad esempio, per 1 mg di tessuto osseo, utilizzare un contenitore che consenta ad almeno 1 ml di qualsiasi soluzione di entrare in contatto con l'osso.
   4. Sterilizzare tutte le attrezzature chirurgiche necessarie per la dissezione.
   5. Pulire tutte le aree con una soluzione decontaminante per rimuovere le RNasi.
   6. Raccogli i materiali sperimentali rimanenti, inclusi contenitori di ghiaccio, spray all'etanolo al 70% e accedi a un agitatore orbitale.
2. Isolamento di campioni di tessuto osseo da topi
   1. Sopprimere il topo mediante esposizione a CO₂ , quindi eseguire la lussazione cervicale e adagiarlo sulla schiena. Spruzzare la pelle del topo con etanolo al 70%.
   2. Usando le forbici da dissezione sterili, aprire la pelle ed esporre il muscolo della gamba. Taglia il muscolo lungo la gamba per ottenere una visione chiara della posizione dell'osso e disarticola delicatamente l'osso per rimuoverlo senza danni.
      NOTA: Non è necessario rimuovere completamente tutto il muscolo attaccato all'osso. Cerca di essere il più veloce possibile per limitare la degradazione dell'RNA.
   3. Posizionare immediatamente il campione osseo in una provetta contenente il 4% di PFA e posizionare la provetta sul ghiaccio.
   4. Ripetere la procedura per raccogliere altri campioni di osso come desiderato.
   5. Mettere i campioni con il 4% di PFA in agitazione su un agitatore orbitale a 140 giri/min a 4 °C per almeno 24 ore per consentire un corretto fissaggio.
3. Decalcificazione di campioni di tessuto osseo
   1. Recuperare il tessuto osseo dall'agitatore orbitale dopo la fissazione.
   2. Lavare il tessuto osseo 2 volte con 1x PBS per 3 minuti su uno shaker orbitale a 140 giri/min per rimuovere il PFA rimasto.
   3. Utilizzando le forbici da dissezione sterili, rimuovere i muscoli rimanenti ancora attaccati all'osso.
   4. Lavare il tessuto osseo ancora una volta con 1x PBS per 3 minuti.
   5. Posizionare il tessuto osseo in un nuovo contenitore con EDTA al 20% a pH 8,0. Quindi, posizionare il contenitore su un agitatore orbitale a 140 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
   6. Scartare la soluzione, aggiungere il 20% di EDTA pH 8.0 fresco nel contenitore e posizionarlo su un agitatore orbitale a 140 giri/min per 30 minuti a RT.
   7. Ripetere il passaggio 1.3.6 10 volte.
   8. Scartare la soluzione, aggiungere il 20% di EDTA pH 8.0 fresco nel contenitore e porlo a 4 °C in una cella frigorifera su un agitatore orbitale a 140 giri/min per una notte.
4. Disidratazione di campioni di tessuto osseo
   1. Recuperare il campione di tessuto osseo dal contenitore.
   2. Ispezionare il tessuto e verificare l'efficienza della decalcificazione ruotando e torcendo delicatamente l'osso. In alternativa, eseguire una radiografia dell'osso utilizzando una macchina a raggi X.
      NOTA: Se il campione si flette facilmente, è stato raggiunto un buon grado di decalcificazione. In caso contrario, i parametri di decalcificazione (tempo, velocità di agitazione, volume del 20% di EDTA pH 8.0 utilizzato, ecc.) devono essere aumentati.
   3. Lavare il tessuto osseo 2 volte con 1x PBS per 3 minuti per rimuovere i residui di EDTA.
   4. Mettere il tessuto osseo in un nuovo contenitore e iniziare la disidratazione con etanolo al 70%. Incubare per 15 minuti a 140 giri/min.
   5. Scartare la soluzione di etanolo al 70%, immergere il campione in una soluzione di etanolo al 90% e incubare per 15 minuti a 140 giri/min.
   6. Scartare la soluzione di etanolo al 90%, immergere il campione in etanolo al 100% e incubare per 15 minuti a 140 giri/min.
   7. Scartare l'etanolo al 100%, immergere il campione in etanolo nuovo al 100% e incubare per 15 minuti a 140 giri/min.
   8. Scartare l'etanolo al 100%, immergere il campione in etanolo nuovo al 100% e incubare per 15 minuti a 140 giri/min.
   9. Scartare l'etanolo al 100%, immergere il campione in un nuovo etanolo al 100% e incubare per 30 minuti a 140 giri/min.
   10. Scartare l'etanolo al 100%, immergere il campione in un nuovo etanolo al 100% e incubare per 45 minuti a 140 giri/min.
       NOTA: La disidratazione può essere eseguita anche utilizzando un processore automatico. In questo caso, impostare il programma con le stesse condizioni riportate per la disidratazione manuale. Le condizioni riportate si riferiscono a campioni di spessore non superiore a 4 mm (cioè campioni di tessuto osseo ottenuti da topi). Per i campioni di spessore superiore a 4 mm, il tempo di disidratazione deve essere determinato sperimentalmente.
5. Pulizia di campioni di tessuto osseo
   1. Posizionare il campione di tessuto osseo in un nuovo contenitore e avviare il processo di chiarificazione utilizzando lo xilene. Incubare per 20 minuti a 140 giri/min.
   2. Scartare lo xilene usato, aggiungere nuovo xilene e incubare per altri 20 minuti a 140 giri/min.
   3. Scartare lo xilene usato, aggiungere nuovo xilene e incubare per 45 minuti a 140 giri/min.
      NOTA: La cancellazione può essere eseguita anche utilizzando un processore automatico. In questo caso, impostare il programma con le stesse condizioni riportate per lo svuotamento manuale. Le condizioni riportate si riferiscono a campioni di spessore non superiore a 4 mm (cioè campioni di tessuto osseo ottenuti da topi). Per i campioni di spessore superiore a 4 mm, la tempistica deve essere determinata sperimentalmente.
6. Infiltrazione e inclusione di campioni di tessuto osseo
   1. Recuperare il campione di tessuto osseo dall'agitatore orbitale/processore automatico dopo la pulizia.
   2. Collocare il campione di tessuto osseo in una cassetta di inclusione e avviare l'infiltrazione con la cera (vedere Tabella dei materiali). Incubare per 30 minuti a 60 °C.
   3. Scartare la cera usata, aggiungere nuova cera e incubare per 30 minuti a 60 °C.
   4. Scartare la cera usata, aggiungere nuova cera e incubare per 45 minuti a 60 °C.
   5. Posizionare con cura il campione di tessuto osseo in uno stampo con l'orientamento desiderato.
   6. Lasciare solidificare il blocco di campioni su una superficie fredda.
   7. Conservare il FFPE ottenuto a 4 °C fino al momento di iniziare il sezionamento.
      NOTA: Il blocco FFPE può essere conservato per molti anni prima di eseguire il sezionamento.

2. Linee guida per il sezionamento di campioni FFPE non demineralizzati

NOTA: Le seguenti linee guida forniscono preziosi consigli e istruzioni utili a migliorare notevolmente la qualità delle sezioni di tessuto evitando la degradazione dell'RNA soprattutto nei casi di piccoli campioni ossei non decalcificati. Queste linee guida possono essere applicate anche ai campioni di osso decalcificato, quando disponibili. Per campioni di tessuto osseo più grandi, è necessario eseguire la demineralizzazione per ottenere sezioni di migliore qualità; In tali casi, deve essere seguito il metodo sopra riportato e i parametri (tempi, volumi di soluzioni, ecc.) devono essere regolati di conseguenza. Le seguenti linee guida sono adatte sia quando i tessuti ossei FFPE sono già stati processati (ad esempio, blocco FFPE raccolto da banche dei tessuti o altri laboratori) sia quando le sezioni raccolte verranno utilizzate per eseguire qualsiasi tipo di analisi che richieda RNA di buona qualità, sezioni di tessuto di alta qualità o entrambi.

1. Preparazione dell'attrezzatura
   1. Spruzzare tutte le superfici di lavoro e gli strumenti con soluzioni decontaminanti per rimuovere le RNasi.
   2. Preparare un bagnomaria con acqua distillata doppia e impostare la temperatura a 42 °C.
   3. Prendi una lama per microtomo, spruzzala con etanolo al 70% per rimuovere i residui di olio, quindi spruzzala con soluzioni decontaminanti per rimuovere le RNasi.
   4. Fissare la lama sul microtomo. Assicurarsi che l'angolo di spoglia sia impostato su 10°.
      NOTA: Utilizzare sempre lame nuove per il sezionamento.
   5. Prepara due secchi di ghiaccio.
   6. Prendi pinzette, spazzole e sonde, spruzzali con soluzioni decontaminanti per rimuovere le RNasi e mettili in uno dei due secchi per il ghiaccio.
   7. Preparare un bagno di ghiaccio aggiungendo acqua distillata doppia all'altro secchiello del ghiaccio.
      NOTA: il blocco FFPE non deve galleggiare nell'acqua aggiunta; Pertanto, la quantità di acqua aggiunta al secchiello del ghiaccio deve essere appena sufficiente per consentire al campione di essere bagnato senza galleggiare.
2. Taglio
   1. Recuperare il blocco FFPE dal deposito a 4 °C e posizionarlo sul microtomo. Impostare il comando su Trim o su 14 μm di spessore di scorrimento e iniziare a tagliare il campione fino a quando il tessuto non è esposto.
      NOTA: Se il blocco FFPE è già stato tagliato e il tessuto è già esposto, saltare il passaggio 2.2.1. Verificare che il blocco sia privo di buchi e crepe. In tal caso, procedere direttamente al passaggio 2.2.2. In caso contrario, tagliare alcune sezioni per appiattire la superficie ed evitare buchi e crepe, quindi procedere al passaggio 2.2.2.
   2. Posizionare il blocco FFPE sul bagno di ghiaccio per idratare il campione. Il tempo di idratazione deve essere determinato sperimentalmente.
      1. Inizia con 2 minuti e aumenta il tempo se l'idratazione non è sufficiente. Non superare i 10 min. L'idratazione espanderà il tessuto e ridurrà la formazione di "veneziane" e linee. Tempi di idratazione più lunghi potrebbero causare crepe nel blocco di paraffina e, possibilmente, distacco dei tessuti.
      2. Se 10 minuti non sono sufficienti per idratare il campione, eseguire cicli di idratazione non più lunghi di 10 minuti e riprovare il sezionamento.
      3. Se la superficie del blocco non è liscia e pulita a causa di crepe o tagli, prendere in considerazione la possibilità di incorporare nuovamente il campione. La qualità dell'RNA non sarà influenzata dal processo di re-inclusione.
   3. Inserire il campione nel morsetto del microtomo, allinearlo con la lama e iniziare il sezionamento. Impostare lo spessore della coclea su 5 μm.
   4. Raccogliere la sezione e metterla nel bagnomaria a 42 °C utilizzando una pinzetta fredda e spazzole.
      NOTA: In alternativa, se si desidera eseguire l'isolamento dell'RNA di sezioni di tessuto, raccogliere le sezioni in una provetta da centrifuga e seguire le specifiche di produzione per la preparazione dell'RNA (vedere la Tabella dei materiali).
   5. Incubare la sezione nel bagnomaria per distendere il tessuto ed eliminare eventuali rughe e pieghe residue.
      NOTA: Il tempo di galleggiamento nel bagno d'acqua per ogni sezione deve essere determinato sperimentalmente. Prendi in considerazione la possibilità di lasciare le sezioni ossee un minuto in più se si verificano problemi di distacco dei tessuti. Non lasciare la sezione galleggiante troppo a lungo poiché lunghi tempi di galleggiamento potrebbero danneggiare il tessuto.
   6. Posizionare la sezione su un vetrino, quindi incubarla per 3 ore a 42 °C.
   7. Posizionare il vetrino in un essiccatore o in un forno per una notte a RT per una corretta asciugatura.
   8. Conservare il vetrino con la sezione attaccata su RT in una scatola per vetrini.
      NOTA: I vetrini possono essere conservati per molti anni presso RT. Se verrà eseguita la trascrittomica spaziale, invece di un vetrino, posizionare la sezione sul vetrino di espressione genica spaziale fornito dal produttore e seguire le raccomandazioni riportate (vedere la Tabella dei materiali).

Results

Il metodo qui presentato descrive come elaborare ossa appena isolate per ottenere campioni di FFPE demineralizzati che possono essere facilmente sezionati con un microtomo preservando l'integrità dell'RNA (Figura 1). Il metodo è stato impiegato con successo su femori murini, ma può essere seguito per altri campioni di tessuto osseo di dimensioni simili, oppure può essere adattato per campioni ossei più grandi (ad esempio, campioni umani) aumentando tutti i parametri (tempistiche, volumi di soluzioni, ecc.).

Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo. Schema schematico del metodo per ottenere blocchi FFPE di tessuti ossei decalcificati con integrità dell'RNA conservata (punti 1 e 2). Schema schematico delle linee guida per la sezione dei blocchi FFPE (punto 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per convalidare la corretta tempistica della decalcificazione, è stato eseguito un decorso temporale in cui sono stati confrontati i femori non decalcificati, i femori decalcificati per 3 ore (per i quali l'EDTA è stato cambiato ogni 30 minuti per un totale di 6 volte) e i femori decalcificati per 24 ore (per i quali l'EDTA è stato cambiato ogni 30 minuti per un totale di 10 volte e poi lasciato nell'EDTA durante la notte) sono stati confrontati (Figura 2). I blocchi FFPE ottenuti sono stati quindi sezionati secondo le linee guida di cui sopra e sono state verificate la qualità istologica e l'integrità dell'RNA delle sezioni ottenute. A tal fine, l'integrità strutturale e la morfologia delle sezioni di tessuto sono state valutate mediante colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) seguita da ispezione microscopica (Figura 2A, C, E), mentre la qualità dell'RNA è stata valutata valutando il valore di distribuzione dei frammenti di RNA con dimensioni superiori a 200 nucleotidi (200 nt) (noto come punteggio DV200)⁴ (Figura 2B, D,F). Le immagini H&E hanno mostrato che le sezioni di femore non decalcificate e decalcificate per 3 ore presentavano diverse fratture, fori e danni (Figura 2A, C), mentre le sezioni di femori decalcificate per 24 ore mostravano una buona qualità istologica (Figura 2E). Tutti i campioni presentati con punteggi DV200 superiori al 50%, che è considerato il valore minimo per eseguire analisi scRNA-seq o trascrittomica spaziale⁴. Sono stati testati anche tempi di incubazione più lunghi con cambi giornalieri di EDTA, a 4 °C, con agitazione più lieve in contenitori più piccoli, che non sono raccomandati poiché, in queste condizioni, l'integrità dell'RNA dei campioni diminuisce drasticamente (Figura 2H). Pertanto, il tempo di incubazione è stato ridotto a 24 ore, mentre la frequenza, l'agitazione e i volumi di decalcificazione sono stati aumentati per aumentare la decalcificazione.

Figura 2. Sezioni e controllo di qualità dell'integrità dell'RNA (QC) di femori di topo di 8 settimane dopo decalcificazione. I femori di topi di 8 settimane sono stati appena sezionati, fissati e decalcificati con EDTA al 20% a pH 8,0. in diversi punti temporali, incorporati in paraffina utilizzando il metodo descritto e sezionati seguendo le linee guida riportate. Il controllo istologico delle sezioni ottenute è stato quindi eseguito mediante colorazione H&E, mentre l'integrità dell'RNA è stata valutata valutando il valore di distribuzione dei frammenti di RNA con una dimensione superiore a 200 nucleotidi (DV200). (A) Colorazione H&E che mostra sezioni di femore di topo di 8 settimane dopo nessuna decalcificazione. L'immagine a destra mostra un ingrandimento maggiore dell'area riquadro. (B) Controllo qualità dell'RNA di sezioni di femore di topo di 8 settimane dopo assenza di decalcificazione. (C) Colorazione H&E che mostra sezioni di femore di topo di 8 settimane dopo 3 ore di decalcificazione. L'immagine a destra mostra un ingrandimento maggiore dell'area riquadro. (D) RNA QC di sezioni di femore di topo di 8 settimane dopo 3 ore di decalcificazione. (E) Colorazione H&E che mostra sezioni di femore di topo di 8 settimane dopo 24 ore di decalcificazione. L'immagine a destra mostra un ingrandimento maggiore dell'area riquadro. (F) QC dell'RNA di sezioni di femore di topo di 8 settimane dopo 24 ore di decalcificazione. (G) Colorazione H&E che mostra sezioni di femore di topo di 8 settimane dopo 72 ore di decalcificazione. L'immagine a destra mostra un ingrandimento maggiore dell'area riquadro. (H) Controllo qualità dell'RNA di sezioni di femore di topo di 8 settimane dopo 72 ore di decalcificazione. Abbreviazioni: H&E = ematossilina ed eosina; DV200 (%) = % del valore della distribuzione dei frammenti > 200 nt; nt = nucleotidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per testare l'efficacia delle linee guida riportate per la gestione di campioni FFPE non demineralizzati, sono stati raccolti blocchi FFPE di osteosarcoma primario umano non demineralizzato e metastasi di osteosarcoma polmonare ottenuti dal nostro Registro dei tumori e banca dei tessuti dell'oncologia muscoloscheletrica (MOTOR) ed è stata eseguita l'analisi trascrittomica spaziale (Figura 3). Prima di procedere con l'analisi trascrittomica spaziale, i blocchi FFPE sono stati re-incorporati in paraffina per ottenere una superficie di partenza liscia. Quindi, sono stati valutati l'RNA e la qualità istologica delle sezioni (dati non mostrati). Le fasi di idratazione sono state decisive poiché i campioni di osteosarcoma primario non potevano essere sezionati senza un'adeguata idratazione. Al contrario, le metastasi polmonari non hanno richiesto alcuna fase di idratazione. Dopo il sezionamento, i tessuti sono stati posizionati su un vetrino trascrittomico spaziale (Figura 3A), colorati con H&E (Figura 3D) e l'analisi trascrittomica spaziale è stata eseguita secondo le specifiche del produttore (vedi Tabella dei materiali). Le librerie di cDNA ottenute sono state sequenziate e i dati elaborati sono stati visualizzati con Space Ranger per il controllo di qualità⁵ (Figura 3B). L'output di Space Ranger ha mostrato punteggi molto alti (quasi il 100%) per codici a barre validi, identificatori molecolari univoci (UMI) validi, basi Q30 e mediana di geni rilevati per punto (tra 1700 e 5000), dimostrando robustezza e solidità dei dati ottenuti (Figura 3B). Per mezzo dell'analisi dei cluster basata su grafi imparziali, sono stati identificati 12 cluster principali, inclusi cluster di cellule osteogeniche, immunitarie, epiteliali ed endoteliali, nonché adipociti (Figura 3E). Da notare che i confini dei cluster si sovrapponevano ai bordi delle regioni istologiche identificate dal patologo (Figura 3D). Ulteriori sezioni degli stessi campioni sono state anche colorate con la tricromia di Goldner per visualizzare le aree mineralizzate (Figura 3C).

Figura 3. Analisi trascrittomica spaziale di due coppie di osteosarcoma primario (OS) non decalcificato e metastasi polmonari. I blocchi FFPE di due coppie corrispondenti di osteosarcoma primario umano non demineralizzato e metastasi polmonari sono stati raccolti dalla nostra banca di tessuti MOTOR. I campioni sono stati sezionati utilizzando le linee guida riportate e sono stati posizionati su un vetrino Visium Spatial Gene Expression per campioni FFPE per eseguire l'analisi trascrittomica spaziale. (A) Vetrino Visium Spatial Gene Expression per campioni FFPE con le sezioni allegate. (B) Output dello Space Ranger che mostra i parametri comuni utilizzati per valutare la qualità dei dati ottenuti per tutti i campioni. (C) Colorazione tricromica di Goldner che mostra la localizzazione di tessuti ossei mineralizzati e osteoide. (D) Colorazione H&E che mostra l'annotazione del patologo. (E) Cluster analysis che mostra la localizzazione delle popolazioni cellulari residenti nei tessuti. Abbreviazioni: FFPE = fissato in formalina e incluso in paraffina; MOCs = cellule osteogeniche maligne. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Qui, viene fornito un metodo dettagliato per preparare blocchi FFPE di ossa decalcificate e preservare l'integrità dell'RNA per il sequenziamento (ad esempio, sequenziamento di nuova generazione (NGS)) o per altre tecniche correlate all'RNA (ad esempio, ibridazione in situ , reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR), ecc.).

Il metodo utilizza l'EDTA per decalcificare campioni di tessuto osseo; l'incubazione con EDTA consente una demineralizzazione lenta ma fine dei campioni, preservando così al meglio le caratteristiche istologiche del tessuto. Di solito, la decalcificazione ossea viene eseguita utilizzando EDTA al 10% pH 7.0 per almeno 2 settimane rinfrescando la soluzione a giorni alterni⁴. Lunghi tempi di decalcificazione, tuttavia, contribuiscono in modo significativo alla degradazione dell'RNA ^6,7,8. Per ovviare a questo problema, la concentrazione di EDTA è stata aumentata al 20%, il pH è stato aumentato a 8,0 e la frequenza di sostituzione della soluzione è stata aumentata a ogni 30 minuti. Queste condizioni, in combinazione con la grande quantità di soluzione a cui è esposto il tessuto, l'agitazione vigorosa e l'elevato rapporto contenitore/volume del tessuto, hanno massimizzato la decalcificazione e ridotto i tempi di trattamento, consentendo una demineralizzazione delicata ma rapida. Da notare, è importante ricordare che quando i campioni di tessuto osseo devono essere utilizzati per il sequenziamento del trascrittoma, potrebbe non essere necessario decalcificarli completamente. In questo caso, si deve trovare la proporzione ottimale tra una sufficiente demineralizzazione e una buona conservazione dell'RNA. Un'altra cosa importante da menzionare è che, indipendentemente dal modo in cui i campioni vengono trattati, se sono stati fissati, il loro RNA sarà frammentato. Il metodo qui riportato consente di trattenere i frammenti di RNA con una dimensione superiore a 200 nucleotidi (%DV200) (Figura 2F), che indica un'elevata qualità dell'RNA ^9,11.

Questo metodo presenta alcune limitazioni. In primo luogo, poiché i topi erano l'unica fonte di campioni di tessuto osseo, il metodo è stato convalidato solo su ossa murine, che sono relativamente piccole. Inoltre, non è noto se questo metodo possa essere utilizzato per topi di età superiore o inferiore a 8 settimane poiché è stato testato solo su topi di 8 settimane. Abbiamo scelto topi di 8 settimane perché sono scheletricamente maturi. Poiché l'invecchiamento modifica il contenuto minerale delle ossa, potrebbe essere necessario apportare modifiche a questo approccio.

Inoltre, le linee guida aiutano a migliorare la qualità delle sezioni di tessuto quando vengono utilizzati campioni FFPE di piccoli campioni ossei non decalcificati, come, ad esempio, quando vengono raccolti direttamente dalle banche dei tessuti. In queste situazioni, non si può fare nulla se l'RNA viene degradato, ma la qualità della sezione può essere migliorata. D'altra parte, per campioni con un buon contenuto di RNA, come quelli mostrati qui, l'analisi trascrittomica spaziale è possibile se si seguono le linee guida fornite. Da notare che nei campioni di osteosarcoma primario, la struttura ossea può essere alterata dalla presenza della massa tumorale, rendendo i campioni effettivi più deboli e fragili, il che può facilitare il sezionamento. Pertanto, la colorazione tricromica di Goldner è stata utilizzata per valutare se questo fosse il caso, poiché le aree mineralizzate e non mineralizzate possono essere identificate con questa tecnica di colorazione (Figura 3C).

In conclusione, il metodo riportato rappresenta un metodo facilmente applicabile per decalcificare campioni di tessuto osseo e ottenere sezioni FFPE che possono essere efficacemente utilizzate per NGS o altre tecniche che richiedono l'integrità dell'RNA. Inoltre, vengono fornite linee guida per il sezionamento di campioni che potrebbero non essere stati demineralizzati prima dell'inclusione della paraffina, come i campioni ottenuti dalle banche dei tessuti. Dato il rapido sviluppo delle analisi di trascrittomica spaziale, il metodo e le linee guida proposte possono essere molto utili nella ricerca ossea in generale e anche nella ricerca sul cancro osseo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agitatore orbitale avanzato	VWR	76683-470	Utilizzare per mantenere i tessuti sotto agitazione durante l'incubazione, come riportato nelle istruzioni del metodo.
Spazzole in pelo di cammello	Ted Pella	11859	Utilizzare per gestire le sezioni FFPE come riportato nelle linee guida.
Kit a doppio indice TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Utilizzare per eseguire la trascrittomica spaziale.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Utilizzare per eseguire la disidratazione dei tessuti come riportato nelle istruzioni del metodo.
Acido etilendiamminotetraacetico, sale disodico diidrato (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Utilizzare per preparare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Pinza curva a punta media per uso generale	Fisher Scientific	16-100-110	Utilizzare per gestire sezioni FFPE come riportato nelle linee guida.
Fisherbrand Sonda di precisione di precisione	Fisher Scientific	12-000-153	Utilizzare per gestire sezioni FFPE come riportato nelle linee guida.
Fisherbrand  Vetrini per microscopio Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15	Utilizzare per allegare pergamene sezionate come riportato nelle linee guida.
Lame per microtomo diamantate ad alto profilo	CL Sturkey	D554DD	Utilizzare per sezionare blocchi FFPE come riportato nelle linee guida.
Sequenziatore Novaseq 150PE	Novogene	N/A	.
Paraformaldeide (PFA) 32% Soluzione acquosa EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Diluire alla concentrazione finale del 4% con 1x PBS  per eseguire la fissazione dei tessuti.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Pronto all'uso. Utilizzare per diluire il PFA ed eseguire lavaggi come riportato nelle istruzioni del metodo.
Premiere Bagno Galleggiante in Tessuto	Fisher Scientific	A84600061	Utilizzare per rimuovere le rughe dalle sezioni FFPE come riportato nelle linee guida.
RNase AWAY Decontaminante per superfici	Thermo Fisher Scientific	7002	Utilizzare per pulire tutte le superfici come riportato nelle istruzioni del metodo.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Utilizzare per isolare l'RNA dalle sezioni FFPE una volta che sono state generate come riportato nelle linee guida.
Microtomo rotativo semiautomatico	Leica Biosystems	RM2245	Utilizzare per sezionare i blocchi FFPE come riportato nelle linee guida.
Idrossido di sodio	Millipore Sigma	S8045-500	Preparare la soluzione 10 N sciogliendo lentamente 400 g in 1 litro di acqua Milli-Q.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Utilizzare per elaborare l'output dei dati di sequenziamento.
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Utilizzare per eseguire l'infltrazione e l'inclusione dei tessuti, come riportato nelle istruzioni del metodo.
Kit di accessori Visium	10X Genomics	PN-1000194	Utilizzare per eseguire esperimenti di trascrittomica spaziale.
Kit di sonde per trascrittoma umano Visium Small	10X Genomics	PN-1000363	Utilizzare per eseguire esperimenti di trascrittomica spaziale.
Kit di diapositive per l'espressione genica spaziale Visium 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Utilizzare per posizionare le sezioni durante l'esecuzione di esperimenti di trascrittomica spaziale.
Xilene	Leica Biosystems	3803665	Utilizzare per eseguire la pulizia dei tessuti come riportato nelle istruzioni del metodo.