Articolo metodologico

Un modello murino di ipertrofia ventricolare destra indotta da sovraccarico di pressione e insufficienza mediante bande del tronco polmonare

DOI:

10.3791/66851

⸱

14 giugno 2024

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 2Department of Cardiology, Aarhus University Hospital

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un modello murino di sovraccarico di pressione ventricolare destra indotto dal banding polmonare del tronco. Nel documento sono inclusi protocolli dettagliati per l'intubazione, la chirurgia e la fenotipizzazione mediante ecocardiografia. Per l'intubazione e la chirurgia vengono utilizzati strumenti su misura, che consentono una riproduzione rapida ed economica del modello.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'insufficienza ventricolare destra (RV) causata da un sovraccarico di pressione è fortemente associata a morbilità e mortalità in una serie di malattie cardiovascolari e polmonari. La patogenesi dell'insufficienza ventricolare sinistra è complessa e rimane inadeguatamente compresa. Per identificare nuove strategie terapeutiche per il trattamento dell'insufficienza ventricolare destra, sono essenziali modelli animali robusti e riproducibili. I modelli di bendaggio del tronco polmonare (PTB) hanno guadagnato popolarità, poiché la funzione del ventricolo destro può essere valutata indipendentemente dai cambiamenti nella vascolarizzazione polmonare.

In questo articolo, presentiamo un modello murino di sovraccarico di pressione del ventricolo destro indotto da PTB in topi di 5 settimane. Il modello può essere utilizzato per indurre diversi gradi di patologia del ventricolo destro, che vanno dalla lieve ipertrofia del ventricolo destro al fallimento del ventricolo destro scompensato. Nel documento sono inclusi protocolli dettagliati per l'intubazione, la chirurgia PTB e la fenotipizzazione mediante ecocardiografia. Inoltre, vengono fornite le istruzioni per la personalizzazione degli strumenti per l'intubazione e la chirurgia PTB, consentendo una riproduzione rapida ed economica del modello PTB.

Sono state utilizzate clip di legatura in titanio per restringere il tronco polmonare, garantendo un grado di costrizione del tronco polmonare altamente riproducibile e indipendente dall'operatore. La gravità del PTB è stata classificata utilizzando diversi diametri della clip di legatura interna (lieve: 450 μm e grave: 250 μm). Ciò ha portato a una patologia del ventricolo destro che va dall'ipertrofia con funzione del ventricolo destro conservata all'insufficienza del ventricolo destro scompensata con ridotta gittata cardiaca e manifestazioni extracardiache. La funzione del ventricolo destro è stata valutata mediante ecocardiografia a 1 settimana e 3 settimane dopo l'intervento chirurgico. Esempi di immagini ecocardiografiche e risultati sono presentati qui. Inoltre, vengono mostrati i risultati del cateterismo cardiaco destro e le analisi istologiche del tessuto cardiaco.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'insufficienza ventricolare destra (RV) è una sindrome clinica con sintomi di insufficienza cardiaca e segni di congestione sistemica derivanti da disfunzione RV1. La disfunzione del ventricolo destro è fortemente associata alla morbilità e alla mortalità in un certo numero di malattie cardiovascolari e polmonari2. L'eziologia della disfunzione del ventricolo destro è complessa e le sue vie di segnalazione e regolazione sottostanti rimangono inadeguatamente chiarite.

Le osservazioni delle terapie attuali mostrano che il miglioramento della funzione del ventricolo destro è strettamente correlato alla riduzione del postcarico, suggerendo che la vascolarizzazione polmonare sia l'obiettivo primariodel trattamento 3. Ciò indica che le terapie attuali hanno solo un effetto diretto minimo sulla funzione del ventricolo destro, che può deteriorarsi anche dopo il miglioramento della resistenza vascolare polmonare3. Sono quindi estremamente necessarie ulteriori ricerche per migliorare la funzione del ventricolo destro indipendentemente dalla riduzione del postcarico.

Modelli animali robusti e riproducibili sono essenziali nella ricerca di nuovi agenti terapeutici. Nella maggior parte dei modelli di insufficienza cronica del ventricolo destro, la causa sottostante è l'ipertensione polmonare indotta da un'alterazione strutturale del sistema vascolarepolmonare 4,5,6. Modelli ben caratterizzati includono il modello di ipossia cronica 7,8, il modello di ipossia di Sugen 9,10,11 e il modello monocrotalina 12,13. Poiché in questi modelli l'insufficienza del ventricolo destro è secondaria all'ipertensione polmonare, è impossibile differenziare gli effetti degli interventi sul sistema vascolare polmonare dagli effetti diretti sul ventricolodestro 6.

Per studiare il RV indipendentemente dalla vascolarizzazione polmonare, il modello di banding del tronco polmonare (PTB) ha guadagnato popolarità ed è stato descritto in diverse specie animali, tra cui topi, ratti, conigli, cani, pecore e maiali 6,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26,27. Nei modelli PTB, la costrizione del tronco polmonare si ottiene chirurgicamente, causando un aumento della pressione del ventricolo destro6. Esistono diversi approcci all'applicazione del PTB, tra cui la costrizione del vaso con una legatura o con una clip di legatura metallica18,28. Nei modelli che utilizzano legature, il tronco polmonare è legato a un ago e l'ago viene retratto, lasciando la legatura in posizione. Ciò si traduce in una costrizione del vaso che dipende dalla dimensione dell'ago e dalla tensione del nodo18,29. Nei modelli che utilizzano clip di legatura metalliche, il grado di costrizione del tronco polmonare può essere più riproducibile. Gli applicatori di clip di legatura modificati vengono utilizzati per chiudere le clip di legatura a un diametro predefinito e costante. Ciò rende il metodo indipendente dall'operatore e riduce la variabilità correlata al PTB nel fenotipo della malattia 15,27,28.

È stato dimostrato che i modelli di PTB murino inducono ipertrofia e fallimento del ventricolo destro18,28. Una delle principali sfide quando si utilizza il modello PTB è la scelta del diametro PTB appropriato per ottenere il grado desiderato di patologia del ventricolo destro. Ciò è particolarmente impegnativo quando si tenta di modellare il guasto di un camper scompensato. Per questo, la costrizione deve essere abbastanza stretta da indurre l'insufficienza cronica del ventricolo destro senza portare all'insufficienza acuta del ventricolo destro e alla morte poco dopo l'intervento chirurgico6. Un approccio per risolvere questa sfida consiste nell'utilizzare animali svezzati o giovani 6,15. Un modello PTB è stato utilizzato con successo per studiare diversi stadi di cedimento del RV utilizzando svezzati di ratto Wistar15,30. Per raggiungere questo obiettivo, i ratti giovani con potenziale di crescita residuo sono stati sottoposti a chirurgia PTB con l'applicazione di clip di legatura in titanio. Quando i ratti sono cresciuti, la stenosi polmonare è diventata gradualmente più grave e ha provocato ipertrofia del ventricolo destro o insufficienza cronica del ventricolo destro, a seconda della gravità del PTB15,30. Ispirati da questo modello, abbiamo ipotizzato che diversi stadi della patologia del ventricolo destro potessero essere prodotti in un modello di PTB murino utilizzando topi giovani. Lo studio di un ampio spettro di patologie del ventricolo destro, dalla malattia lieve a quella grave, può aiutare a chiarire la nostra comprensione della progressione della malattia e la transizione dall'ipertrofia del ventricolo destro al fallimento del ventricolo destro.

Qui, presentiamo un modello murino di sovraccarico di pressione RV indotto da PTB in topi giovani. Con questo modello è possibile produrre diversi gradi di patologia del ventricolo destro, che vanno dall'ipertrofia del ventricolo destro al fallimento del ventricolo destro scompensato. Questo studio include protocolli dettagliati per l'intubazione, la chirurgia PTB e la fenotipizzazione mediante ecocardiografia.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo studio è stato approvato dall'Ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali (numero di autorizzazione: 2021-15-0201-00928) ed è stato eseguito in conformità con la legislazione nazionale sugli animali da laboratorio. Questo studio ha utilizzato topi maschi C57BL/6N di 5 settimane.

1. Personalizzazione degli strumenti per l'intubazione e la chirurgia (Figura 1)

NOTA: Questa sezione descrive in dettaglio le fasi più importanti nella preparazione di strumenti su misura per l'intubazione e la chirurgia PTB con materiali economici e facilmente reperibili.

  1. Preparare il tubo endotracheale (Figura 1A).
    I comuni cateteri endovenosi (IV) possono essere utilizzati per l'intubazione e la ventilazione dei topi.
    1. Scegliere la dimensione appropriata del catetere intravascolare corrispondente alle dimensioni dei topi. Si consiglia un catetere da 22 G per i topi di 5 settimane (17-20 g) e un catetere da 23 G per i topi più grandi (>20 g).
    2. Estrarre l'ago e staccare il meccanismo di bloccaggio. Reinserire l'ago nel catetere e tagliare la punta dell'ago con un angolo di 45°, a circa 2 mm dalla punta del catetere.
    3. Usa la carta vetrata per smussare la punta per evitare lesioni alle corde vocali dei topi.
    4. Tagliare un'ala del catetere per una migliore visuale durante l'intubazione.
  2. Preparare il divaricatore toracico (Figura 1B).
    1. Utilizzare un portaaghi per piegare un pezzo di filo metallico flessibile di circa 10 cm al centro con un angolo di 30°.
    2. Utilizzare il portaaghi per creare con cura ganci atraumatici di 5 mm di larghezza su entrambe le estremità del filo.
  3. Preparare il supporto per intubazione (Figura 1C).
    NOTA: L'uso di un supporto per intubazione consente l'erogazione continua dell'anestesia tramite un tubo nasale durante l'intubazione. Ciò consente un'intubazione controllata e sicura sotto guida visiva, riducendo il rischio di lesioni alle corde vocali e alla trachea, nonché il rischio di posizionamento errato del tubo nell'esofago. Qualsiasi telaio in metallo o plastica può essere utilizzato come telaio per il supporto per intubazione. In questo studio è stato utilizzato un titolare del ruolo di cucina leggermente piegato.
    1. Taglia un pezzo di tubo di gomma di 3 cm che si adatti al muso di un topo e collegalo a una valvola del catetere IV. L'anestesia inalante può essere collegata tramite la valvola prima dell'intubazione.
    2. Realizzare un cappio utilizzando una sutura intrecciata 1-0 a circa 5 mm dall'apertura del tubo. Questo verrà utilizzato per fissare il muso murino nel tubo.
    3. Praticare un foro vicino alla parte superiore di un foglio di plastica flessibile e posizionare il tubo nel foro. Il foglio viene utilizzato per sostenere il topo nel supporto per intubazione.
    4. Utilizzare del nastro adesivo per tenere insieme le singole parti come mostrato nella Figura 1C.
  4. Preparare la cannula di guida (Figura 1D, E).
    1. Tirare una sutura monofilamento 6-0 attraverso una cannula smussata da 27G e fare un nodo sulla sutura. Utilizzare questo nodo in seguito per afferrare la sutura durante l'intervento chirurgico PTB.
    2. Utilizzare un portaaghi per piegare la punta della cannula a un angolo di 80°.
  5. Prepara l'applicatore di clip per legatura.
    NOTA: Un applicatore di clip di legatura con ganasce angolate viene modificato con un meccanismo di arresto regolabile (Figura 1F), che interrompe la compressione della clip di legatura quando le ganasce si trovano a una distanza predeterminata con precisione l'una dall'altra. L'applicatore di clip di legatura modificato viene utilizzato per l'applicazione di clip di legatura in titanio sul tronco polmonare.
    1. Fissare un pezzo di ottone tagliato su misura alle maniglie dell'applicatore di clip per legatura con due viti. Montare una vite regolabile al centro (Figura 1F, freccia bianca) che determina la distanza esatta tra le impugnature compresse dell'applicatore di clip di legatura, che corrisponde a una distanza precisa tra le ganasce.

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Figura 1: Strumenti per l'intubazione e la chirurgia PTB. (A) Tubo endotracheale costituito da un catetere IV. (B) Divaricatore toracico. (C) Supporto per intubazione e topo posizionato nel supporto per intubazione che riceve anestesia su un tubo nasale. (D) Strumenti chirurgici e applicatore di clip di legatura modificato utilizzati per la chirurgia PTB. (E) Cannula di guida. (F) Meccanismo di arresto regolabile su misura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Regolazione dell'applicatore di clip di legatura

  1. Scegliere il diametro interno della clip di legatura in base alla gravità desiderata del guasto del ventricolo destro. Per i topi maschi C57BL/6N di 5 settimane (17-20 g), utilizzare un diametro della clip di 250 μm per i carichi gravi e di 450 μm per i sovraccarichi di pressione ventricolare ventricolare sinistra. Utilizzare diametri di clip intermedi per indurre un moderato sovraccarico di pressione.
  2. Utilizzare filo metallico o aghi per regolare l'applicatore di clip per legatura. Assicurarsi che il diametro del filo corrisponda al diametro della clip desiderato.
  3. Caricare l'applicatore di clip con una clip di legatura e posizionare il filo di regolazione al centro della clip di legatura. Mentre si comprime l'applicatore di clip, ruotare la vite finché le ganasce della clip non si adattano perfettamente al filo. Assicurarsi che la clip rimanga in posizione sul cavo di regolazione una volta rilasciato l'applicatore di clip.
  4. Con l'applicatore di clip regolato, posizionare un'altra clip di legatura sul filo di regolazione per convalidare il diametro impostato.

3. Preparativi per l'intervento chirurgico

  1. Indurre l'anestesia in una camera di induzione utilizzando il 7% di sevoflurano in 0,6 L/min di ossigeno al 100%. Confermare un'anestesia sufficiente pizzicando le dita dei piedi prima dell'intubazione.
    NOTA: Può essere utilizzato anche l'isoflurano. Tenere presente che è necessario utilizzare concentrazioni diverse.
  2. Intubare il topo con un catetere IV 22G. Eseguire l'intubazione sotto guida visiva, utilizzando un microscopio operatorio e un supporto per intubazione, consentendo un corretto allineamento per la visualizzazione delle corde vocali e l'erogazione continua di anestetici inalanti su un tubo nasale (Figura 1C).
  3. Ventilare il mouse a 175 colpi/min e un volume corrente di 300 μL/corsa.
    NOTA: Si raccomandano anche volumi correnti di 8-10 μL/g e il volume corrente ideale dipende da possibili perdite e spazi morti nel sistema di ventilazione.
  4. Posizionare il mouse intubato su un termoforo coperto (37 °C) e applicare un unguento idratante sugli occhi del topo.
  5. Mantenere l'anestesia (3,5% di sevoflurano in 0,6 L/min di ossigeno al 100%) e somministrare 0,1 mg/kg di buprenorfina e 5 mg/kg di carprofene per via sottocutanea per l'analgesia perioperatoria. Rimuovere tutti i peli dal torace utilizzando una crema depilatoria e disinfettare la pelle con salviette disinfettanti.

4. Chirurgia PTB

  1. Praticare un'incisione di 10 mm nella pelle sopra il secondo spazio intercostale dall'angolo sternale alla linea ascellare anteriore sinistra. Dividere i muscoli pettorali maggiori e minori mediante dissezione smussata.
  2. Tagliare i muscoli intercostali nel secondo spazio intercostale e sezionare senza mezzi termini il timo per esporre il cuore, il tronco polmonare e l'aorta. Posizionare un divaricatore toracico nello spazio intercostale per mantenere accessibile il campo operatorio.
    NOTA: È necessario prestare molta attenzione quando si tagliano i muscoli intercostali, poiché l'arteria mammaria interna sinistra corre solo 1-2 mm lateralmente rispetto allo sterno. La lesione di questa arteria può causare una significativa perdita di sangue.
  3. Separare il tronco polmonare dall'aorta ascendente rimuovendo senza mezzi termini il tessuto connettivo tra i vasi utilizzando una pinza microscopica. Migliora ulteriormente l'esposizione del tronco polmonare ruotando la parte inferiore del corpo del topo (gamba sinistra su gamba destra).
  4. Far passare la cannula di guida attraverso il seno pericardico trasverso posteriormente al tronco polmonare. Usa una pinza per afferrare il nodo sulla punta della cannula di guida e tirare la sutura attraverso la cannula di guida. Rimuovere con cautela la cannula di guida mentre la sutura rimane in posizione attorno al tronco polmonare.
  5. Caricare l'applicatore della clip di legatura e utilizzare la sutura per guidare il tronco polmonare nelle ganasce della clip di legatura e comprimere la clip. Rilasciare la sutura immediatamente dopo il posizionamento della clip e osservare il riempimento del tronco polmonare.
    NOTA: La bradicardia può essere osservata nei primi secondi dopo l'applicazione della clip di legatura.
  6. Posizionare una sutura assorbibile in monofilamento 6-0 attorno alla seconda e alla terza costa e chiudere lo spazio intercostale. Evacuare quanta più aria possibile dalla cavità toracica esercitando una leggera pressione sul torace mentre si stringe la sutura.
  7. Infine, sutura la pelle con una sutura assorbibile in monofilamento 6-0.
  8. Eseguire la stessa procedura, ad eccezione del posizionamento della clip di legatura (passaggio 4.5), durante l'intervento chirurgico fittizio.

5. Ecocardiografia

  1. Dopo l'induzione dell'anestesia in una camera di induzione (1-2 minuti, 6% di sevoflurano in ossigeno al 100%), mantenere l'anestesia utilizzando un tubo nasale (3,5% di sevoflurano in ossigeno al 100%). Rimuovere tutti i peli dal torace e dall'addome utilizzando una crema depilatoria e posizionare il mouse su un termoforo. Applicare un unguento idratante sugli occhi e un gel per ultrasuoni sul petto del topo.
    NOTA: Regola il guadagno 2D, la profondità di messa a fuoco e la profondità dell'immagine per migliorare la qualità dell'immagine in tutte le misurazioni ecocardiografiche.
  2. Regolare la sonda a ultrasuoni per trovare la vista dell'asse lungo parasternale (PLAX) (Figura 2). In PLAX, misurare il diametro interno del tronco polmonare e l'integrale velocità-tempo (VTI) nel tronco polmonare.
    1. Selezionare la modalità B e spostare con cautela il termoforo sugli assi x, y e z per identificare il tronco polmonare al centro dell'immagine. Usa il colore per identificare il diametro del tronco polmonare più grande. Utilizzare cine store per acquisire una sequenza per la misurazione del diametro del tronco polmonare.
    2. Selezionare il colore e l'onda del polso (PW) Doppler e posizionare il cursore al centro del tronco polmonare. Regolare l'angolo PW fino a quando le linee tratteggiate sono parallele al flusso sanguigno nel vaso.
    3. Premere cine store per misurare il VTI. Posizionare il cursore vicino a entrambe le pareti del tronco polmonare e premere nuovamente cine store per acquisire il flusso vicino alla parete del vaso.
      NOTA: Il diametro interno del ventricolo destro (RV) e lo spessore della parete libera RV possono essere valutati anche nella vista PLAX.
  3. Trova la vista dell'asse corto parasternale (PSAX) (Figura 3) per misurare i diametri interni del ventricolo sinistro (LV), che può essere utilizzato per valutare il rigonfiamento del setto nasale (configurazione D).
    1. Selezionare la modalità B e ruotare la sonda di 90° in senso antiorario. Inclinare la sonda di 20-30 gradi lateralmente per evitare l'ombreggiamento del ventricolo destro da parte dello sterno e inclinare la sonda di 20-30 gradi cranialmente fino a quando il ventricolo sinistro è il più rotondo possibile. Quindi, far scorrere la sonda in direzione cranio-caudale per identificare il livello dei muscoli papillari con i diametri ventricolari più grandi e premere cine store.
      NOTA: PSAX a livello mediopapillare può essere utilizzato anche per valutare la variazione dell'area frazionaria del ventricolo destro. Il PSAX a livello della valvola aortica può essere utilizzato per misurare l'accorciamento frazionato del ventricolo destro o lo spessore della parete libera del ventricolo destro.
  4. Utilizzare la vista apicale a 4 camere (A4CH) (Figura 4) per misurare l'escursione sistolica del piano anulare tricuspidale (TAPSE) e valutare il rigurgito tricuspidale.
    1. Posizionare la sonda come mostrato nella Figura 4. Una volta identificato il cuore, apportare piccole modifiche alla sonda utilizzando solo il polso e le dita per identificare tutte e quattro le camere del cuore e la valvola tricuspide.
      1. Identificare e mantenere una buona visuale A4CH è una sfida. Lasciare che la mano che aziona la sonda poggi sul termoforo per stabilità. Far scorrere, inclinare e ruotare leggermente la sonda fino a trovare l'immagine appropriata.
      2. Muovi la sonda solo in una dimensione alla volta: ad esempio, fai scorrere il cranio-caudale per trovare il cuore, quindi inclina la sonda per identificare tutte e quattro le camere e infine ruota la sonda fino a quando tutte e quattro le camere e la valvola tricuspide sono nel telaio. Se necessario, ripetere più volte tutti e tre i passaggi prima di ottenere l'immagine ideale.
    2. Una volta identificata la valvola tricuspide, selezionare la modalità M e posizionare la linea tratteggiata nell'anulus tricuspidale della parete libera. Premere cine store per salvare le misurazioni.
    3. Selezionare il colore per valutare la valvola tricuspide per il rigurgito. Se è presente rigurgito, in sistole si vedrà un getto di flusso retrogrado dal ventricolo destro all'atrio destro (RA) (Figura 5).
      NOTA: Nella vista A4CH, possono essere misurati anche il Doppler tissutale nella parete libera del ventricolo destro e la velocità di afflusso del ventricolo destro.

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Figura 2: Vista parasternale dell'asse lungo (PLAX). (A-D) Posizionamento della sonda ad ultrasuoni. (E, F) Il cuore murino normale in PLAX. (G, H) Dilatazione e ipertrofia del ventricolo destro dopo PTB. Abbreviazioni: LV: ventricolo sinistro, RV: ventricolo destro, PV: valvola polmonare, PT: tronco polmonare, Ao: aorta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Vista dell'asse corto parasternale (PSAX). (A-D) Posizionamento della sonda ad ultrasuoni. (E, F) Il normale cuore murino in PSAX. (G, H) PSAX dopo PTB. Abbreviazioni: LV: ventricolo sinistro, RV: ventricolo destro, PM: muscolo papillare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Vista apicale a 4 camere (A4CH). (A-D) Posizionamento della sonda a ultrasuoni. (E, F) Il normale cuore murino nella vista A4CH. (G, H) Dilatazione del ventricolo destro e dell'artrite reumatoide dopo PTB. Abbreviazioni: LV: ventricolo sinistro, RV: ventricolo destro, RA: atrio destro, LA: atrio sinistro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Rigurgito tricuspidale visualizzato dal color Doppler nella vista A4CH. (A) Nella diastole, si osserva il flusso dall'AR al ventricolo destro (freccia). (B) Durante la sistole, è visibile un sottile getto di flusso dal ventricolo destro all'artrite reumatoide (freccia). Abbreviazioni: LV: ventricolo sinistro, RV: ventricolo destro, RA: atrio destro, LA: atrio sinistro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Analisi dei dati

  1. Misurare il diametro del tronco polmonare in tre cicli cardiaci in PLAX e utilizzare il diametro medio del tronco polmonare per ulteriori analisi dei dati. Misurare il VTI in tre cicli cardiaci in PLAX per ciascuno dei tre cine loop memorizzati (al centro del tronco polmonare e vicino alle pareti del vaso). Utilizzare il VTI medio di tutte le misurazioni VTI per ulteriori analisi. Utilizzare la seguente formula per calcolare il CO:
    figure-protocol-6
    figure-protocol-7 : radio del tronco polmonare, FC: frequenza cardiaca
  2. Misurare LVEI in PSAX a livello mediopapillare. Utilizzare uno strumento di misurazione per misurare il diametro interno del ventricolo sinistro più grande (LVid1) dalla metà del setto alla parete libera. Quindi, misurare il diametro interno del ventricolo sinistro ortogonale alla prima misurazione (LVid2). Ripetere queste misurazioni in tre cicli cardiaci e calcolare il LVEI utilizzando i diametri interni medi del ventricolo sinistro e la seguente formula:
    figure-protocol-8
  3. Misura TAPSE in tre cicli cardiaci nella vista A4CH e utilizza TAPSE medio per ulteriori analisi dei dati.

7. Cateterismo cardiaco destro

  1. Misurare la pressione e il volume del ventricolo destro (RV) mediante cateterismo cardiaco destro con un catetere a micropunta da 1,4 F 3 settimane dopo l'intervento chirurgico PTB.
  2. Anestetizzare e intubare il topo come descritto nei passaggi 3.1-3.4. Posizionare il mouse su un termoforo coperto (37 °C) e mantenere l'anestesia (3,5% di sevoflurano in 0,6 L/min 100% di ossigeno).
  3. Somministrare 2000 UI di eparina (intramuscolare [i.m.]) e 0,5 mL di NaCl (sottocutaneo [s.c.]).
  4. Usando le forbici chirurgiche, tagliare la parete addominale appena caudalmente al processo xifoideo e ottenere l'accesso alla cavità toracica tagliando con cura il diaframma lungo la sua incisione nella parete toracica. Tagliare il diaframma e le coste fino a ottenere un accesso sufficiente al cuore.
  5. Posizionare una legatura attorno alla vena cava inferiore. Utilizzare questa opzione per occludere il recipiente per ridurre il precarico per la registrazione delle misure di pressione-volume più avanti nel protocollo.
  6. Utilizzare un ago da 26 G per praticare con cautela un piccolo foro nel ventricolare. Assicurarsi che sia il più vicino possibile all'apice e che l'ago non penetri completamente nel ventricolo, ma funga semplicemente da guida per l'inserimento del catetere di conduttanza. In caso di sanguinamento, applicare una leggera pressione con un piccolo batuffolo di cotone per ridurre al minimo la perdita di sangue.
  7. Identificare il piccolo foro nella parete ventricolare e inserire il catetere penetrando nel tessuto.
    NOTA: Quando si inserisce il catetere, fare attenzione a non danneggiare la parete ventricolare interna.
  8. Le variazioni della pressione ventricolare destra (RVP) si osservano spesso per diversi minuti dopo l'inserimento del catetere. Attendere che RVP si stabilizzi per ottenere misurazioni rappresentative allo stato stazionario.
  9. Per ottenere anse pressione-volume, utilizzare la legatura precedentemente posizionata intorno alla vena cava inferiore. Tirare con cautela la legatura per occludere il vaso, riducendo così gradualmente il precarico.
  10. Una volta registrati i loop rappresentativi di pressione-volume, estrarre il catetere e sopprimere il topo mediante escissione del cuore. A questo punto, raccogliere campioni di sangue e tessuti per ulteriori analisi.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I topi C57BL/6N (maschi, 5 settimane, 17-20 g) sono stati randomizzati a PTB grave (sPTB, 250 μm, n = 12), PTB lieve (mPTB, 450 μm, n = 9) o chirurgia fittizia (sham, n = 15). La valutazione della funzione cardiaca è stata eseguita mediante ecocardiografia 1 settimana e 3 settimane dopo l'intervento chirurgico. Il cateterismo cardiaco destro con successiva eutanasia è stato eseguito 3 settimane dopo l'intervento. Gli organi sono stati pesati e il tessuto cardiaco è stato preparato per le analisi istologiche.

L'ecocardiografia 1 settimana dopo l'intervento chirurgico ha rivelato segni di elevata pressione ventricolare destra e disfunzione del ventricolo destro in sPTB rispetto ai gruppi mPTB e sham. La disfunzione del ventricolo destro era evidente dalla diminuzione della gittata cardiaca (CO) e dalla TAPSE (Figura 6A, B). La diminuzione dell'indice di eccentricità ventricolare sinistra (LVEI) indicava un aumento della pressione ventricolare sinistra (Figura 6C). Pertanto, gli interventi di inversione possono essere studiati già dopo 1 settimana in modelli di PTB grave. Il gruppo mPTB ha mostrato segni ecocardiografici di elevata pressione del ventricolo destro rispetto allo sham (diminuzione della LVEI) dopo 1 settimana, ma nessun segno di disfunzione del ventricolo destro come valutato dall'ecocardiografia (Figura 6).

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Figura 6: Misurazioni ecocardiografiche 1 settimana dopo l'intervento chirurgico. (A) Gittata cardiaca (CO). (B) Escursione sistolica sul piano anulare tricuspide (TAPSE). (C) Indice di eccentricità ventricolare sinistra (LVEI). Abbreviazioni: mPTB: lieve bendaggio polmonare del tronco (PTB); sPTB: PTB grave. I dati sono presentati da grafici a dispersione con medie ± SD. *p < 0,05, **p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dopo 3 settimane, gli effetti dell'intervento chirurgico di PTB erano accentuati nella sPTB con un'ulteriore riduzione della gittata cardiaca e una consistente diminuzione della TAPSE rispetto alla sham (Figura 7A, B). Non è stata osservata alcuna differenza nei parametri ecocardiografici tra i gruppi mPTB e sham dopo 3 settimane (Figura 7A, B).

Il cateterismo cardiaco destro ha rivelato un aumento della pressione sistolica del ventricolo destro (RVSP) in entrambi i gruppi PTB rispetto allo sham 3 settimane dopo l'intervento chirurgico (Figura 7C). La funzione diastolica del ventricolo destro è stata influenzata nel gruppo sPTB, indicata da un aumento dell'elastanza telediastolica del ventricolo destro (Eed), una misura indipendente dal carico della rigidità del ventricolo destro (Figura 7D). Anche la contrattilità del ventricolo destro, valutata mediante elastanza telesistolica (Ees), è risultata aumentata nel gruppo sPTB rispetto allo sham, mentre il gruppo mPTB ha mostrato un aumento non significativo (Figura 7E).

Le misurazioni anatomiche hanno rivelato un aumento dell'ipertrofia del ventricolo destro con l'aumento della gravità del PTB espresso da un aumento graduale del rapporto tra peso del ventricolo destro e peso corporeo (RV/BW) (Figura 7F). La RVSP era linearmente proporzionale al grado di ipertropia del ventricolo destro (Figura 7G). L'area della sezione trasversale dei cardiomiociti (CSA) del RV ha confermato un aumento del 40% dell'ipertrofia del ventricolo destro in sPTB rispetto a sham, mentre c'è stato un aumento non significativo di mPTB rispetto a sham (Figura 8A-D). Il grado di fibrosi nel ventricolo destro e nell'atrio destro (RA) era sette volte superiore nella sPTB rispetto alla sham. Non è stato osservato alcun aumento della fibrosi del ventricolo destro nell'mPTB (Figura 8E-H).

Il rigurgito tricuspidale (TR) è stato osservato nel 64% del gruppo sPTB dopo 1 settimana e nel 91% a 3 settimane, mentre non è stato riscontrato alcun TR nei gruppi sham e mPTB (dati non mostrati). Vari gradi di scolorimento del fegato, un segno di scompenso extracardiaco, sono stati osservati nel gruppo sPTB (Figura 9). Non è stato osservato alcuno scolorimento nei gruppi mPTB e sham.

In sintesi, mostriamo una correlazione tra il diametro del banding e la gravità della malattia. Il gruppo mPTB imita uno stadio precoce della malattia con lieve ipertrofia del ventricolo destro senza disfunzione del ventricolo destro, mentre il gruppo sPTB mostra segni di disfunzione e fallimento del ventricolo destro.

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Figura 7: Misurazioni ecocardiografiche, del volume pressorio invasivo e anatomiche 3 settimane dopo l'intervento chirurgico. (A) Gittata cardiaca (CO). (B) Escursione sistolica sul piano anulare tricuspide (TAPSE). (C) Pressione sistolica ventricolare destra (RVSP). (D) Elastanza telediastolica (Eed). (E) Elastanza telesistolica (Ees). (F) Rapporto tra il peso del ventricolo destro e il peso corporeo (RV/BW). (G) Correlazione tra la pressione sistolica del ventricolo destro (RVSP) e il peso del RV/BW a 3 settimane dall'intervento. È stata eseguita un'analisi di regressione lineare che viene presentata nel grafico. R2 rettificato = 0,75, p < 0,001. Abbreviazioni: mPTB: lieve bendaggio polmonare del tronco (PTB); sPTB: PTB grave. I dati normalmente distribuiti sono presentati da grafici a dispersione con medie ± SD. I dati normalmente distribuiti sono presentati da boxplot con mediane con IQR e con baffi che rappresentano valori entro 1,5 x IQR da Q1 e Q3, rispettivamente *p < 0,05, **p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Analisi istologiche del tessuto RV. (A) Area della sezione trasversale RV. (B-D) HE ha colorato il tessuto RV da (B) sham, (C) mPTB e (D) sPTB. (E) Percentuale di fibrosi interstiziale rispetto al tessuto sano nel ventricolo destro. (F-H) Tessuto ventricolare destro colorato con Picrosirius da (F) sham, (G) mPTB e (H) sPTB. Barre di scala: (B-D) = 50 μm, (F-H) = 250 μm. I dati sono presentati da boxplot con mediane, IQR e baffi che rappresentano valori entro 1,5 x IQR da Q1 e Q3, rispettivamente. *p < 0,05, **p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Diversi gradi di scolorimento del fegato. Lo scolorimento è stato valutato da 0 a 3. La valutazione si basava sul grado di aspetto maculato e sul colore del tessuto epatico. Le immagini sono state scattate al microscopio, facendo apparire il tessuto più chiaro rispetto all'illuminazione ambientale. (A) 0: fegato normale. (B) 1: Macchie chiare senza scolorimento. (C) 2: macchie moderate e leggero scolorimento. (D) 3: Gravi macchie e scolorimento (fegato di noce moscata). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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In questo articolo, presentiamo un modello murino di ipertrofia e fallimento del ventricolo destro indotto da sovraccarico di pressione. Dimostriamo che: (i) il PTB nei topi giovani può indurre vari gradi di patologia del ventricolo destro, che vanno da una lieve ipertrofia del ventricolo destro all'insufficienza del ventricolo destro con segni extracardiaci di scompenso e fibrosi del ventricolo destro istologicamente confermata. (ii) I segni di disfunzione del ventricolo destro possono essere osservati e quantificati mediante ecocardiografia a 1 e 3 settimane dopo l'intervento chirurgico di PTB. (iii) Il grado di ipertrofia del ventricolo destro è proporzionale alla gravità del PTB e al conseguente aumento della pressione del ventricolo destro. Questo modello può aiutare a chiarire la patogenesi dell'insufficienza ventricolare destra secondaria al sovraccarico di pressione del ventricolo destro, poiché dimostriamo che il modello PTB è adatto per studiare diversi stadi della patologia del ventricolo destro.

Per garantire il successo e la riproducibilità del modello di PTB murino, è necessario prestare grande attenzione ai seguenti passaggi. (i) Scegliere il diametro appropriato della clip di legatura. Il giusto diametro della clip dipende da diversi fattori, come il grado desiderato di sovraccarico di pressione del ventricolo destro e il tempo di follow-up. Anche l'età e il peso corporeo dei topi sono fattori importanti da considerare. Di conseguenza, il protocollo può essere adattato in base alla questione scientifica attuale. Per questo motivo, si consiglia di eseguire interventi chirurgici pilota ed ecocardiografia in momenti rilevanti dopo l'intervento chirurgico per valutare l'idoneità dei diametri di clip selezionati. (ii) La regolazione precisa dell'applicatore di clip è essenziale per garantire una patologia riproducibile. Si consiglia di utilizzare filo metallico o cannule con un diametro esterno ben definito come guida per regolare l'applicatore della clip di legatura. (iii) La perdita di sangue è stata la complicanza grave più frequente durante l'intervento chirurgico PTB e la causa più comune di mortalità peri e postoperatoria. Per limitare la perdita di sangue, utilizzare strumenti microchirurgici contundenti e dissezione smussata quando possibile. Utilizzare le forbici chirurgiche solo quando indicato nel protocollo. (iv) Un'altra causa di mortalità perioperatoria sono le aritmie cardiache. Brevi episodi di bradicardia possono verificarsi durante la dissezione del tronco polmonare e l'applicazione della clip legante. Per ridurre il rischio di arresto cardiaco, il tempo di manipolazione del tronco polmonare deve essere limitato. Quando si osserva bradicardia, sospendere la manipolazione del tronco polmonare fino a quando la frequenza cardiaca non si è normalizzata. (v) La valutazione ecocardiografica riproducibile può essere impegnativa e richiede formazione prima di ottenere risultati riproducibili. A causa delle dimensioni ridotte del camper, è particolarmente difficile ottenere una buona visualizzazione del RV nei topi operati con sham in vista PLAX e A4CH. (vi) La frequenza cardiaca può variare significativamente durante la valutazione ecocardiografica. Per ridurre la variabilità, monitorare attentamente la frequenza cardiaca e utilizzare basse dosi di anestesia garantendo un'anestesia sufficiente.

Un limite del modello PTB murino è la necessità di attrezzature chirurgiche e formazione. Gli interventi chirurgici dei piloti devono sempre essere eseguiti per l'addestramento e i metodi devono essere adattati alle attrezzature disponibili localmente. Abbiamo utilizzato clip di legatura in titanio, che si sono rivelate un metodo altamente riproducibile per l'induzione del sovraccarico di pressione RV15. Inoltre, è stato dimostrato che l'uso di clip di legatura comporta una minore mortalità perichirurgica e un migliore recupero post-chirurgico rispetto alle legature chirurgiche31.

L'ecocardiografia per la valutazione della funzione del ventricolo destro presenta alcune limitazioni, in quanto è operatore-dipendente, e la variabilità inter- e intra-operatore può influenzare i risultati dell'ecocardiografia. Nel presente studio, l'ecocardiografia è stata eseguita da due operatori. Per evitare distorsioni dovute alla variazione interosservatore, entrambi gli operatori hanno eseguito l'ecocardiografia su un numero uguale di topi di tutti i gruppi. Inoltre, l'ecocardiografia nei topi ha le sue sfide. Ciò è particolarmente vero nei topi piccoli e relativamente sani, come evidenziato dalla maggiore variazione delle misurazioni di CO e TAPSE a 1 settimana (Figura 5) rispetto a 3 settimane (Figura 6). Per ottenere una misurazione più accurata del CO, la VTI nel tronco polmonare è stata misurata in tre cicli cardiaci in tre diverse posizioni (al centro del tronco polmonare e vicino alle pareti del vaso). Inoltre, è stato dimostrato che l'ecocardiografia sovrastima il CO rispetto alla risonanza magnetica nei ratti sottoposti a PTB32. La risonanza magnetica è il gold standard per la misurazione del CO nei topi e può quindi essere presa in considerazione quando si utilizza l'attuale modello32. Un'altra sfida nei topi con un aumento minimo o nullo della pressione del ventricolo destro, è la piccola dimensione del ventricolare, che complica una buona vista A4CH da misurare, ad esempio TAPSE. Ciò può comportare una sottostima di TAPSE in alcuni topi nei gruppi sham e mPTB. Nonostante queste sfide, sono stati raggiunti risultati statisticamente significativi per CO e TAPSE in sPTB rispetto a sham e mPTB. Ciò dimostra che CO e TAPSE sono utili marcatori della funzione del ventricolo destro nel presente modello, ma evidenzia anche la necessità di un'ampia formazione dei ricercatori prima della valutazione ecocardiografica dei topi.

Una limitazione intrinseca di tutti i modelli animali è che i risultati non possono essere estrapolati direttamente all'uomo a causa di differenze genetiche e fisiologiche.

Per quanto ne sappiamo, questo è l'unico modello di PTB nei topi giovani. Questo approccio è stato utilizzato nei ratti, dove si sviluppa un aumento graduale e lento del postcarico man mano che i ratti crescono. Questa induzione più lenta della malattia imita meglio lo sviluppo dell'insufficienza cronica del ventricolo destro15.

L'attuale protocollo include due gruppi distinti di topi con diversi gradi di disfunzione del ventricolo destro. Per quanto ne sappiamo, nessun altro modello di PTB murino pubblicato include un gruppo con solo lieve ipertrofia del ventricolo destro senza segni di disfunzione del ventricolo destro, compromissione emodinamica o fibrosi. Questa fase iniziale della malattia è quindi in gran parte trascurata. Lo studio di questa fase iniziale dello sviluppo della malattia può aumentare la nostra comprensione della progressione graduale dall'ipertrofia del ventricolo destro all'insufficienza del ventricolo destro osservata nei pazienti con PAH17 cronica.

In questo modello, la patologia dell'insufficienza cronica del ventricolo destro si sviluppa entro 3 settimane dall'intervento chirurgico, rendendolo uno dei modelli più efficienti in termini di tempo di insufficienza cronica del ventricolo destro6. Altri modelli di PTB murino riportano durate di studio da 1 a 8 settimane 17,18,33,34,35. Abbiamo osservato segni di disfunzione del ventricolo destro già 1 settimana dopo l'intervento chirurgico in sPTB. Questo approccio efficiente in termini di tempo con un follow-up di 3 settimane, tuttavia, presenta dei limiti. I topi non sono completamente cresciuti a 8 settimane e un follow-up più lungo potrebbe portare a una stenosi del tronco polmonare sempre più grave e a un fallimento del ventricolo destro ancora più grave.

I topi geneticamente modificati sono prontamente disponibili e nuovi ceppi geneticamente modificati possono essere prodotti nei topi in modo relativamente rapido ed efficiente in termini di tempo36. Ciò costituisce un grande vantaggio dei modelli di PTB murino rispetto ai modelli che utilizzano ratti o mammiferi più grandi.

In conclusione, presentiamo un modello murino riproducibile di ipertrofia e fallimento del ventricolo destro indotto da sovraccarico di pressione in topi giovani. Nel documento sono inclusi protocolli dettagliati per l'intubazione, la chirurgia e la fenotipizzazione mediante ecocardiografia. Per l'intubazione e la chirurgia vengono utilizzati strumenti su misura, che consentono una riproduzione rapida ed economica del modello. Il modello può essere utilizzato per identificare i meccanismi che governano l'adattamento del ventricolo destro al sovraccarico di pressione, nonché i processi alla base della patologia del ventricolo destro che alla fine portano al fallimento del ventricolo destro. Infine, il modello può essere utilizzato per testare nuovi bersagli terapeutici per il trattamento dell'insufficienza ventricolare destra.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da Snedkermester Sophus Jacobsen og Hustru Astrid Jacobsens Fond, Helge Peetz og Verner Peetz og hustru Vilma Peetz Legat, Grosserer A.V. Lykfeldt og Hustrus Legat. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare il personale delle strutture per animali presso il Dipartimento di Medicina Clinica dell'Università di Aarhus, per il loro supporto durante l'esecuzione del lavoro sperimentale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Biosyn 6-0, monofilamento, sutura assorbibileCovidienUM-986
Cannula smussata, 27G 0,4x0,25, Sterican292832
Bupaq Multidose veterinario 0,3 mg/ml (Buprenorphinum)Salfarm DanmarkVNR 472318
C57BL/6NTac topiTaconic BiosciencesC57BL/6NTac
Dagrofil 1, sutura intrecciata e non assorbibileB BraunC0842273
Crema depilatoria Veet 3132000
Tamponi di disinfezione (82% etanolo + 0,5% clorexidina)Mediq3340122
Bisturi monouso, misura 11Swann-Morton11708353
Drä ger Vapor 2000 SevofluranoDrä gerM35054
Unguento per gli occhi neutro, "Ophta"ActavisMTnr.: 07586 Vnr: 53 96 68
Clip per legatura dell'orizzonteTeleflex Medical5200 (IPN914931)
Applicazione di clip per legatura aperta dell'orizzonte, curva, 6" (15 cm)Teleflex Medical537061
Porta rotolo da cucinan.a.n.a.
. set
50
mg/ml (Carprofen)ZoetisMTnr: 34547, Vnr: 10 27 99,Sevoflurano
Baxter 100 %Baxter MedicalMTnr: 35015
Tubo in siliconen.a.n.a.Foglio
di plastica morbida
, "Opmi Pico"Carl Zeiss Surgicals GmbHn.a.Portasonda
ad ultrasuoni/binarioVisual Sonics11277
Piastra di Varming Visual sonics11437
Venflon ProSafety, 22G, 0,9 x 25mmBecton Dickinson393222
di strumenti microchirurgici n.a.n.a.MiniVent Ventilatore Hugo Sachs Tipo 845 MS505S di diverso spessore n.a.n.a.Stereomicroscopio

Riferimenti

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