Profilazione del pH luminale in organoidi gastrointestinali tridimensionali mediante microelettrodi

Sommario

Il presente protocollo descrive le misure di pH in organoidi gastrici derivati da tessuti umani utilizzando microelettrodi per la caratterizzazione spazio-temporale della fisiologia intraluminale.

Abstract

L'ottimizzazione e la caratterizzazione dettagliata dei modelli di organoidi gastrointestinali richiedono metodi avanzati per l'analisi dei loro ambienti luminali. Questo articolo presenta un metodo altamente riproducibile per la misurazione precisa del pH all'interno della lumina di organoidi gastrici umani 3D tramite microelettrodi controllati da micromanipolatore. I microelettrodi di pH sono disponibili in commercio e sono costituiti da punte di vetro smussate di 25 μm di diametro. Per le misurazioni, il microelettrodo di pH viene fatto avanzare nel lume di un organoide (>200 μm) sospeso in Matrigel, mentre un elettrodo di riferimento rimane immerso nel terreno circostante nella piastra di coltura.

Utilizzando tali microelettrodi per profilare organoidi derivati dal corpo gastrico umano, dimostriamo che il pH luminale è relativamente coerente all'interno di ciascun pozzetto di coltura a ~7,7 ± 0,037 e che le misurazioni continue possono essere ottenute per un minimo di 15 minuti. In alcuni organoidi più grandi, le misurazioni hanno rivelato un gradiente di pH tra la superficie epiteliale e il lume, suggerendo che le misure di pH negli organoidi possono essere ottenute con un'alta risoluzione spaziale. In uno studio precedente, i microelettrodi sono stati utilizzati con successo per misurare le concentrazioni di ossigeno luminale negli organoidi, dimostrando la versatilità di questo metodo per l'analisi degli organoidi. In sintesi, questo protocollo descrive un importante strumento per la caratterizzazione funzionale dello spazio luminale complesso all'interno di organoidi 3D.

Introduzione

Gli organoidi – strutture multicellulari in miniatura derivate da cellule staminali – hanno rivoluzionato la nostra capacità di studiare la fisiologia umana e stanno iniziando a sostituire i modelli animali, anche in contesti normativi¹. Dalla descrizione iniziale degli organoidi intestinali da parte di Sato et al. nel 2009, la tecnologia degli organoidi è diventata immensamente popolare². Un gran numero di studi ha caratterizzato la composizione cellulare e la funzione dei modelli di organoidi in grande dettaglio 3,4,5,6. Tuttavia, lo spazio luminale di queste strutture multicellulari 3D rimane in gran parte indefinito ^7,8. Il lume è la cavità centrale degli organoidi derivati dai tessuti mucosi che è circondata dalle porzioni apicali delle cellule epiteliali polarizzate. Poiché la secrezione e l'assorbimento cellulare avvengono prevalentemente sulla superficie epiteliale apicale, il microambiente luminale degli organoidi è controllato da questi importanti processi fisiologici. I modelli di organoidi attualmente utilizzati dimostrano variazioni nei modelli di segnalazione cellulare, nella staminalità complessiva, nei gradienti di concentrazione dei metaboliti e nelle condizioni ambientali⁹. La comprensione della fisiologia luminale degli organoidi è quindi necessaria per la modellazione accurata della funzione e della patologia degli organi. Purtroppo, la relativa inaccessibilità del lume ostacola significativamente le analisi funzionali della fisiologia luminale negli organoidi 3D¹⁰.

La capacità di esaminare i profili di pH è particolarmente importante nello stomaco, che è noto per avere il gradiente protonico più ripido nel corpo, che va da circa 1-3 nel lume, a quasi neutro nell'epitelio 11,12,13. Rimane una lacuna significativa nella nostra comprensione del mantenimento su microscala del gradiente di pH gastrico e della rilevanza dei modelli organoidi nel ricapitolare questo ambiente dinamico attraverso lo strato di muco gastrico. Gli approcci tradizionali per l'analisi del pH degli organoidi hanno previsto l'uso di coloranti sensibili al pH, che possono essere indicatori fluorescenti o colorimetrici. McCracken et al. hanno utilizzato un'iniezione luminale di SNARF-5F-un indicatore raziometrico di pH in organoidi per analizzare un calo del pH luminale in risposta al trattamento con istamina. Tali coloranti possono essere incorporati nei terreni di coltura, consentendo un monitoraggio non invasivo e in tempo reale del pH. Non solo i coloranti sensibili al pH richiedono complesse fasi di calibrazione che contribuiscono a una scarsa affidabilità e precisione delle misurazioni, ma tali coloranti tendono anche a funzionare all'interno di intervalli di rilevamento specifici che potrebbero non essere rappresentativi dell'intero intervallo di pH all'interno del microambiente di interesse^14,15. Potrebbe essere considerato ragionevole, tuttavia, utilizzare coloranti indicatori per esperimenti di conferma. Sono stati sviluppati anche nanosensori ottici che utilizzano approcci di rilevamento del pH basati su optodi fluorescenti; Tuttavia, tali tecniche di rilevamento richiedono l'imaging microscopico e sono anche suscettibili al fotosbiancamento, alla fototossicità e alla distorsione dell'imaging^16,17. Inoltre, Brooks et al. hanno piastre multipozzetto stampate in 3D contenenti microelettrodi su cui gli organoidi possono essere placcati¹⁸. Questo approccio, tuttavia, non consente misurazioni direttamente all'interno del lume dell'organoide.

Le misure di pH basate su elettrodi possono ottenere una maggiore precisione rispetto ad altri metodi, oltre a fornire un monitoraggio del pH in tempo reale. Inoltre, gli elettrodi di pH montati sui micromanipolatori consentono una risoluzione spaziale superiore delle misure di pH, in quanto la posizione precisa della punta dell'elettrodo può essere controllata con precisione. Ciò consente la massima flessibilità e riproducibilità possibile nelle analisi dei modelli di organoidi. Gli elettrodi utilizzati qui sono microelettrodi di pH miniaturizzati che funzionano in base alla diffusione di protoni attraverso un vetro di pH selettivo che circonda un sottile filo di platino. Il microelettrodo è collegato a un elettrodo di riferimento Ag-AgCl esterno e quindi collegato a un millivoltmetro ad alta impedenza. Il potenziale elettrico tra le due punte degli elettrodi, quando immerse nella stessa soluzione, rifletterà il pH della soluzione¹⁹. Tali sistemi di microprofilazione sono stati utilizzati nell'analisi metabolica di biofilm^20,21, alghe planctoniche²², campioni di espettorato umano²³ e persino in sferoidi di cellule staminali mesenchimali²⁴. Sia il nostro laboratorio che Murphy et al. hanno precedentemente utilizzato microelettrodi O₂ controllati da micromanipolatore per valutare le concentrazioni di ossigeno negli spazi luminali degli organoidi. Murphy et al. hanno abbinato questo metodo con la modellazione matematica per rivelare un gradiente di ossigeno all'interno dei loro sferoidi. Il nostro gruppo è stato in grado di trovare livelli ridotti di ossigeno luminale negli organoidi gastrici derivati dai tessuti rispetto alla matrice extracellulare circostante²⁵.

Qui, forniamo un metodo dettagliato per la profilazione manuale del pH luminale con microelettrodi in organoidi sferici del tratto gastrointestinale che consentirà una migliore comprensione fisiologica del loro complesso microambiente luminale. Prevediamo che questa tecnica aggiungerà una nuova dimensione all'esplorazione della fisiologia degli organoidi attraverso misurazioni in tempo reale e ad alta risoluzione dei livelli di pH su microscala. Inoltre, il seguente protocollo potrebbe essere facilmente adattato per l'analisi di O₂, N₂O, H₂, NO, H₂S, redox e temperatura in vari tipi di modelli di organoidi. La profilazione fisiologica funge da strumento prezioso per ottimizzare le condizioni di coltura degli organoidi per imitare meglio gli ambienti in vivo , migliorando così la rilevanza e l'utilità dei modelli di organoidi nella ricerca biomedica.

Protocollo

Questo protocollo richiede organoidi 3D di almeno 200 μm di diametro che abbiano un lume distinto e che siano incorporati in una matrice extracellulare artificiale (ECM, ad es. Matrigel). I tessuti gastrici umani per la derivazione di organoidi sono stati ottenuti con l'approvazione dell'Institutional Review Board della Montana State University e il consenso informato di pazienti sottoposti a endoscopia superiore presso Bozeman Health (protocollo # 2023-48-FCR, a D.B.) o come campioni esenti di gastrectomia a stomaco intero o a manica dal National Disease Research Interchange (protocollo #DB062615-EX). Le informazioni sulle linee degli organoidi e sui numeri di passaggio utilizzati per questo studio sono fornite nella Tabella 1 e la composizione del terreno è elencata nella Tabella 2. Fare riferimento ai protocolli precedentemente pubblicati per la generazione e il mantenimento delle linee di organoidi gastrointestinali ^6,26,27.

1. Preparazione di organoidi gastrici umani per il profilo del pH

1. Avviare e mantenere le colture di organoidi gastrici utilizzando protocolli standard. Mantenere gli organoidi su piastre a 24 pozzetti in 500 μl di terreno di espansione per pozzetto (Tabella 2). Il passaggio ha stabilito linee di organoidi ogni 5-7 giorni, trasferendole su una piastra con fondo di vetro da 35 mm in preparazione per esperimenti di profilazione del pH.
   NOTA: Le colture di organoidi per i nostri esperimenti derivano da preparazioni di ghiandole gastriche, ottenute da tessuti adulti come descritto sopra. Utilizziamo un metodo di digestione tissutale della collagenasi per isolare queste ghiandole prima che vengano sospese nella ECM, come descritto in precedenza 25,28,29.
2. Da colture di organoidi in crescita attiva ai passaggi 1-15, selezionare pozzetti che contengano almeno 100 organoidi (circa 2 milioni di cellule) con diametri compresi tra 200 e 700 μm per il trasferimento e l'espansione su piastre di Petri da 3,5 mm.
3. Durante la preparazione degli organoidi per la placcatura (passaggi 1.4-1.8), lasciare scongelare le aliquote della matrice extracellulare (ECM) su ghiaccio per almeno 45 minuti. Mantenere l'ECM sul ghiaccio durante questo protocollo per prevenire la gelificazione. Preriscaldare le piastre per colture cellulari ponendole in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ .
4. Rimuovere il terreno dai pozzetti e raccogliere le colture di organoidi gastrici pipettando PBS ghiacciato su ciascuna gocciolina ECM e grattando il gel con la punta di una pipetta P1000. Pipettare il PBS con i frammenti ECM contenenti organoidi in una provetta conica da 15 mL.
5. Centrifugare la provetta a 200 × g a 4 °C per 5 minuti. I frammenti ECM contenenti gli organoidi saranno visibili come uno strato sul fondo della provetta. Aspirare con cautela il surnatante e pipettare 350 μl di tripsina-EDTA allo 0,25% in ciascuna provetta, mescolando delicatamente pipettando su e giù. Incubare le provette in un bagno d'acqua a 37 °C per 2-5 minuti.
6. Dopo l'incubazione con tripsina-EDTA, aggiungere 600 μL di DMEM ghiacciato con penicillina/streptomicina a ciascuna provetta e pipettare energicamente su e giù almeno 40x. Centrifugare a 200 × g a 4 °C per 5 min. Aspirare il surnatante. Per impostare le colture per le misure di pH, risospendere il pellet cellulare in ECM liquida e ghiacciata con un rapporto di 1:4 v/v tra pellet di organoidi ed ECM per la piastra.
7. Per ogni campione, lastra 40 μL di ECM liquida contenente organoidi/frammenti di organoidi in una sottile linea orizzontale lungo il diametro di una piastra con fondo di vetro di 35 mm.
   NOTA: L'erogazione del gel sulla piastra in linea anziché in una gocciolina rotonda consente un accesso più facile ai singoli organoidi diluendo la coltura.
8. Lasciare polimerizzare il gel per 15-30 minuti; quindi, aggiungere con cautela 2 mL di terreno di espansione dell'organoide alla piastra pipettando lungo il bordo del pozzetto per evitare di disturbare il gel.
9. Sostituisci i supporti a giorni alterni. Attendere 4-8 giorni affinché un minimo di 10 organoidi cresca fino a un diametro minimo di 400 μm.
10. Per procedere con un esperimento di profilazione del pH, assicurarsi che ogni coltura contenga almeno 10 organoidi che soddisfino i seguenti criteri: diametro di >200 μm, aspetto sano (poco o nessun materiale scuro visibile all'interno degli organoidi osservati con un microscopio a campo chiaro) e non sovraffollato da altri organoidi.

2. Disimballaggio e calibrazione dei microelettrodi

NOTA: Per consentire le misure su microscala, oltre al microelettrodo del sensore di pH viene utilizzato un elettrodo di riferimento separato anziché un design integrato (e quindi più ingombrante). Sia il microelettrodo pH che l'elettrodo di riferimento devono essere conservati bagnati. Non consentire l'esposizione all'aria per più di 10 minuti alla volta. Determinare la dimensione della punta appropriata per l'applicazione. In questo caso, abbiamo utilizzato un microelettrodo di pH potenziometrico con un diametro della punta smussato di 25 μm.

1. Con il microelettrodo ancora nel tubo di protezione, ispezionare visivamente la punta per verificare che non sia danneggiata.
2. Collegare l'elettrodo di riferimento al cavo dell'elettrodo pH tramite il connettore. Quindi, collegare il microelettrodo all'amplificatore e l'amplificatore a un PC con messa a terra con il software tramite un cavo USB (Figura 1A).
3. Riempire due provette coniche da 50 mL 2/3 con etanolo al 70% e H₂O deionizzato (diH₂O). Posizionare il microelettrodo e l'elettrodo di riferimento nel tubo diH₂Ø, assicurandosi che entrambe le punte appaiano immerse per almeno 1 cm nel liquido.
   NOTA: I bicchieri alti possono essere utilizzati anche per questo e altri passaggi simili.
4. Lasciare che gli elettrodi si equilibrino per ~10 min.
   NOTA: La procedura può anche essere messa in pausa in questa fase e ripresa in un secondo momento poiché gli elettrodi possono essere conservati in diH₂O.
5. Mentre gli elettrodi sono in equilibrio, aprire il software (icona rossa) sulla postazione di lavoro del computer. Nella scheda Impostazioni, assicurarsi che la casella accanto al microelettrodo sia selezionata, indicando che è collegato correttamente e riconosciuto dal software. Fai clic su Avvia esperimento in alto a sinistra nella finestra e inserisci il nome e la destinazione del file desiderati. Nella finestra Impostazioni calibrazione sensore ed esperimento , fare clic su Cancella tutti i punti per preparare il software per una nuova calibrazione.
6. Riempire due provette coniche da 50 mL 2/3 con tamponi di calibrazione pH 4,01 e pH 9,21. Tamponare delicatamente il tubo protettivo e asciugare l'elettrodo di riferimento con una salvietta da laboratorio delicata.
7. Iniziando con gli elettrodi nel tampone pH 4.01, inserire 4.01 come valore pH noto. Una volta che la lettura mV si è stabilizzata, selezionare aggiungi punto. Verificare che il segnale sia stabile a ~380 mV. Dopo aver aggiunto il punto, riposizionare entrambi gli elettrodi in diH₂O per risciacquare, quindi asciugare nuovamente.
8. Ripetere il passaggio precedente con il buffer 9.21 e fare clic su aggiungi punto quando il segnale è stabile (~83 mV). Verificare che i microelettrodi rispondano linearmente tra pH 4,01 e 9,21; Pertanto, è necessaria solo una curva di calibrazione a due punti. Assicurarsi che la linea risultante tra questi punti abbia una pendenza negativa di 50-70 mV/pH-unit. Fare clic su Salva e usa calibrazione.
   NOTA: Ora sei pronto per iniziare a registrare le misurazioni³⁰.

3. Profilo del pH di organoidi gastrici umani

NOTA: Il seguente protocollo è descritto per un utente destrorso. ATTENZIONE: Disabilitare tutte le opzioni di risparmio energetico sul PC poiché le misurazioni in corso verranno interrotte se il PC entra in modalità di sospensione.

1. Montare un supporto ad anello con un morsetto sul lato sinistro di uno stereomicroscopio per sostenere l'elettrodo di riferimento. Posizionare un micromanipolatore collegato a un pesante supporto da laboratorio sul lato destro del microscopio (Figura 1A).
2. Rimuovere con cautela il microelettrodo dalla sua custodia di protezione appoggiandolo sul banco ed estraendo la custodia con un movimento rapido e rapido.
   ATTENZIONE: I microelettrodi sono incredibilmente fragili e bisogna fare attenzione per assicurarsi che la punta non entri in contatto con materiale rigido e solido. Per ottenere i migliori risultati, eseguire le misurazioni su un piano di lavoro robusto e privo di apparecchiature che potrebbero causare vibrazioni del banco o movimenti indesiderati degli elettrodi.
3. Montare il microelettrodo su un micromanipolatore e disporre lo stereoscopio e il micromanipolatore in modo tale che il microelettrodo possa avanzare verso il piatto di coltura senza colpire l'obiettivo o altre parti del microscopio.
4. Posizionare la piastra di coltura contenente gli organoidi per avere un'adeguata visualizzazione del primo organoide da profilare (Figura 1B).
5. Fissare leggermente l'elettrodo di riferimento al morsetto sul supporto ad anello a sinistra dello stereoscopio. Posizionare l'elettrodo di riferimento in modo che poggi nel mezzo che circonda l'ECM. Fare attenzione a non danneggiare gli organoidi durante lo spostamento dello stadio tra una misurazione e l'altra.
6. Guardando direttamente la piastra di coltura (non nel microscopio), far avanzare la punta del microelettrodo fino a quando non è sufficientemente immersa nel terreno. Nella scheda Data logger del software, fare clic sul pulsante Start (triangolo singolo rivolto a destra) per avviare la registrazione. Assicurarsi che la casella di controllo Calibrato sia selezionata sul lato destro dello schermo.
   NOTA: Attendere ~10 s affinché ogni lettura si stabilizzi prima di passare alla regione successiva.
7. Prima di entrare nell'ECM, assicurarsi che la punta dell'elettrodo sia visibile al microscopio e che sia posizionata in modo da avanzare linearmente verso il primo organoide di interesse. Far avanzare lentamente l'elettrodo nel gel, senza entrare in contatto con alcun organoide. Registrare almeno tre letture del pH e calcolare la media.
8. Posizionare il microelettrodo in modo che sia pronto ad avanzare verso il primo organoide di interesse lungo l'asse perpendicolare alla superficie. Lasciare che l'elettrodo faccia una piccola rientranza sulla superficie epiteliale senza penetrare (Figura 1C).
   NOTA: Questo passaggio fornirà anche informazioni sul fatto che l'organoide rimarrà al suo posto o se potrà muoversi più liberamente nell'ECM.
9. Con un movimento rapido, fai avanzare il microelettrodo nell'organoide. Se l'organoide si muove intorno al microelettrodo o si allontana, prova un'angolazione leggermente diversa o appoggialo contro un altro organoide o il bordo di plastica che circonda il fondo del coprioggetto del piatto. Misurare il pH luminale (tre volte individuali) di 10 diversi organoidi per ogni condizione sperimentale. Al termine della registrazione delle misurazioni, fare clic sul pulsante quadrato Interrompi.
   ATTENZIONE: Stimare il diametro dell'organoide per decidere fino a che punto far avanzare l'elettrodo nel lume dell'organoide, facendo attenzione a non perforarlo. Per una maggiore precisione, misurare il diametro con il software della fotocamera del microscopio, se disponibile. NOTA: Se la punta del microelettrodo si ricopre notevolmente di detriti dopo una o più misurazioni, lavare il microelettrodo in soluzione di dissociazione cellulare, PBS, EtOH e quindi diH₂O prima di procedere.

4. Profilatura motorizzata (opzionale)

NOTA: Questa opzione richiede un micromanipolatore montato su uno stadio motore meccanico, che è controllato da un software per computer tramite un controller del motore³¹.

1. Apri il software di profilazione (icona marrone) e avvia un nuovo esperimento nella scheda Profilazione .
2. Le impostazioni per l'asse z riconosceranno automaticamente il motore quando un apparato motore è collegato correttamente.
   NOTA: Il movimento nelle direzioni x e y è ancora controllato manualmente con questa configurazione.
3. Individua la scheda Interazione profilo³⁰. Prima di premere start, assicurarsi che sia possibile passare rapidamente all'osservazione dell'oculare del microscopio per garantire l'inserimento dell'organoide alla distanza desiderata. Vai su Impostazioni profilo e procedi come segue:
   1. Indicare che la distanza iniziale è 0 μm.
      ATTENZIONE: Se il guscio epiteliale è particolarmente duro su un dato organoide, l'organoide può essere spinto via o deformato invece di essere penetrato. In caso di spinta, continuare ad avanzare l'elettrodo ma annotare il punto in cui avviene l'ingresso, poiché il software non può registrarlo automaticamente.
   2. A giudicare la dimensione dell'organoide da profilare, indicare una distanza finale che non sia superiore a 3/4 del diametro stimato di un organoide.
      NOTA: Questo particolare passaggio è progettato per evitare danni alla punta dell'elettrodo.
   3. Indicare la dimensione del passo desiderata: 100 μm come mostrato nella Figura 2E. Assicurarsi che la dimensione minima del passo corrisponda alla dimensione della punta dell'elettrodo (ad esempio, 25 μm per una punta dell'elettrodo con pH 25 μm 25).
   4. Indicare una posizione sicura in cui il motore riporterà la punta dell'elettrodo tra i profili.
      NOTA: Questa dovrebbe essere un'altezza comoda sopra il campione (all'esterno dell'organoide) in cui il sensore può essere spostato lateralmente in sicurezza nelle direzioni x e y con il micromanipolatore manuale. Lasciare l'angolo del sensore sull'impostazione predefinita.
   5. Per consentire all'elettrodo di equilibrarsi, indicare almeno 3 s in Attendere prima della misura.
   6. Impostare il periodo di misurazione su almeno 1 s. Le misurazioni in questo periodo saranno mediate.
      NOTA: Se si eseguono misurazioni in un ambiente ad alto rumore elettrico, può essere utile indicare un periodo più lungo.
   7. Impostare il ritardo tra/i su almeno 1 s.
   8. Impostare il numero preferito di repliche da misurare a ciascuna profondità.
   9. Inizia a registrare le misurazioni premendo il pulsante Start .

5. Pulizia degli elettrodi

1. Riposizionare l'elettrodo da pulire nel suo tubo di protezione.
2. Lavare gli elettrodi con diH₂O dopo le misurazioni.
3. Lavare gli elettrodi con etanolo al 70% per un paio di minuti.
4. Sciacquare gli elettrodi con tampone pH 4.01.
5. Sciacquare nuovamente gli elettrodi con diH₂O prima di procedere con le misurazioni.

6. Conservazione degli elettrodi

NOTA: Entrambi gli elettrodi devono essere conservati a temperatura ambiente in un luogo a bassa attività, al riparo da danni accidentali.

1. Dopo aver utilizzato il microelettrodo pH, reinserirlo con cautela orizzontalmente nel suo tubo di protezione (facendolo scorrere lungo il banco da laboratorio per il supporto orizzontale).
2. Tenendo il microelettrodo in posizione verticale (punta rivolta verso l'alto), riempire delicatamente il tubo di protezione con acqua sterile. Collegare il tubo di protezione con il tappo in dotazione con l'elettrodo. Assicurarsi che tutti i fori nel tubo di protezione siano sigillati con nastro isolante. Conservare in una scatola infrangibile fino al prossimo utilizzo.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare la confezione originale in cui sono arrivati gli elettrodi in quanto conterrà inserti protettivi progettati per mantenere gli elettrodi in posizione quando vengono conservati.
3. Conservare l'elettrodo di riferimento in un becher o in un cilindro graduato riempito con una soluzione 3M KCl. Coprire il becher/cilindro graduato con parafilm per evitare l'evaporazione della soluzione.
   NOTA: Se si utilizza un cilindro graduato, si consiglia di fissarlo al banco da laboratorio con del nastro adesivo per evitare movimenti accidentali.

7. Iniezione di rosso metile (opzionale)

NOTA: Il rosso metile è un colorante indicatore colorimetrico che può essere utilizzato per convalidare le misurazioni dei microelettrodi.

1. Riempire un capillare di vetro da 2 μL con olio minerale sterile, caricarlo su un autoiniettore nL controllato da micromanipolatore e successivamente riempirlo con una soluzione contenente lo 0,02% di rosso metile e 150 mM di HCl.
   NOTA: La soluzione dovrebbe apparire rossa/rosa mentre si trova nel capillare a causa dell'acidità dell'HCl.
2. Iniettare organoidi di almeno 300 μm di diametro con 9,2 μl della soluzione²⁵.
3. Cattura immagini o video utilizzando una fotocamera adattata allo stereomicroscopio (Figura 2G).

Risultati

La secrezione di acido è una funzione cruciale dello stomaco umano. Tuttavia, fino a che punto la secrezione acida possa essere modellata negli organoidi è ancora oggetto di dibattito 6,32,33,34. Abbiamo quindi sviluppato il protocollo sopra descritto per misurare con precisione la produzione di acido negli organoidi gastrici. In particolare, abbiamo utilizzato organoidi derivati da cellule staminali adulte non stimolate coltivate in condizioni di espansione standard che erano state passate più volte, il che ha portato alla perdita di cellule parietali³⁵. Pertanto, la presenza di cellule parietali secernenti acido e il rilascio di acido attivo non erano attesi nel nostro sistema modello.

Per i nostri esperimenti, abbiamo utilizzato organoidi con diametri compresi tra 200 μm e 1.000 μm seminati su piastre con fondo di vetro. Innanzitutto, abbiamo testato due diverse dimensioni della punta per i microelettrodi: un pH-25 con un diametro della punta di 25 μm e un pH-50 con un diametro della punta di 50 μm. Come mostrato nella Figura 2A, non c'era alcuna differenza significativa tra le misurazioni ottenute con le punte più piccole rispetto a quelle più grandi. È interessante notare che il pH di base negli organoidi tendeva ad essere leggermente alcalino a ~pH 8. Utilizzando la punta a pH 25 μm, abbiamo poi valutato la variazione del pH luminale all'interno di diversi dieci organoidi mantenuti sulla stessa piastra di coltura, con tre misurazioni ottenute da ciascun organoide (Figura 2B). All'interno di una piastra, il pH luminale dei singoli organoidi ha mostrato solo variazioni lievi e non significative (8,16 ± 0,12; p ≥0,0445-0,99) (Figura 2B). Abbiamo anche confrontato le misure di pH intraluminale all'interno di cinque diverse linee di organoidi con passaggi compresi tra 3 e 16 (Figura 2C). Anche in questo caso, abbiamo riscontrato misure di pH coerenti all'interno di ciascuna coltura, ma una significativa variabilità tra le linee di organoidi. Tuttavia, il pH luminale è generalmente rimasto tra pH 7,3 e pH 8,2, entro un ordine di grandezza, e non c'è stata alcuna tendenza apparente per il pH medio quando si confrontano i numeri di passaggio precoce con quelli tardivi (Figura 2C). Ci siamo poi chiesti se il pH del lume dell'organoide fosse direttamente correlato al pH del mezzo di espansione dell'organoide e della matrice extracellulare (ECM). Il confronto tra i mezzi, l'ECM che circonda gli organoidi e il lume dell'organoide ha rivelato differenze significative nel pH, con il pH luminale degli organoidi inferiore a quello dell'ECM e il pH dell'ECM inferiore a quello dei mezzi di espansione degli organoidi circostanti (Figura 2D), suggerendo che il pH luminale degli organoidi era fisiologicamente rilevante piuttosto che direttamente determinato dall'ambiente di coltura. Attraverso sei esperimenti indipendenti, abbiamo misurato un pH luminale medio vicino alla neutralità a 7,13 ± 0,09.

Un micromanipolatore motorizzato è stato utilizzato per ottenere misure di pH del lume dell'organoide con una maggiore risoluzione spaziale. Questo approccio è rilevante se è necessario registrare il pH o altri gradienti all'interno del lume²⁹ dell'organoide pieno di muco. La Figura 2E mostra due serie rappresentative di misure di pH in organoidi di grandi dimensioni (>1.000 μm di diametro), che dimostrano il punto di ingresso in ciascun organoide e terminano a una profondità di ~800 μm. Poiché i due organoidi profilati non avevano lo stesso diametro, le misurazioni non sono immediatamente confrontabili. Indipendentemente da ciò, mostriamo l'evidenza di un leggero gradiente di pH di Δ0,6 tra la superficie epiteliale e il lume dell'organoide più profondo (Figura 2E). Per determinare la fattibilità dell'esecuzione di misure di pH negli organoidi nel tempo, che consentirebbero di misurare le risposte al trattamento in tempo reale, abbiamo registrato il pH intraluminale all'interno di un organoide rappresentativo per circa 20 minuti e abbiamo scoperto che la lettura rimaneva altamente coerente dopo un periodo di adattamento iniziale (Figura 2F). Per convalidare le misure di pH luminale con un metodo indipendente, abbiamo utilizzato un colorante colorimetrico sensibile al pH (rosso metile) che abbiamo iniettato nel lume dell'organoide utilizzando un autoiniettore di nanolitri montato su micromanipolatore (Figura 2G). La colorazione gialla del colorante ha confermato che il lume dell'organoide aveva un pH >6,2, coerente con le misurazioni del microelettrodo che mostravano un pH quasi neutro. Nel complesso, questi risultati rappresentativi illustrano la fattibilità e la riproducibilità delle misure di pH basate su microelettrodi nelle colture di organoidi.

Figura 1: Panoramica del metodo. (A) Diagramma schematico dell'impostazione del profilamento. Il microelettrodo nella Figura 1A è stato preso dal sito web di Unisense. ³⁶ (B) Immagine rappresentativa della coltura di organoidi pronta per la profilazione, ECM circostante e terreni circostanti (barra della scala = 5 mm). (C) Esempio di posizionamento corretto dei microelettrodi in preparazione per il sondaggio degli organoidi (barra graduata = 500 μm). Abbreviazione: ECM = matrice extracellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Convalida del profilo dei microsensori in organoidi gastrici umani. (A) Confronto delle misure di pH a lume medio utilizzando punte di microelettrodi da 25 μm (pH-25) e 50 μm (pH-50). Dati provenienti da 10 organoidi individuali, ciascuno proveniente da un singolo esperimento rappresentativo. (B) Sono state ottenute tre misure di pH replicate per 10 singoli organoidi. ANOVA unidirezionale con confronti multipli (p = 0,1229). (C) le misure di pH ottenute con un elettrodo pH-25 sono coerenti all'interno di ciascuna delle cinque linee di organoidi analizzate a diversi numeri di passaggio; 4-10 organoidi misurati per linea in base alle dimensioni e alla disponibilità. ANOVA unidirezionale con confronti multipli (p < 0,0001). (D) Misure di pH all'interno di organoidi gastrici e del Matrigel e dei terreni circostanti (n = 6 esperimenti indipendenti). Misure ottenute penetrando organoidi epiteliali gastrici con un pH-25. Ogni punto dati è la media di 10 singole misure di pH all'interno di un singolo organoide. ANOVA unidirezionale (p < 0,0001). (E) Profili di pH epiteliale-lume di due organoidi rappresentativi utilizzando un micromanipolatore motorizzato. (F) Stabilità del pH nel tempo (~19,8 min) in un organoide rappresentativo. (G) Microiniezione di colorante indicatore di pH rosso metile e HCl nel lume dell'organoide gastrico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

			Donatore
Figura	Linea	Passaggio	Sesso	Età	Etnicità
2A	35	6	F	40	B
2B	7	15	F	26	B
	7	4	F	26	B
	1	16	F	45	C
	34	3	F	44	Sconosciuto
	35	6	F	40	B
2C	7	15	F	26	B
2D	36	1	Sconosciuto
	7	5	F	26	B
	37	1	Sconosciuto
	31	3	F	45	H
	7	9	F	26	B
	7	4	F	26	B
2E	10	15	F	43	Sconosciuto
2F	34	3	F	33	C
2G	7	5	F	26	B

Tabella 1.

Terreno di espansione dell'organoide gastrico umano (L-WRN)
Fluido condizionato L-WRN	50%
DMEM/F12 avanzato	37%
Siero fetale bovino	10%
Penicillina/streptomicina	1%
L-glutammina	1%
Gentamicina	0.10%
Amfotericina B	0.10%
Tampone HEPES	0.40%
Y-27632	0.10%
SB-431542	0.10%

Tabella 2.

Figura supplementare S1: Espressione del trasportatore ionico in organoidi gastrici umani. Il numero di copie relative è normalizzato a 18S rRNA. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Organoide gastrico umano con architettura deformata dopo puntura con la sonda del microsensore di pH. Barra della scala = 1 mm. Clicca qui per scaricare questo file.

Video supplementare S1: Tentativo di profilazione non riuscito in una coltura di organoidi gastrici. Il microelettrodo di pH da 25 μm viene fatto avanzare manualmente verso l'organoide di interesse. Dopo un tentativo fallito a causa di un errore di valutazione dell'angolo, si tenta un angolo diverso e si scopre che l'organoide manca dell'integrità strutturale per essere profilato (la struttura sferica non è robusta e si deforma quando viene penetrata con l'elettrodo). L'utente reindirizza quindi per tentare un organoide diverso. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

L'accesso limitato allo spazio luminale degli organoidi ha fortemente limitato la nostra comprensione delle dinamiche fisiologiche di questo microambiente. Uno strumento affidabile per le analisi funzionali della fisiologia luminale amplierà la nostra capacità di sfruttare gli organoidi come modelli in vitro per la fisiologia, la farmacologia e la ricerca sulle malattie. Gli organoidi sono modelli altamente sintonizzabili e fisiologicamente rilevanti con il potenziale aggiunto di replicare la variabilità genetica all'interno della popolazione umana. I metodi esistenti per la misurazione del pH all'interno del lume dell'organoide hanno utilizzato coloranti o nanoparticelle sensibili al pH, metodi che spesso devono essere accoppiati con la microscopia a fluorescenza o la spettroscopia 16,17,37. Il metodo di profilazione basato su microsensori descritto fornisce un nuovo percorso per misurare il pH intraluminale degli organoidi gastrointestinali con una nuova precisione spaziale. Il nostro metodo dimostra una misurazione coerente e affidabile del pH luminale dell'organoide gastrointestinale, nonché l'evidenza di un gradiente di pH. In esperimenti non pubblicati, abbiamo confermato l'espressione dei geni della famiglia SLC SLC4A2 e 26A7, noti per essere responsabili della secrezione di bicarbonato, così come di SLC9A3, 9A4 e 9A8 che sono responsabili dello scambio protonico (Figura supplementare S1)38,39,40,41. I nostri studi suggeriscono una predominanza della secrezione di bicarbonato e una mancanza di cellule parietali nei nostri organoidi, il che potrebbe spiegare l'alcalinità.

È importante assicurarsi che i microelettrodi utilizzati siano adatti per la microprofilazione degli organoidi, inclusa la selezione del diametro corretto della punta. Abbiamo provato sia punte da 25 μm che da 50 μm e abbiamo ottenuto risultati simili (Figura 2A), ma abbiamo deciso di procedere con punte di dimensioni più piccole secondo il consiglio del produttore poiché ci si aspettava che fossero meno invasive e fornissero una risoluzione spaziale più elevata, poiché le misurazioni sono mediate nell'area della punta smussata. Come aspetto negativo, tuttavia, le punte più piccole sono più fragili. La dimensione dell'organoide deve essere considerata nel determinare la risoluzione spaziale desiderata.

Un passaggio critico del protocollo è stato garantire la capacità di distinguere tra il pH intraluminale dell'organoide dal pH nell'ECM e, successivamente, nel terreno di coltura circostante. Ci si aspetterebbe una quantità ragionevole di flusso di metaboliti dentro e fuori dagli organoidi⁴². Ci aspettiamo che il pH di un organoide sia influenzato dal suo ambiente e abbiamo scoperto che gli organoidi erano costantemente meno alcalini rispetto all'ambiente circostante in sei esperimenti indipendenti (Figura 2D). Inoltre, la stabilità è importante sia nella profilazione che durante la taratura del sensore.

Si prevede che gli organoidi derivati da tessuti mostrino un certo grado di variabilità da donatore a donatore, quindi è essenziale profilare qualsiasi linea di organoidi al basale prima di applicare qualsiasi intervento sperimentale come il trattamento farmacologico⁴³. Ipotizziamo che le fluttuazioni del pH all'interno di una coltura di organoidi possano essere dovute a gradienti ionici locali su microscala e alla distribuzione eterogenea del muco luminale, determinata mediante immunofluorescenza e colorazione immunoistochimica (dati non pubblicati). Le variazioni di pH osservate tra le linee e i passaggi dei singoli organoidi possono essere dovute a differenze individuali nella composizione cellulare e nell'attività secretoria degli organoidi. Abbiamo anche scoperto che alcune linee di organoidi erano intrinsecamente più difficili da penetrare rispetto ad altre. Allo stesso modo, alcuni possono perdere la loro integrità strutturale e collassare all'ingresso dell'elettrodo (Figura S2 e Video S1). Questo non sembra essere associato al passaggio degli organoidi, ma è stato osservato più comunemente negli organoidi di diametro superiore a ~1,5 mm. In uno studio precedente, abbiamo dimostrato che il muco all'interno degli organoidi era distribuito in modo eterogeneo²⁹. A causa di questa eterogeneità, diventa difficile determinare se (o in che misura) la distribuzione del muco abbia influenzato una misurazione.

I microsensori sono strumenti minimamente invasivi in grado di profilare la fisiologia intraluminale degli organoidi con alta velocità e alta risoluzione spaziale. Tali sensori inoltre non disturbano i gradienti chimici e sono minimamente sensibili alla turbolenza nel microambiente di interesse. Il design compatto è reso possibile dalla separazione dell'elettrodo del sensore dall'elettrodo di riferimento: le sonde di pH standard da laboratorio combinano questi due elettrodi, portando a una dimensione maggiore. I nanosensori ottici di pH e O₂ per misure intracellulari sono stati sviluppati dal gruppo Cash presso la Colorado School of Mines e hanno avuto successo nella misurazione dei metaboliti sia in modelli murini che in modelli di biofilm. A causa dell'eterogeneità del lume dell'organoide, tuttavia, tali sensori possono portare a risultati non interpretabili¹⁷. McCracken et al. hanno analizzato il pH luminale in organoidi gastrici derivati da cellule staminali embrionali iniettando SNARF-5F e visualizzando il colorante sensibile al pH con la microscopia confocale in tempo reale³⁷. In particolare, le misurazioni riportate da McCracken erano molto simili ai valori di pH ottenuti nel nostro studio attuale (Figura 2B, C). La nostra tecnica potrebbe forse essere applicata in un'architettura monostrato, con una configurazione più verticale come nella profilazione del biofilm, anche se questo potrebbe comportare il rischio di danneggiare gli elettrodi⁴⁴. Gli studi futuri potrebbero anche comportare misurazioni sequenziali del pH nell'arco di più giorni per valutare i cambiamenti associati allo sviluppo cellulare. Poiché gli organoidi di medie dimensioni generalmente si riprendono e guariscono dopo il sondaggio, un organoide potrebbe teoricamente essere sondato più volte, purché la sterilità delle colture possa essere mantenuta. Man mano che affiniamo la nostra comprensione delle dinamiche del pH nei modelli di organoidi, la risoluzione spaziale deve essere una priorità per la mappatura precisa del complesso e storicamente inaccessibile microambiente 3D all'interno.

In sintesi, questo protocollo fornisce un metodo dettagliato per misure accurate di pH con un'elevata risoluzione spazio-temporale utilizzando microelettrodi di pH montati su un micromanipolatore e uno stereomicroscopio. Questo metodo è stato convalidato con organoidi derivati da cellule staminali adulte umane ed è adatto per organoidi epiteliali di almeno 200 μm di diametro che hanno un lume distinto. Prevediamo che selezionando microelettrodi alternativi, questo metodo possa essere facilmente adattato ad altri tipi di organoidi e alla misurazione di composti alternativi, come NO o O₂.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3 m KCl	Unisense
da 5 mL, confezionata singolarmente, carta/plastica, sacchetto, cella sterileTreat		229091B
Pipetta da 10 mL non sierologica, confezionata singolarmente, carta/plastica, sacca, sterile	CellTreat	229092B
Provetta da centrifuga da 15 mL - rack in schiuma, cella sterileTreat		229412
Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti, CellTreat		229124
25 mL Pipetta sierologica Wobble-not, Confezionata singolarmente, Carta/Plastica, Sacchetto, CellTreat		sterile 229093B
Piatto da 35 mm | N. 1.5 Vetrino coprioggetti | Diametro del vetro 20 mm | Provetta per	MatTek	P35G-1.5-20-C
50 mL non rivestita - Rack in schiuma, sterile	CellTreat	229422
70% di etanolo	BP82031GAL	BP82031GAL
70 μ Filtro cellulare m, confezionato singolarmente, sterile	CellTreat	229483
1.000 µ L Puntali per pipette a bassa ritenzione di lunghezza estesa, in rack, sterili	CellTreat	229037
soluzione di amfotericina B (Fungizone)	HyClone Laboratories, Inc	SV30078.01
Armadio di biosicurezza	Nuaire	NU-425-600	Classe II Tipo A/B3
Siero bovino Albumina Fisher	Bioreagenti	BP1605-100
Soluzione di recupero cellulare	Corning	354253	Soluzione di dissociazione cellulare
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)	Gibco	12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)	Fisher Scientific	15017CV
Fetale Siero Bovino	HyClone Laboratories, Inc	SH30088
G418	Solfato Corning	30-234-CR
Gentamicina solfato	IBI Scientific	IB02030
HEPES, Acido libero	Cytiva	SH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" Computer portatile Intel Core i3	HP	M03840-001
Acido cloridrico	Fisher Scientific	A144C-212
Incubatrice	Fisher Scientific	11676604
Fotocamera per iPhone 12	Apple
L-glutammina	Cytiva	SH3003401
Large Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Tergicristalli per attività delicate, 1 strato	Fisher Scientific	34133
M 205 FA Stereomicroscopio	Leica
Matrice a membrana Matrigel 354234	Corning	CB-40234
MC-1 Controller UniMotor	Unisense
Rosso
MM33 Micromanipolatore	Marzhauser Wetzlar	61-42-113-0000	Stadio motorizzato
MS-15	Unisense Nanoject-II
	Drummond	3-000-204	nanolitri autoiniettore
Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15-140-148
Microelettrodi pH	Unisense	50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160	Il software SensorTrace non è compatibile con i computer Apple
Elettrodo di riferimento	Unisense	REF-RM-001652	Il software SensorTrace non è compatibile con Apple computers
SB 431542	Tocris Bioscience	16-141-0
Adattatore per fotocamera	per smartphone Gosky
Specifiche Supporto da laboratorio LS	Unisense	LS-009238
Tripsina-EDTA 0.025%, rosso fenolo	Gibco	25-200-056
UniAmp	Unisense	11632
United Biosystems Inc  MINI RASCHIATORI PER CELLE 200/PK	Fisher	MCS-200
Y-27632 dicloridrato	Tocris Bioscience	12-541-0
µ Kit di calibrazione del sensore	Unisense/ Mettler Toledo	51-305-070, 51-302-069	pH 4,01 e 9,21, confezioni da 20 mL