Qui viene presentata una procedura rapida e standardizzata per stabilire comunità di biofilm multispecie sinergiche da vari suoli della rizosfera. Si tratta di un protocollo unico progettato per sondare e simulare il complesso microbiota del suolo della rizosfera.
Articolo metodologico
Un approccio alla costruzione di comunità di biofilm multispecie dal suolo della rizosfera
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il biofilm multispecie è uno stile di vita naturale e dominante dei batteri in natura, anche nel suolo della rizosfera, sebbene l'attuale comprensione di esso sia limitata. Qui, forniamo un approccio per stabilire rapidamente comunità di biofilm multispecie sinergiche. Il primo passo consiste nell'estrarre le cellule dal terreno della rizosfera utilizzando il metodo della centrifugazione differenziale. Successivamente, queste cellule del suolo vengono inoculate nel terreno di coltura per formare il biofilm della pellicola. Dopo 36 ore di incubazione, la composizione batterica del biofilm e la soluzione sottostante vengono determinate utilizzando il metodo di sequenziamento dell'amplicone genico 16S rRNA. Nel frattempo, l'isolamento batterico ad alto rendimento dal biofilm della pellicola viene condotto utilizzando il metodo di diluizione limitante. Quindi, i primi 5 taxa batterici vengono selezionati con la più alta abbondanza nei dati di sequenziamento dell'amplicone del gene 16S rRNA (campioni di biofilm a pellicola) per un ulteriore utilizzo nella costruzione di comunità di biofilm multispecie. Tutte le combinazioni dei 5 taxa batterici sono state rapidamente stabilite utilizzando una piastra a 24 pozzetti, selezionata per la più forte capacità di formazione del biofilm mediante il saggio di colorazione cristallovioletto e quantificata mediante qPCR. Infine, le più robuste comunità di biofilm batterici multispecie sintetiche sono state ottenute attraverso i metodi di cui sopra. Questa metodologia fornisce una guida informativa per condurre ricerche sul biofilm multispecie della rizosfera e identificare comunità rappresentative per studiare i principi che governano le interazioni tra queste specie.
Introduzione
I biofilm rappresentano intricate comunità microbiche fissate alle superfici o collegate con interfacce. C'è un ampio riconoscimento che la maggior parte dei batteri incontrati in vari ambienti, come habitat naturali, ambienti clinici e contesti industriali, sopravvive all'interno delle comunità di biofilm1. Nel suolo, la rizosfera, che comprende la superficie delle radici e la sua adiacente regione spessa 2 mm, forma una nicchia ecologica con una maggiore disponibilità di nutrienti. Batteri specifici hanno sviluppato strategie per sfruttare questa nicchia, favorendo la proliferazione microbica e favorendo la formazione di comunità di biofilm nella rizosfera2.
I microbi della rizosfera sono considerati il "secondo genoma" delle piante3. I microrganismi che promuovono la crescita delle piante (PGPM) si impegnano in simbiosi mutualistica con le piante, fornendo significative funzioni di promozione della crescita e di biocontrollo4. Da un lato, il PGPM può fornire nutrienti alle radici delle piante, migliorare l'assorbimento dei nutrienti, difendersi dagli agenti patogeni e degradare gli inquinanti nel suolo della rizosfera5. D'altra parte, la PGPM utilizza gli essudati delle radici delle piante come fonte di nutrienti per la crescita e l'evoluzione, influenzando così il suolo e l'apparato radicale della rizosfera attraverso il loro stesso metabolismo. Vale la pena notare che il prerequisito per tutte queste funzioni è l'efficace colonizzazione del PGPM nella rizosfera vegetale, formando biofilm stabili6.
Il biofilm della rizosfera influenza il processo di assemblaggio dei microbi della rizosfera e le caratteristiche temporali e spaziali dell'assemblaggio dei microbi della rizosfera sono strettamente correlate all'interazione del biofilm multispecie7. Funge da fulcro delle interazioni pianta-microbioma, fornendo una nicchia stabile e controllabile per interagire in modo efficace. Pertanto, lo studio del biofilm della rizosfera è anche una direzione importante per ottenere informazioni sull'interazione tra piante e microbi.
Tuttavia, attualmente ci sono poche ricerche sui biofilm multispecie della rizosfera. L'elevata complessità della composizione del microbioma rende difficile rispondere alle domande ecologiche fondamentali che circondano le comunità microbiche naturali8. Nel processo degli esperimenti, è necessario considerare molte condizioni, come il tipo di suolo, il tipo di pianta e il gran numero di comunità microbiche. Vari fattori limitano la ricerca di biofilm multispecie della rizosfera.
Per studiare ulteriormente le comunità di biofilm multispecie dal suolo della rizosfera, come le interazioni sinergiche interspecie o l'alimentazione incrociata dei metaboliti8, è auspicabile costruire artificialmente una comunità microbica sintetica semplificata, rappresentativa, stabile e trattabile in condizioni di laboratorio 9,10. Qui, un protocollo standardizzato combina molte delle più recenti tecniche microbiologiche e bioinformatiche.
Protocollo
Questo protocollo è generalmente applicabile al microbiota del suolo della rizosfera di varie piante. Qui, il cetriolo è usato come esempio. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Isolamento batterico
- Isolamento del suolo nella rizosfera
- Cultura del cetriolo
- Disinfettare i semi di cetriolo con una soluzione di etanolo al 75% e ipoclorito di sodio (NaClO) al 2%, quindi sciacquarli in acqua sterile11.
- Germina i semi in condizioni sterili e seleziona quelli che raggiungono lo stadio a due foglie12. Successivamente, trapiantare le piantine di cetriolo costantemente germogliate in vasi contenenti 2 kg di terra nera.
NOTA: Due tipi di terra nera provenienti da diverse località nel nord-est della Cina vengono utilizzati per ridurre gli errori sistematici.
- Preparazione della sospensione del terreno
- Preparare il tampone PBS-S utilizzando la formulazione: 6,33 g di NaH2PO4· H2O, 16,5 g di Na2HPO4·7H2O, 200 μL di Silwet L-77 e 1 L di acqua distillata.
- Quando le piantine raggiungono lo stadio12 a quattro foglie, capovolgere il vaso e isolare le radici insieme a un terriccio della rizosfera di 2 mm di spessore utilizzando guanti sterilizzati.
- Inserire le radici in 30 mL di tampone PBS-S in una provetta da centrifuga da 50 mL. Dopo aver agitato per 20 minuti, filtrare la sospensione attraverso un filtro a celle di nylon da 100 μm per rimuovere radici e sedimenti di grandi dimensioni.
- Trasferire il filtrato in un'altra provetta da centrifuga da 50 mL, centrifugarlo a 3200 x g per 15 minuti a temperatura ambiente e conservarlo temporaneamente a 4 °C.
- Cultura del cetriolo
- Estrazione di cellule batteriche del suolo a rizosfera.
NOTA: Questa metodologia adotta il metodo di centrifugazione differenziale13, sebbene il metodo di centrifugazione in gradiente di densità di Nycodenz14 si applichi anche a questa fase.- Diluire la sospensione del suolo con una soluzione di Na4P2O7 allo 0,2% in 500 mL e centrifugare a 1.000 x g per 10 minuti per separare inizialmente gli organismi dal suolo.
- Riomogeneizzare il precipitato, centrifugarlo alla stessa bassa velocità per 60 s e ripetere il processo tre volte. Unire i surnatanti, centrifugarli a 12.000 x g per 20 minuti, quindi scartare il surnatante.
- Risospendere il precipitato in 50 mL di tampone PBS-S, costituendo la sospensione di cellule batteriche del suolo nella rizosfera.
2. Sequenziamento e identificazione del microbiota del biofilm della rizosfera
- Preparazione dei terreni
NOTA: Il brodo di soia triptico (TSB) e i terreni di glutammato glicerolo (MSgg) a sali minimi sono disponibili in commercio. Le formulazioni seguenti sono solo di riferimento.- Preparare il terreno TSB utilizzando la seguente formulazione: 15 μg/mL di triptone, 5 μg/mL di peptone di soia, 5 μg/mL di NaCl, pH = 7.
- Preparare il terreno MSgg utilizzando la seguente formulazione: 5 mM KH2PO4, 100 mM 3-(N-morfinolino) acido propano solfonato (MOPS), 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM tiamina, 0,5% glicerolo, 0,5% glutammato, 50 μg/mL triptofano, 50 μg/mL fenilalanina, pH = 7.
- Per preparare i setti filtranti TSB-MSgg, mescolare i setti filtranti TSB con quelli MSgg in un rapporto 1:1 (v/v)15.
- Cocoltura di biofilm a pellicola
- Incubare la sospensione cellulare in terreno TSB a 30 °C per una notte (di solito 12 ore) per attivare i batteri.
- Posizionare i filtri cellulari in nylon da 100 μm su piastre a 24 pozzetti. Incubare i batteri in terreni TSB e impostare tre ripetizioni. Coltivare il biofilm della pellicola per 36 ore a 30 °C.
NOTA: Se il biofilm della pellicola dell'ultimo passaggio non è ben coltivato, il terreno TSB-MSgg è un efficace sostituto del terreno TSB. - Rimuovere il filtro contenente il biofilm della pellicola. Aggiungere 2 mL di tampone PBS-S a una nuova piastra cellulare a 24 pozzetti, posizionare il filtro a 24 pozzetti per lavare il biofilm e rimuovere le cellule libere. Ripetere il processo di lavaggio tre volte.
- Estrazione del DNA del biofilm della pellicola
- Estrarre il genoma del biofilm utilizzando un kit DNA seguendo le istruzioni del produttore.
- Sequenziamento ad alta produttività
NOTA: Le aziende biotecnologiche possono aiutare a completare gli esperimenti di sequenziamento per la maggior parte dei laboratori. Se è necessaria la composizione microbica nella soluzione rimanente, sequenziarla in questa fase. La fase di sequenziamento varia a seconda degli strumenti. Si prega di seguire le istruzioni del produttore. Il passaggio 2.4.1 è solo di riferimento.- Amplificare le regioni V3-V4 del gene 16S rRNA in base al database con sequenze geniche 16S rRNA a lunghezza intera. Creare OTU di specie in base al numero minimo di sequenze per campione16. Raggruppa le annotazioni di classificazione delle specie e acquisisci le composizioni delle comunità da ciascun campione.
- Sulla base dei dati di sequenziamento, seleziona i primi cinque ceppi in termini di abbondanza relativa.
- Isolamento e coltura batterica ad alto rendimento
NOTA: Questo passaggio è stato progettato secondo la più recente metodologia microbiologica e bioinformatica17. Il metodo della piastra rivestita di diluizione è disponibile per l'isolamento batterico, sebbene richieda più tempo e sia meno mirato rispetto alle tecniche ad alto rendimento.- Mescolare il biofilm coltivato. Utilizzare una diluizione limitante per garantire che non più del 30% dei pozzetti nella piastra a 24 pozzetti mostri una crescita batterica.
NOTA: Per determinare la diluizione più adatta, eseguire esperimenti preliminari utilizzando un'ampia gamma di velocità di diluizione. La diluizione ottimale non deve contenere più di due batteri coltivabili per millilitro, che rappresentano l'incubazione batterica in meno del 30% dei pozzetti. - Amplifica il gene 16S rRNA dei batteri aggiungendo etichette per i pozzetti e le piastre e sequenziali utilizzando la piattaforma Illumina17 ad alto rendimento.
- Condurre analisi bioinformatiche utilizzando software disponibili in commercio per ottenere informazioni tassonomiche sulla purezza e sulle specie per ogni coltura.
- Coltiva i primi cinque batteri puri abbondanti mediante coltura in linea continua e usa il glicerolo per preservare i batteri a -80 °C.
- Mescolare il biofilm coltivato. Utilizzare una diluizione limitante per garantire che non più del 30% dei pozzetti nella piastra a 24 pozzetti mostri una crescita batterica.
3. Costruzione di comunità microbiche sintetiche
- Coltura di biofilm ricostruita
NOTA: Per i dettagli, fare riferimento a Ren et al.18. I 5 ceppi corrispondono a 31 combinazioni sintetiche, di cui 5 consorzi a specie singola, 10 a due specie, 10 a tre specie, 5 a quattro specie e 1 a cinque specie.- Incubare i 5 ceppi nel terreno TSB fino a quando il loro OD600 raggiunge 1 per attivarli.
- Preparare diverse piastre a 24 pozzetti con il terreno TSB e posizionare su di esse filtri cellulari in nylon da 100 μm.
NOTA: Se il biofilm dell'ultimo passaggio non è ben coltivato, il terreno TSB-MSgg è un efficace sostituto del terreno TSB. - Incubare le 31 combinazioni di comunità sintetiche nel mezzo. Assicurarsi che il numero di inoculazione dei batteri sia costante in ogni pozzetto. Imposta tre ripetizioni per ogni combinazione.
- Coltivare il biofilm a 30 °C per 36 h.
- Quantificazione del biofilm della pellicola
- Seguire la stessa procedura del passaggio 2.2.3.
- Trasferire il biofilm in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente 180 μL di soluzione di cristallovioletto e colorarla per 20 minuti.
- Trasferire il campione colorato in un'altra piastra a 24 pozzetti contenente 200 μl di etanolo al 96%, eluirlo per 30 minuti e misurare OD590.
4. Quantificazione del numero di cellule a pellicola
NOTA: Per determinare la proporzione di ciascuna specie e la conta delle cellule nella pellicola e nella soluzione rimanente, è necessaria la PCR quantitativa. Per i dettagli, fare riferimento a Sun et al.16.
- Progettare primer specifici per ceppo per le comunità microbiche sintetiche selezionate.
- Usa Roary per eseguire confronti tra i genomi e scoprire i geni a copia singola specifici del ceppo di ciascun isolato. Assicurati che i primer siano mirati a questi geni.
- Ligasi i frammenti amplificati a plasmidi PMD19T. Genera curve standard utilizzando i plasmidi contenenti i frammenti corrispondenti come modelli.
- Segui gli stessi passaggi indicati nel passaggio 2.2.
- Preparare i componenti della reazione come segue: 7,2 μL di H2O, 10 μL di 2x qPCR Master mix, 0,4 μL di 10 μM di ciascun primer e 2 μL di DNA stampo.
- Eseguire la PCR con uno strumento PCR in tempo reale nelle seguenti condizioni: 95 °C per 10 minuti, 40 cicli di 95 °C per 30 s e 60 °C per 45 s, seguiti da un segmento della curva di fusione standard.
- Eseguire sei repliche biologiche per ogni trattamento.
Risultati
Seguendo la procedura menzionata, si osservano gradienti significativi nella capacità di formazione di biofilm dal microbiota del suolo della rizosfera del cetriolo (Figura 1). Il sequenziamento dell'amplicone del biofilm ha confermato la presenza della specie nella pellicola (Figura 2). Sulla base della mappatura termica dei dati di sequenziamento, sono state selezionate le prime cinque specie batteriche la cui abbondanza nella pellicola è maggiore di quella nella soluzione rimanente (Figura 3). Qui è stato preso ad esempio un tipico gruppo di comunità sintetiche. La colorazione con cristallovioletto e la PCR quantitativa visualizzano direttamente le differenze nella biomassa della pellicola e l'abbondanza relativa di ciascuna specie nelle comunità. L'aumento della biomassa di cocoltura indica il successo della costruzione di comunità di biofilm multispecie sinergiche dal suolo della rizosfera (Figura 4 e Figura 5).
I risultati mostrano che Bacillus velezensis SQR9, Acinetobacter baumannii XL-1 e Burkholderia cenocepacia XL-2 possono formare importanti consorzi sinergici, con la comunità più robusta costituita da tutte e tre le specie. Si prevede che mostreranno un forte sinergismo nella formazione del biofilm. È anche degno di nota il fatto che XL-1 funge da "dedicatore". Promuove la formazione di biofilm di XL-2 e SQR9, nonostante la sua scarsa crescita e la minima abbondanza nei consorzi (Figura 5). Mentre un certo numero di biofilm di cocoltura multispecie rappresentano un fenotipo sinergico, alcune specie, come Chryseobacterium sp., sono sempre correlate negativamente ad altri ceppi riducendo la biomassa del biofilm sintetico (Figura 2). Sebbene questo fenomeno non sia correlato all'obiettivo di questo protocollo, potrebbe valere la pena approfondire ulteriori indagini in futuro.
Figura 1: Formazione di biofilm di diverse comunità sintetiche (SynComs). Qui, i campioni sono in piastre standard a 24 pozzetti. Le fotografie vengono catturate senza alcun ingrandimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Composizione batterica in pellicola e soluzione. I grafici si basano sui dati di sequenziamento dell'amplicone del gene 16S rRNA, menzionati nella fase 2.3 del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Mappa termica della capacità di formazione del biofilm in pellicola e soluzione. Il rosso rappresenta l'abbondanza di biofilm, che è superiore alla soluzione, e il blu rappresenta l'opposto. Il genere non ha mostrato alcuna differenza non è mostrato. Le specie della prima 5 abbondanza sono spuntate a sinistra. bb: biofilm nero; BS: Soluzione nera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Quantificazione della biomassa del biofilm delle comunità sintetiche nella Figura 1. I dati provengono dalla quantificazione cristallovioletta con OD = 590 nm. I dati presentati sono la media ± SD, n = 5. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Numero di cellule e abbondanza relativa delle specie delle comunità sintetiche nella Figura 1. I dati provengono dalla PCR quantitativa. I dati presentati sono la media ± SD, n = 6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussione
Seguendo il protocollo, una serie di robuste comunità di biofilm sintetici multispecie sono costruite sulla base del microbiota nel suolo della rizosfera di diverse piante. Utilizzando tecniche di PCR quantitativa, la composizione di ciascuna comunità viene decifrata in modo chiaro. La biomassa del biofilm indica la forza delle loro potenziali interazioni metaboliche, anche se non è stato possibile rivelare qui varie proprietà e meccanismi alla base della cooperazione19. Date le dimensioni e la complessità delle comunità microbiche naturali, le comunità sintetiche (SynCom) rappresentano un sistema modello per superare gli ostacoli esistenti14. Questo protocollo evidenzia la metodologia sistematica e fondamentale per la costruzione di comunità di biofilm sintetici a partire da un complesso microbiota del suolo della rizosfera.
E' evidente dall'ultima parte che SQR9, XL-1 e XL-2 mostrano un forte potenziale di colonizzazione stabile nella rizosfera attuale. I ricercatori possono iniziare a studiare le relazioni metaboliche e i meccanismi di co-colonizzazione basati su questi ceppi. In seguito saranno accessibili anche successive ricerche sugli inoculanti microbici per il cetriolo.
Nonostante i vantaggi citati, è importante non trascurare gli svantaggi del protocollo. A causa delle differenze tra la coltura di laboratorio e le condizioni in situ , i risultati di ciascuna comunità sintetica potrebbero non rappresentare accuratamente il microbiota nel suolo della rizosfera reale20. È necessaria la conferma attraverso un'ulteriore inoculazione della rizosfera. Inoltre, la riproducibilità di questi risultati è relativamente scarsa. Le specie di biofilm a pellicola in laboratorio possono aver subito mutazioni nel corso di molte generazioni rispetto ai tipi selvatici nel suolo, portando ad alcune imprecisioni incontrollabili.
Esistono diverse alternative a determinati passaggi del protocollo. Ad esempio, nella fase 1.2, il metodo di centrifugazione in gradiente di densità di Nycodenz è relativamente più efficiente per la raccolta di campioni di cellule del suolo13. Inoltre, nella fase 2.4, l'ultima coltivazione ad alto rendimento e l'identificazione dei batteri aumentano significativamente l'efficienza sperimentale, anche se a un costo più elevato. Pertanto, il tradizionale metodo della piastra rivestita per diluizione rimane adatto per la selezione di alcune specie. Infine, nella fase 3.2, la biomassa del biofilm coltivato può essere valutata sia mediante colorazione con cristallovioletto che pesandola direttamente su una bilancia analitica.
Questo protocollo va oltre la semplice creazione di materiali sperimentali di base per la ricerca microbica e ambientale. L'identificazione delle più robuste comunità di biofilm batterici sintetici multispecie è solo il primo passo per svelare l'ecosistema aperto e complesso della rizosfera. Concentrandosi sulle specie principali di SynComs, i ricercatori possono ottenere informazioni su situazioni reali in situ in modo più mirato e rapido. Questo approccio può anche offrire una nuova prospettiva per esplorare i biofilm su scala più ampia, come gli aggregati del suolo della rizosfera, e per una gestione precisa delle comunità microbiche della rizosfera per la crescita e la salute delle piante21.
Più significativamente, questa metodologia farà luce su ulteriori ricerche sulle interazioni interspecie che governano l'assemblaggio e la dinamica del microbiota del suolo della rizosfera. Ad esempio, quando si ha a che fare con una comunità di rizosfera complessa, altri metodi analitici come l'analisi della rete di co-occorrenza o la modellazione metabolica su scala genomica15 sono spesso combinati con questi passaggi fondamentali per costruire artificialmente una comunità di biofilm rappresentativa. Ciò include considerazioni sulle relazioni interspecie.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (42307173 e 42107328) e dal National Key Research and Development Program (2022YFD1500202 e 2022YFF1001800). P.W, Z.X ha progettato lo studio. P.W, B.X, Z.C, J.X e N.Z hanno analizzato i dati e creato le figure. P.W ha scritto la prima bozza del manoscritto. Z.X., R.Z. e Q.S. hanno rivisto il manoscritto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,2 % Na4P2O7 soluzione | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20041418 | Utilizzato per diluire la sospensione del suolo. |
| 100 μ m Filtro cellulare in nylon | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F613463-0001 | Utilizzato per filtrare la soluzione di coltura e separare il biofilm della pellicola. |
| Soluzione di NaClO al 2% | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | L03336903 | Utilizzato per sterilizzare i semi. |
| Piastra a 24 pozzetti | Merck & Co., Inc. | PSRP010 | Utilizzato per la coltivazione micobiale e la separazione di biofilm in pellicola. |
| 3-(N-morfolino) acido propano solfonato (MOPS) | Bioolook Scientific Research Special | 2360010 | Utilizzato per preparare terreni MSgg. |
| Provetta da centrifuga da 50 ml | Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd. | 62.547.254 | Provette da centrifuga di dimensioni adeguate per il nostro protocollo. |
| Soluzione al 75% C2H5OH | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 801769680 | Utilizzato per sterilizzare i semi. |
| Acinetobacter baumannii XL-1 | Nanjing Agricultural University | N/A | Ceppi isolati dal suolo della rizosfera. |
| Bacillus velezensis SQR9 | Nanjing Agricultural University | N/A | Ceppi isolati dal suolo della rizosfera. |
| Kit DNA per batteri | Nanjing Dinsi Biotechnology Co., Ltd. | D3350020000K04U021 | Utilizzato per estrarre il DNA batterico. |
| Suolo nero I | Nanjing Agricultural University | N/A Suolo | nero della provincia di Jilin. |
| Suolo nero II | Università agraria di Nanchino | N/A Suolo | nero della provincia di Heilongjiang. |
| Burkholderia cenocepacia XL-2 | Nanjing Agricultural University | N/A | Ceppi isolati dal suolo della rizosfera. |
| CaCl2 | Xilong Scientific Co., Ltd. | 10035048 | Utilizzato per preparare i media MSgg. |
| Centrifuga | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | G508009-0001 | Centrifuga ad alta velocità. |
| ChamQ SYBR qPCR Master Mix | Vazyme Biotech Co., Ltd. | Q311-02 | Utilizzato per l'amplificazione del DNA in qPCR. |
| Banco Pulito | Suzhou Antai Airtech Co., Ltd. | NB026143 | Utilizzato per il funzionamento asettico. |
| Incubatore a temperatura costante | ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd | GNP-9080BS- | Utilizzato per la coltivazione microbica. |
| Cristal Violet Dye | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600331 | Utilizzato per la colorazione e la quantificazione di biofilm su pellicola. |
| Semi di cetriolo | Nanjing Agricultural University | N/A | "Jinchun I" semi di cetriolo. |
| Culturome v 1.0 | L'Istituto di Genetica e Biologia dello Sviluppo dell'Accademia Cinese delle Scienze | N/A | Utilizzato per la rizosfera ad alto rendimento e l'identificazione batterica del suolo |
| FeCl3 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | Utilizzato per preparare terreni MSgg. |
| Frigorifero | Hefei Midea Frigorifero Co., Ltd. | BCD-556WKPM(Q) | Utilizzato per la conservazione delle deformazioni. |
| Glutammato | Bioolook Scientific Research Special | 2180020 | Utilizzato per preparare terreni MSgg. |
| Glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Utilizzato per preparare terreni MSgg. |
| Cesto di piantagione idroponica | Yulv Furniture Store | Utilizzato per l'idroponica del cetriolo. | |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co.,Ltd. | 10017618 | Utilizzato per preparare i supporti MSgg. |
| Fornitore verificato - MgCl2 | Xilong Scientific Co., Ltd. | 7791186 | Utilizzato per preparare i media MSgg. |
| MnCl2 | Xilong Scientific Co., Ltd. | 10400101 | Utilizzato per preparare i media MSgg. |
| Msgg Medio | Shanghai Bioesn Biotechnology Co., Ltd. | BES20791KB | Terreno di coltura per biofilm Pellicle. |
| Na2HPO4· 7H2O | Merck & Co., Inc. | S9390-100G | Utilizzato per preparare i terreni TSB. |
| NaCI | Chinasun Specialty Products co., Ltd. | HS0416 | Utilizzato per preparare i terreni TSB. |
| NaH2PO4· H2O | Merck & Co., Inc. | S9638-25G | Utilizzato per preparare i fluidi TSB. |
| PBS-S Buffer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E607008-0001 | Tampone di base per tessuti viventi. |
| Fenilalanina | RYON | RT3486L005 | Utilizzato per preparare i terreni MSgg. |
| Pipetta | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. | BS-1000-T | Utilizzato per l'inoculazione del ceppo. |
| PMD19T Plasmide | Takara Biomedical Technology (Pechino) Co., Ltd. | D102A | Utilizzato per generare curve standard qPCR. |
| Pot | Sinopharm Reagente Chimico Co., Ltd. | YHHWS2401 | Utilizzato per la coltura del terreno del cetriolo. |
| Primer per qPCR | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | N/A | Utilizzato per l'amplificazione del DNA nella qPCR. |
| Strumento PCR in tempo reale | Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd. | 4484073 | Utilizzato per eseguire la qPCR su biofilm a pellicola selezionati. |
| Roary | The Wellcome Trust SangerInstitute | N/A | Utilizzato per progettare primer di qPCR |
| Shaker | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd | ZQTY-50S | Utilizzato per la miscelazione di soluzioni e la coltivazione microbica. |
| Silwet L-77 | Cytiva Bio-technology (Hangzhou) Co., Ltd. | SL77080596 | Utilizzato per preparare i supporti TSB. |
| Peptone di soia | Qingdao Parco industriale hi-tech Hope Bio-technology Co., Ltd | HB8275 | Utilizzato per preparare i media TSB. |
| Spettrofotometro | Shanghai Yidian Analysis Instrument Co., Ltd. | 76713100010 | Utilizzato per la quantificazione del biofilm della pellicola viola cristil. |
| Acqua sterile | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | SW150302 | Utilizzato per lavare il biofilm della pellicola. |
| Guanti in nitrile sterilizzati Beijing | Labgic Technology Co., Ltd. | 223016852LLZA | Utilizzato per operazioni sperimentali di base. |
| Modello DNA | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | N/A | Utilizzato per l'amplificazione del DNA nella qPCR. |
| Tiamina | Bioolook Ricerca Scientifica 2180020 | Utilizzato per preparare terreni MSgg. | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Utilizzato per preparare i terreni TSB. |
| Triptofano | Bioolook Ricerca Scientifica 2190020 | Utilizzato per preparare terreni MSgg. | |
| TSB Medio | Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co., Ltd. | 024048 | Mezzo batterico ad ampio spettro. |
| TSB-Msgg Meidium | Nanjing Agricultural University | N/A | Terreno misto per la coltura di biofilm a pellicola con una più ampia applicabilità. |
| ZnCl2 | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | C0310520123 | Utilizzato per preparare terreni MSgg. |
Riferimenti
- Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
- Campbell, R., Greaves, M. P., Lynch, J. Anatomy and community structure of the rhizosphere. Rhizosphere. , 11-34 (1990).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M., Bakker, P. A. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends Plant Sci. 17 (8), 478-486 (2012).
- Lugtenberg, B., Kamilova, F. D. Plant-growth-promoting rhizobacteria. Annu Rev Microbiol. 63, 541-556 (2009).
- Compant, S., Clément, C., Sessitsch, A. Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: Their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization. Soil Biol Biochem. 42, 669-678 (2010).
- Bais, H. P., Fall, R. R., Vivanco, J. M. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production. Plant Physiol. 134 (1), 307-319 (2004).
- Trivedi, P., Leach, J. E., Tringe, S. G., Sa, T., Singh, B. K. Plant-microbiome interactions: From community assembly to plant health. Nat Rev Microbiol. 18, 607-621 (2020).
- Sun, X., et al. Bacillus velezensis stimulates resident rhizosphere Pseudomonas stutzeri for plant health through metabolic interactions. ISME J. 16, 774-787 (2021).
- Pandhal, J., Noirel, J. Synthetic microbial ecosystems for biotechnology. Biotechnol Lett. 36, 1141-1151 (2014).
- Grosskopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Curr Opin Microbiol. 18, 72-77 (2014).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana. root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528, 364-369 (2015).
- Bakken, L. R. Separation and purification of bacteria from soil. Appl Environ Microbiol. 49 (6), 1482-1487 (1985).
- Yang, O., et al. Direct cell extraction from fresh and stored soil samples: Impact on microbial viability and community compositions. Soil Biol Biochem. 155, 108178(2021).
- Ren, D., et al. High-throughput screening of multispecies biofilm formation and quantitative PCR-based assessment of individual species proportions, useful for exploring interspecific bacterial interactions. Microb Ecol. 68, 146-154 (2013).
- Sun, X., et al. Metabolic interactions affect the biomass of synthetic bacterial biofilm communities. mSystems. 8, e01045-e01123 (2023).
- Zhang, J., et al. High-throughput cultivation and identification of bacteria from the plant root microbiota. Nat Protoc. 16, 988-1012 (2021).
- Ren, D., Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burnolle, M. High prevalence of biofilm synergy among bacterial soil isolates in cocultures indicates bacterial interspecific cooperation. ISME J. 9, 81-89 (2015).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48 (1), 066(2024).
- Palková, Z. Multicellular microorganisms: Laboratory versus nature. EMBO Rep. 5, 470-476 (2004).
- Xu, Z., et al. Chemical communication in plant-microbe beneficial interactions: a toolbox for precise management of beneficial microbes. Curr Opin Microbiol. 72, 102269(2023).
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