Articolo metodologico

Preparazione di sospensioni unicellulari di cellule epiteliali timiche di topo e colorazione di molecole intracellulari per analisi citofluorimetrica

DOI:

10.3791/66945

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26 luglio 2024

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1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo i protocolli per la preparazione di sospensioni a singola cellula di cellule epiteliali timiche-di topo e la colorazione di molecole intracellulari per l'analisi citofluorimetrica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule epiteliali timiche, TEC, svolgono un ruolo essenziale nel promuovere lo sviluppo e la selezione del repertorio delle cellule T. Le TEC corticali (cTEC) nella corteccia timica inducono lo sviluppo precoce delle cellule T e la selezione positiva dei timociti corticali. Al contrario, le TEC midollari (mTEC) nel midollo timico attraggono timociti selezionati positivamente dalla corteccia e stabiliscono un'autotolleranza nelle cellule T. Una varietà di molecole, tra cui DLL4 e beta5t espresse nei cTEC, così come Aire e CCL21 espresse in mTEC, contribuiscono alla funzione del timo supportando lo sviluppo e la selezione delle cellule T. L'analisi citofluorimetrica di molecole funzionalmente rilevanti in cTEC e mTEC è utile per migliorare la nostra comprensione della biologia dei TEC, anche se gli attuali metodi per la preparazione di sospensioni di singole cellule di TEC possono recuperare solo una piccola frazione di TEC (circa l'1% per i cTEC e circa il 10% per gli mTEC) dal timo di topo giovane adulto. Poiché molte di queste molecole funzionalmente rilevanti nelle TEC sono localizzate all'interno delle cellule, descriviamo i nostri protocolli per la preparazione di sospensioni di singole cellule di TEC di topo e la colorazione di molecole intracellulari per l'analisi citofluorimetrica.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il timo è un organo mesenchimale epiteliale che promuove lo sviluppo e la selezione del repertorio dei linfociti T. Nei microambienti corticali e midollari all'interno del timo, le cellule epiteliali timomiche (TEC) svolgono un ruolo cruciale nel dirigere lo sviluppo e la selezione delle cellule T. È ben noto che le TEC corticali (cTEC) nella corteccia timica contribuiscono principalmente all'induzione dello sviluppo precoce delle cellule T e alla selezione positiva dei timociti che esprimono il recettore dell'antigene (TCR) delle cellule T di nuova generazione. Al contrario, le TEC midollari (mTEC) nel midollo timico sono essenziali per l'attrazione di timociti selezionati positivamente dalla corteccia e l'instaurazione di un'autotolleranza centrale eliminando le cellule T autoreattive e generando cellule T regolatorie1,2. Queste funzioni dei TEC nel supportare lo sviluppo e la selezione delle cellule T sono mediate da una varietà di molecole espresse in cTEC e mTEC.

Questi includono il ligando 4 simile a Delta (DLL4), importante per la specificazione del lignaggio delle cellule T dei progenitori linfoidi)3,4, beta5t (noto anche come Psmb11, importante per la selezione positiva delle cellule T CD8)5,6, e Prss16 (noto anche come proteasi serina specifica del timo, o TSSP, importante per la selezione positiva delle cellule T CD4)7,8 espresso in cTEC e regolatore autoimmune (Aire, importante per l'espressione promiscua dei geni self)9,10, dito di zinco della famiglia Fez 2 (Fezf2, importante per l'espressione promiscua di autogeni Aire-indipendenti e la generazione di cellule del ciuffo timico)11,12,13,14, e il ligando 21 delle chemochine con motivo C-C (CCL21, importante per la migrazione midollare e l'accumulo di timociti selezionati positivamente)14,15,16 espressi in mTEC. La citometria a flusso fornisce un mezzo per rilevare quantitativamente queste molecole funzionalmente significative nei TEC, facilitando la valutazione sia dello sviluppo che della funzione di cTEC e mTEC. Poiché molte delle molecole nei TEC sono espresse principalmente all'interno delle cellule, come nel citoplasma (ad esempio, componente del proteasoma beta5t) e nel nucleo (ad esempio, regolatore trascrizionale Aire), è vantaggioso analizzare quantitativamente le molecole intracellulari nei cTEC e negli mTEC utilizzando la citometria a flusso.

I TEC sono rari nel timo. Una femmina di topo a 5 settimane di età ha circa 1 × 106 cTEC e circa 2,5 × 106 mTEC, mentre la corteccia timica contiene circa 3 × 108 timociti CD4+CD8+ e il midollo timico contiene circa 5 × 107 timociti CD4+CD8- e CD4-CD8+17. Pertanto, la stragrande maggioranza (>99%) delle cellule del timo sono cellule ematopoietiche, compresi i timociti, piuttosto che TEC, nei giovani topi adulti. Inoltre, i TEC sono strettamente associati alle cellule vicine (ad esempio, i timociti) e ai componenti extracellulari architettonici (ad esempio, il collagene) all'interno del timo, quindi la liberazione dei TEC in sospensione cellulare richiede la digestione proteasica del timo. I metodi convenzionali per la digestione enzimatica producono solo una piccola frazione di TEC; circa l'1% (1 × 104) e il 10% (2 × 105) rispettivamente per cTEC e mTEC, da timo17,18,19. La bassa efficienza della liberazione di TEC dal timo è probabilmente dovuta alla suscettibilità dei TEC agli enzimi proteolitici e allo stress meccanico e alla stretta associazione dei TEC con le cellule vicine, in particolare tra cTEC e timociti CD4+CD8+20. A questo proposito, i risultati dell'analisi su singole cellule di TEC di topo, compresa l'analisi citofluorimetrica e l'analisi di sequenziamento dell'RNA su singola cellula, basati sugli attuali metodi di preparazione cellulare mediati dalla digestione enzimatica, sono rappresentativi solo di una piccola parte dei TEC e quindi sono ben lungi dall'essere completi. Tuttavia, nonostante tali limitazioni nel recupero enzimatico dei TEC, l'analisi citofluorimetrica dei TEC di topo in sospensione a singola cellula è ancora utile per l'analisi quantitativa di molecole funzionalmente rilevanti nei cTEC e nei mTEC. Nella sospensione cellulare, le TEC sono state definite come cellule positive per la molecola di superficie epiteliale EpCAM (CD326) e negative per la molecola di superficie ematopoietica CD45. All'interno delle TEC EpCAM+CD45-, i livelli di espressione sulla superficie cellulare delle molecole Ly51 (note anche come BP-1 e CD249) e la capacità di legare l'agglutinina I (UEA1) di Ulex Europaeus (principalmente legandosi a glicoproteine e glicolipidi contenenti fucosi legati a α) sono stati utilizzati per marcare fenotipicamente cTEC (Ly51alto, UEA1basso) e mTEC (Ly51basso, UEA1alto, alto). Qui descriviamo i nostri protocolli sperimentali per la preparazione convenzionale di sospensioni monocellulari di TEC di topo e la colorazione di molecole intracellulari per l'analisi citofluorimetrica, concentrandoci sull'analisi quantitativa di molecole intracellulari beta5t, CCL21 e Aire in TEC di topo appena preparati.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati eseguiti sotto l'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali del National Cancer Institute (ASP21-431, ASP21-432 e EIB-076-3).

1. Preparazione della sospensione di cellule del timo

NOTA: L'ontogenesi del topo influenza l'efficienza della liberazione enzimatica dei TEC dal timo. Di seguito sono descritti tre metodi a seconda dell'età del topo.

  1. Per topi postnatali di età superiore a 3 settimane
    1. Raccogli il timo (due lobi del timo) da un topo. Mettere il timo in 5 mL di RPMI1640 contenente 10 mM di HEPES in una capsula di plastica da 60 mm su ghiaccio.
    2. Rimuovere il sangue, i tessuti non timotici e il grasso con una pinzetta curva a punta fine al microscopio da dissezione. Tagliare il timo a pezzetti (di circa 1-2 mm di dimensione) con le forbici da dissezione.
    3. Trasferire i pezzi di timo in una provetta conica da 15 mL contenente 3 mL di 1 mg/mL di collagenasi/dispasi e 1 U/mL di soluzione di DNasi in RPMI1640 contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS). Incubare a bagnomaria o blocco termico a 37 °C per 20 min.
    4. Mescolare delicatamente utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da 3 mL. Incubare per altri 20 minuti nel caso in cui i frammenti di tessuto siano ancora visibili.
    5. Mescolare delicatamente utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da 3 mL. Incubare per altri 10 minuti nel caso in cui i frammenti di tessuto siano ancora visibili.
    6. Mescolare delicatamente utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da 3 mL. Aggiungere 5 mL di EDTA 5 mM in 1x HBSS contenente l'1% di FBS.
    7. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 μm e in una nuova provetta conica da 50 mL. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 × g a 4 °C per 5 minuti.
    8. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di tampone FACS (1x HBSS contenente l'1% di albumina sierica bovina [BSA] e lo 0,1% di NaN3).
    9. Conservare le celle sul ghiaccio e determinare il numero di celle utilizzando un contatore di celle.
  2. Per topi neonati di età compresa tra 1 e 2 settimane
    1. Eseguire il passaggio 1.1.1.
    2. Rimuovere il sangue e i tessuti non timici con una pinzetta da dissezione al microscopio da dissezione. Trasferire il timo in una provetta di plastica da 1,5 ml contenente 200 μl di RPMI1640 con 10 mM HEPES e tagliare il timo in piccoli pezzi (di circa 1-2 mm di dimensione) con le forbici da dissezione.
    3. Lasciare che i frammenti di timo si depositino sul fondo della provetta, quindi rimuovere delicatamente la sospensione con una micropipetta da 200 μl.
    4. Trasferire i pezzi di timo in una provetta a fondo tondo in polipropilene da 5 mL contenente 2 mL di 0,5 mg/mL di Collagenasi/Dispasi e 1 U/mL di soluzione di DNasi in RPMI1640 contenente il 2% di FBS. Incubare a bagnomaria o blocco termico a 37 °C per 10 min.
    5. Miscelare delicatamente utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da 3 mL e quindi con una micropipetta da 1 mL dotata di un puntale in plastica per un'ulteriore omogeneizzazione.
    6. Aggiungere 2 mL di EDTA da 5 mM in 1x HBSS contenente l'1% di FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 μm e in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere 16 mL di RPMI1640 contenente 10 mM HEPES.
    7. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 × g a 4 °C per 5 minuti. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di tampone FACS.
    8. Conserva le celle sul ghiaccio e determina il numero di celle utilizzando un contatore di celle.
  3. Per topi embrionali e topi neonati fino a 1 settimana di età
    1. Raccogli il timo (due lobi del timo) da un topo. Metti il timo in un piatto di plastica da 60 mm e rimuovi il sangue, i tessuti non timonici e il grasso con una pinzetta a punta fine curva al microscopio da dissezione.
    2. Mettere il timo in 0,2 mL di RPMI1640 contenente 10 mM di HEPES in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Eliminare il liquido con una micropipetta da 200 μl.
    3. Aggiungere 0,5 mL di 0,5 mg/mL di Collagenasi/Dispasi e 1 U/mL di soluzione di DNasi in RPMI1640 contenente il 2% di FBS. Incubare a bagnomaria o blocco termico a 37 °C per 10 min. Miscelare delicatamente utilizzando una micropipetta da 1 ml con puntale in plastica.
    4. Aggiungere 0,5 mL di EDTA 5 mM in 1x HBSS contenente l'1% di FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 μm e in una nuova provetta conica da 15 mL. Aggiungere 9 mL di RPMI1640 contenente 10 mM HEPES.
    5. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 × g a 4 °C per 5 minuti. Risospendere il pellet cellulare in 1-3 mL di tampone FACS.
    6. Conserva le celle sul ghiaccio e determina il numero di celle utilizzando un contatore di celle.
  4. Metodo alternativo: Liberare la digestione
    1. Eseguire i passaggi 1.1.1 e 1.1.2.
    2. Lasciare che i frammenti di timo si depositino sul fondo della provetta, quindi rimuovere delicatamente la sospensione con una micropipetta da 200 μl. Trasferire i pezzi di timo in una provetta da 5 mL contenente 1 mL di 0,5 U/mL di Liberase e 1 U/mL di DNasi in RPMI1640 contenente 10 mM di HEPES. Incubare a bagnomaria o blocco termico a 37 °C per 15 min.
    3. Miscelare delicatamente utilizzando una micropipetta da 1 ml con puntale in plastica. Incubare per altri 15 minuti nel caso in cui i frammenti di tessuto siano ancora visibili.
    4. Miscelare delicatamente utilizzando una micropipetta da 1 ml con puntale in plastica. Aggiungere 1 mL di 5 mM EDTA in 1x HBSS contenente l'1% di FBS.
    5. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 μm e in una nuova provetta conica da 50 mL. Aggiungere 18 mL di RPMI1640 contenente 10 mM HEPES.
    6. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 × g, 4 °C per 5 minuti. Risospendere le cellule in 10 mL di tampone FACS (1x HBSS contenente l'1% di BSA e lo 0,1% di NaN3).
    7. Conserva le celle sul ghiaccio e determina il numero di celle utilizzando un contatore di celle.

2. Colorazione degli anticorpi delle cellule del timo

  1. Mettere 16 × 106 cellule in una provetta di polistirene a fondo tondo da 5 mL. Centrifugare le celle a 350 × g a 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante.
  2. Aggiungere 10 μl di concentrazione di lavoro di anticorpo monoclonale anti-recettore Fc (mAb, clone 2.4G2) nel tampone FACS per bloccare il legame non specifico delle IgG coloranti al recettore Fc della superficie cellulare. Incubare a 4 °C per 5 min.
  3. Aggiungere 40 μl ciascuno di concentrazioni operative di anticorpi monoclonali anti-CD45 (ematopoietici specifici per le cellule; ad es. marcati con BV421), anticorpi monoclonali anti-EpCAM (epiteliali specifici per le cellule; ad es. marcati con PE-Cy7), anticorpi monoclonali anti-Ly51 (che rilevano cTEC; ad esempio, marcati con AF647) e Ulex europaeus agglutinina I (UEA-1) (che rilevano mTEC; ad esempio, marcati con AF594) nel tampone FACS. Parallelamente, preparare le provette per le cellule colorate in un solo colore e le cellule non colorate per l'impostazione di un citometro a flusso.
  4. Incubare a 4 °C per 45 minuti. Mescolare bene ogni 10 minuti. Aggiungere 2 mL di tampone FACS.
  5. Centrifugare le celle 350 × g a 4 °C per 5 min. Eliminare il surnatante.
  6. Aggiungere 1 μl di colorante Ghost Violet 510 (per distinguere le cellule vitali da quelle morte nell'analisi citofluorimetrica di cellule fissate e permeabili). Utilizzare il reagente Ghost Dye non diluito; Mescolate bene. Incubare a 4 °C per 30 min; Mescolare bene ogni 10 minuti.
  7. Aggiungere 2 ml di tampone FACS. Centrifugare le celle 350 × g a 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante.
  8. Fissare le cellule aggiungendo 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 2% in PBS e incubando a temperatura ambiente per 10 minuti.
  9. Aggiungere 3,5 mL di PBS alla provetta e centrifugare le celle 700 × g a 4 °C per 8 minuti. Eliminare il surnatante.
  10. Permeabilizzare le cellule aggiungendo 1 mL di tampone di fissazione/permeabilizzazione intracellulare e incubando a 4 °C per 20 minuti.
  11. Centrifugare le celle da 700 × g a 4 °C per 8 minuti. Eliminare il surnatante.
  12. Aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione 1x. Centrifugare le celle a 700 × g a 4 °C per 8 min. Scartare il surnatante.
  13. Aggiungere 100 μl di concentrazioni di lavoro di anticorpi anti-beta5t o anticorpi anti-CCL21, o 40 μl di concentrazioni di lavoro di anticorpi anti-Aire (ad es. marcati con AF488), in 1x tampone di permeabilizzazione, mescolare bene e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente.
  14. Aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione 1x. Centrifugare le celle a 700 × g a 4 °C per 8 min. Scartare il surnatante.
  15. Ripetere il passaggio 2.14.
  16. Aggiungere 100 μL di concentrazioni operative di IgG anti-coniglio (ad es. marcate con AF555) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
  17. Aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione 1x. Centrifugare le celle a 700 × g a 4 °C per 8 min. Scartare il surnatante.
  18. Risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS e mescolare bene.
  19. Conservare le cellule al buio a 4 °C fino all'analisi citofluorimetrica.
  20. Filtrare le celle attraverso una rete di nylon da 60 μm prima dell'analisi citofluorimetrica.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'analisi richiede un citometro a flusso che consenta la rilevazione di almeno sei canali di fluorescenza (per CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye e beta5t, CCL21 e/o Aire) nonché parametri di dispersione diretta e laterale. I profili citometrici a flusso rappresentativi delle cellule di timo digerite con collagenasi/dispasi di topi di 0 giorni e topi di 2 settimane sono mostrati rispettivamente in Figura 1 e Figura 2. In entrambe le figure, il grafico a punti nel pannello A mostra l'intensità di diffusione diretta (FSC) e l'intensità di fluorescenza Ghost Dye Violet 510 dei segnali di particolato totale. Più del 90% dei segnali di particolato rappresenta cellule vitali, come giudicato dalla colorazione negativa del reagente Ghost Dye e dalla dispersione diretta che riflette le dimensioni delle cellule. Il pannello B mostra i segnali di fluorescenza della superficie cellulare delle cellule vitali del timo per CD45, una molecola espressa dalle cellule ematopoietiche, ed EpCAM, una molecola espressa dalle cellule epiteliali. Una popolazione cellulare piccola ma distintiva è CD45-EpCAM+, che rappresenta quindi i TEC.

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Figura 1: Profili citometrici a flusso rappresentativi di cellule di timo digerite con collagenasi/dispasi da topi di fondo C57BL/6 wild-type di 0 giorni. (A) Intensità di dispersione diretta e intensità di fluorescenza Ghost Dye Violet 510 dei segnali di particolato totale. La casella rossa indica i segnali delle cellule vitali. (B) Segnali di fluorescenza di cellule vitali (riquadro rosso nel pannello A) per CD45 ed EpCAM. La casella rossa indica i TEC CD45- EpCAM+. (C) I segnali di colorazione della superficie cellulare Ly51 e UEA1 nei TEC (riquadro rosso nel pannello B) rivelano due popolazioni principali: le cellulebasse di Ly51ad alto UEA1 arricchite con cTEC e le cellulead alto contenuto di UEA1a basso contenuto di Ly51 arricchite con mTEC. (D-F) Rilevamento di (D) beta5t, (E) CCL21 e (F) Aire in cTEC (pannelli superiori) e mTEC (pannelli inferiori) come definito nel pannello C. Gli istogrammi grigi mostrano profili di controllo colorati solo con anticorpi secondari (D,E) e (F) colorati con cellule di topi carenti di Aire. Abbreviazioni: FSC = dispersione in avanti; TECs = Cellule epiteliali del timo; cTEC = TEC corticali; mTEC = TEC midollari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Profili citometrici a flusso rappresentativi di cellule di timo digerite con collagenasi/dispasi da topi di fondo C57BL/6 wild-type di 2 settimane. (A) Intensità di dispersione diretta e intensità di fluorescenza Ghost Dye Violet 510 dei segnali di particolato totale. La casella rossa indica i segnali delle cellule vitali. (B) Segnali di fluorescenza di cellule vitali (riquadro rosso nel pannello A) per CD45 ed EpCAM. La casella rossa indica i TEC CD45- EpCAM+. (C) I segnali di colorazione della superficie cellulare Ly51 e UEA1 nei TEC (riquadro rosso nel pannello B) rivelano due popolazioni principali: le cellulebasse di Ly51ad alto UEA1 arricchite con cTEC e le cellulead alto contenuto di UEA1a basso contenuto di Ly51 arricchite con mTEC. (D-F) Rilevamento di (D) beta5t, (E) CCL21 e (F) Aire in cTEC (pannelli superiori) e mTEC (pannelli inferiori) come definito nel pannello C. Gli istogrammi grigi mostrano i profili di controllo colorati solo con anticorpi secondari (D,E) e colorati con IgG corrispondenti all'isotipo marcato con (F) FITC. Abbreviazioni: FSC = dispersione in avanti; TECs = Cellule epiteliali del timo; cTEC = TEC corticali; mTEC = TEC midollari; FITC = isotiocianato di fluoresceina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I segnali di colorazione della superficie cellulare di Ly51 e UEA1, come mostrato nel pannello C, rivelano due popolazioni principali nei TEC; una popolazione relativamente alta in Ly51 e bassa in UEA1 arricchita con cTEC, e un'altra relativamente bassa in Ly51 e alta in UEA1 arricchita con mTECs21,22,23,24,25. Durante le fasi embrionali e neonatali, compreso l'età di 0 giorni, la frequenza dei cTEC è maggiore di quella dei mTEC. Nelle fasi postnatali, la frequenza degli mTEC domina principalmente perché l'efficienza della liberazione di cTEC dal timo diventa estremamente bassa (circa l'1% dei cTEC e il 10% degli mTEC possono essere recuperati in una singola sospensione cellulare)17.

La fissazione e la permeabilizzazione delle cellule consentono il rilevamento di molecole intracellulari all'interno dei TEC. Il pannello D mostra l'espressione di beta5t rilevata nella maggior parte dei cTEC ma non negli mTEC; il pannello E mostra la rilevazione di CCL21 in una frazione di mTEC ma non in cTEC, e il pannello F mostra l'Aire espresso in una sottopopolazione di mTEC.

Ulteriori profili citometrici a flusso di molecole intracellulari nei TEC di topo possono essere trovati in articoli pubblicati; per beta5t6,20, CCL2114,16,26, e Aire27,28, così come per ulteriori molecole intracellulari, inclusa la cheratina22,29 e Fezf211,30.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La collagenasi, con o senza Dispasi, è ampiamente utilizzata per digerire il timo di topo per preparare i TEC 4,5,9,18,21. Liberase, che contiene una miscela di proteasi tra cui la collagenasi, viene utilizzato anche per digerire il timo per preparare i TEC17,22. L'uso di collagenasi e liberasi offre rese e qualità sostanzialmente equivalenti di cTEC e mTEC del timo di topo, anche se possono comparire piccole differenze a seconda del lotto di prodotti degli enzimi. La tripsina viene utilizzata anche per un'efficiente digestione del timo21,23, sebbene sia stato dimostrato che molte molecole della superficie cellulare, tra cui EpCAM e CD80 espresse dai TEC, sono suscettibili alla digestione della tripsina21. Per la digestione enzimatica del timo, la DNasi viene spesso aggiunta per ridurre la viscosità a causa del rilascio di DNA dalle cellule danneggiate17,21.

La digestione enzimatica del timo è essenziale per la liberazione dei TEC dal timo. Il timo deve essere digerito a sufficienza fino a quando i frammenti di tessuto diventano invisibili e la sospensione cellulare appare omogenea. Tuttavia, la digestione non deve essere lasciata troppo a lungo perché un trattamento enzimatico eccessivo danneggia le cellule e diminuisce la vitalità cellulare. In ogni esperimento, è importante prestare particolare attenzione al periodo di incubazione e alla forza di pipettaggio durante la digestione del timo. È anche importante essere consapevoli che l'attuale tecnologia di digestione enzimatica consente la liberazione solo di una piccola frazione di TEC, come dettagliato nell'Introduzione e come riportato in precedenza 17,18,19.

Poiché i TEC sono rari nella sospensione totale di cellule del timo, l'analisi citofluorimetrica dei TEC utilizzando la sospensione totale di cellule del timo richiede la colorazione di molte cellule, in genere 8 × 106-16 × 106 cellule per misurazione.

I TEC derivati da cellule di timo digerite con enzimi possono essere arricchiti utilizzando perle magnetiche anti-CD4522 e/o centrifugazione a gradiente di densitàPercoll 31. Queste procedure di arricchimento consentono di risparmiare tempo, soprattutto quando i TEC vengono successivamente purificati su un selezionatore di cellule citofluorimetriche. Va anche notato che l'arricchimento anti-CD45 rimuoverebbe una sottopopolazione di TEC che sono strettamente associati ai timociti20 che esprimono CD45 e la centrifugazione di Percoll potrebbe rimuovere una sottopopolazione inaspettatamente densa di TEC.

Per quanto riguarda la fissazione dei TEC, è noto che il trattamento con PFA restringe le cellule e riduce l'intensità di dispersione diretta nell'analisi citofluorimetrica. Un pipettaggio delicato delle cellule subito dopo l'aggiunta del 2% di PFA e la successiva aggiunta di PBS può aiutare a prevenire un eccessivo restringimento delle cellule.

Per l'analisi citofluorimetrica, data la rara presenza di TEC all'interno del timo, la loro delineazione richiede un approccio distinto rispetto ai timociti o agli splenociti. La classificazione iniziale si basa sull'utilizzo di CD45, un pan-marcatore ematopoietico ubiquitario sui timociti e su altre cellule ematopoietiche, comprese le cellule dendritiche e i macrofagi. Al contrario, i TEC, essendo di origine non ematopoietica, mancano di espressione di CD45. Invece, i TEC esprimono EpCAM sulla loro superficie, consentendo così una strategia di gating diretta di CD45-negativi ed EpCAM-positivi per distinguere i TEC. Nella nostra analisi citofluorimetrica, iniziamo definendo questa popolazione e successivamente garantiamo un ridimensionamento appropriato dei parametri di dispersione diretta e laterale, data la sostanziale discrepanza dimensionale tra TEC e timociti, e date le grandi dimensioni e l'elevata autofluorescenza dei TEC.

Successivamente, l'attenzione è rivolta alla valutazione dei marcatori cTEC- e mTEC all'interno della popolazione CD45-negativa EPCAM-positiva. A causa delle dimensioni ridotte di questa popolazione, questo passaggio diventa imperativo per compensare i cTEC e i mTEC. L'esame di un pannello interamente colorato (ad esempio, il marcatore cTEC Ly51 e il marcatore mTEC UEA-1 insieme a CD45 ed EpCAM che definiscono TEC) garantisce ulteriormente l'adeguatezza della scala di dispersione. Durante la configurazione della citofluorimetria, il nostro obiettivo principale ruota attorno al discernimento delle popolazioni positive e negative per ciascun anticorpo.

Nella co-colorazione di Aire, beta5t e CCL21, vengono identificate popolazioni distinte all'interno di sottogruppi di TEC. Data l'espressione selettiva di Aire da parte degli mTEC, ci concentriamo sulla colorazione a quattro colori delle cellule CD45-negative/EPCAM-positive/UEA-1-positive/Ly51-negative. Qui, le cellule UEA-1-positive vengono utilizzate per stabilire il controllo negativo per Aire, facilitando una chiara identificazione delle cellule Aire-positive. Un approccio simile è adottato per il CCL21, che è espresso all'interno dei mTEC. Al contrario, per beta5t, espresso esclusivamente da cTEC, viene applicata una strategia di gating comparabile, con enfasi sulle cellule Ly51-positive all'interno della colorazione a quattro colori, per accertare i livelli di fondo per beta5t. La successiva analisi dei campioni colorati con anti-beta5t facilita l'identificazione di una popolazione positiva.

L'anticorpo anti-beta5t e l'anticorpo anti-CCL21 sono anticorpi di coniglio, quindi questi anticorpi non devono essere miscelati senza una previa marcatura a fluorescenza. Le concentrazioni di lavoro degli anticorpi devono essere predeterminate eseguendo l'analisi citofluorimetrica delle cellule di controllo (ad esempio, TEC di topi wild-type e knockout) colorate con diluizioni seriali di anticorpi.

Nell'analisi citofluorimetrica, i cTEC e i mTEC sono spesso definiti dall'espressione sulla superficie cellulare di Ly51 o CD205 per i cTEC e di UEA1 e CD80 per i mTEC. Tuttavia, va tenuto presente che i cTEC e i mTEC devono essere eventualmente definiti dalla loro localizzazione microanatomica nel timo. Nel timo embrionale, evidenze emergenti hanno suggerito che l'espressione di Ly51 e CD205 non è limitata ai cTEC, ma si estende ad altre popolazioni di TEC, inclusi i progenitori bipotenti cTEC/mTEC e i mTEC immaturi32,33. Inoltre, l'espressione di Ly51 nei cTEC rimane bassa durante l'embriogenesi e il periodo perinatale rispetto al periodo postnatale33, come mostrato anche nella Figura 1 e nella Figura 2.

In conclusione, l'analisi citofluorimetrica della sospensione di singole cellule liberate enzimaticamente di TEC offre una potente tecnica per l'analisi quantitativa di TEC e delle loro sottopopolazioni con risoluzione di singola cellula, nonostante la limitata efficienza della liberazione di TEC. In particolare, l'analisi citofluorimetrica di molecole intracellulari in sospensione di TEC a singola cellula è utile per studiare l'espressione di una varietà di molecole importanti per lo sviluppo e la funzione dei TEC e delle loro sottopopolazioni.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il Dr. Izumi Ohigashi per aver letto il manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale ZIA BC 011806 del National Institutes of Health, dal National Cancer Institute e dal Center for Cancer Research.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Collagenasi/DispasiRoche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / Set di tamponi per colorazione del fattore di trascrizioneeBioscience00-5523-00
Colorante fantasma viola 510 Tonbo13-0870-T500
BV421 anti-topo CD45 anticorpo monoclonale, Clone 30-F11BD Horizon563890
Alexa Fluor 647 anti-topo Ly51 anticorpo monoclonale, Clone 6C3BioLegend108312
PE/Cy7 anti-topo EpCAM/CD326 anticorpo monoclonale, Clone G8.8BioLegend118216
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)Vector LaboratoriesDL-1067-1
Alexa Fluor 488 anticorpo monoclonale Aire anti-topo, Clone 5H12eBioscience53-5934-82
Anticorpo monoclonale di coniglio Psmb11/beta5t anti-topo, Clone CPTC-PSMB11 (topo)-1NIH NCICPTC-PSMB11 (topo)-1https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal
Anti-topo CCL21/exodus 2 anticorpo policlonale di coniglioBio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 anti-coniglio IgG catena pesante capra ricombinante anticorpoInvitrogenA27039
Anti-Topo CD32/CD16 Purificato (anticorpo a blocco Fc)Leinco TechnologiesC247
Rete di nylon 60 micronFornitura di componentiW31436
Attrezzatura
ThermomixerEppendorfBlocco
Cellometro Auto 2000 Contatore di vitalità cellulareNexcelom Conteggiodelle cellule vitali
LSRFortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesCitometro a flussoCinque laser (355, 408, 488, 595 e 637 nm)
Software FACSDiva versione 9.0.1BD BiosciencesAnalisi
FlowJo 10.9.0BD Biosciencesdati citofluorimetrici
Tasso di diluizione degli anticorpi (concentrazione di lavoro)di diluizione
Anti-Mouse CD32/CD16 – Purificato (anticorpo blocco Fc)1:40FACS Buffer
BV421 anti-topo CD45 anticorpo monoclonale1:25FACS Buffer
PE/Cy7 anti-topo EpCAM/CD326 anticorpo monoclonale1:100FACS Buffer
Alexa Fluor 647 anti-topo Ly51 anticorpo monoclonale1:100FACS Buffer
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)1:400FACS Buffer
Anti-mouse CCL21/exodus 2 anticorpo policlonale di coniglio1:200 1xTampone
Anti-topo Psmb11/beta5t anticorpo monoclonale di coniglio, Clone CPTC-PSMB11(mouse)-11:10001x Tampone
Alexa Fluor 555 anti-coniglio IgG anticorpo ricombinante di capra a catena pesante1:400 1xTampone
Scopo
RPMI1640 contenente 10 mM di HEPES Per la preparazione
cellule RPMI1640 contenenti il 2% di FBSPer la preparazione
tampone FACS (1x HBSS contenente l'1% di BSA  e 0,1% di sodio azide)Per la preparazione cellulare e la colorazione degli
1 mg/ml di collagenasi/dispasi e 1U/ml di DNasi in RPMI1640 contenente il 2% di FBS Per ladigestione
il 2% di PFA in PBSPer la fissazione
, il tampone di fissazione/permeabilizzazione (1 parte di concentrato di fissazione/permeabilizzazione con 3 parti di diluente di fissazione/permeabilizzazione)Per la fissazione cellulare
1x tampone di permeabilizzazione (1 parte di concentrato 10X con 9 parti di acqua distillata)per la colorazione intercellulare degli anticorpi.
di calorecitofluorimetrica Analisi dei Tampone di permeabilizzazionedi permeabilizzazionedi permeabilizzazionedidi celluleanticorpi,enzimatica, cellulare

Riferimenti

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