Indagine sull'angiogenesi a livello funzionale e molecolare sfruttando il saggio di migrazione della ferita da graffio e il saggio di germinazione sferoidale

Sommario

Questo studio presenta il saggio bidimensionale (2D) di migrazione della ferita da graffio e il saggio tridimensionale (3D) di germinazione degli sferoidi, insieme ai rispettivi metodi di analisi a valle, tra cui l'estrazione dell'RNA e l'immunocitochimica, come saggi adatti per studiare l'angiogenesi in vitro.

Abstract

L'angiogenesi svolge un ruolo cruciale nei processi fisiologici e patologici all'interno del corpo, tra cui la crescita tumorale o la malattia neovascolare dell'occhio. Una comprensione dettagliata dei meccanismi molecolari sottostanti e modelli di screening affidabili sono essenziali per indirizzare efficacemente le malattie e sviluppare nuove opzioni terapeutiche. Sono stati sviluppati diversi saggi in vitro per modellare l'angiogenesi, sfruttando le opportunità offerte da un ambiente controllato per chiarire i driver angiogenici a livello molecolare e lo screening dei bersagli terapeutici.

Questo studio presenta i flussi di lavoro per lo studio dell'angiogenesi in vitro utilizzando cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs). Descriviamo in dettaglio un saggio di migrazione della ferita da graffio utilizzando un sistema di imaging di cellule vive che misura la migrazione delle cellule endoteliali in un ambiente 2D e il saggio di germinazione degli sferoidi che valuta la germinazione delle cellule endoteliali in un ambiente 3D fornito da una matrice di collagene. Inoltre, delineiamo strategie per la preparazione dei campioni per consentire ulteriori analisi molecolari come la trascrittomica, in particolare nell'ambiente 3D, compresa l'estrazione dell'RNA e l'immunocitochimica. Nel complesso, questo quadro offre agli scienziati un set di strumenti affidabile e versatile per portare avanti le loro ricerche scientifiche nei saggi di angiogenesi in vitro .

Introduzione

L'angiogenesi, che si riferisce alla formazione di nuovi vasi sanguigni da quelli preesistenti¹, è un processo cruciale durante lo sviluppo fisiologico e le condizioni patologiche. È indispensabile per fornire energia a tessuti altamente metabolicamente attivi come la retina² o il sistema nervoso centrale in via di sviluppo³ e durante la guarigione dei tessuti danneggiati⁴. L'angiogenesi anormale, d'altra parte, è alla base di numerose malattie. I tumori solidi, come il cancro del colon-retto o il carcinoma polmonare non a piccole cellule, ne facilitano la crescita e l'apporto energetico necessario promuovendo l'angiogenesi⁵. Oltre al cancro, le malattie neovascolari dell'occhio come la retinopatia diabetica o la degenerazione maculare legata all'età, che rappresentano le principali cause di cecità nel mondo sviluppato, derivano dalla crescita aberrante dei vasi ^6,7. Una comprensione dettagliata del meccanismo patologico sottostante è fondamentale per comprendere come l'angiogenesi fisiologica possa essere migliorata, ad esempio, nella guarigione delle ferite, controllando meglio condizioni patologiche come le malattie oculari vasoproliferative.

A livello cellulare, le cellule endoteliali vascolari sono attivate da varie molecole di segnalazione nell'angiogenesi, avviando la proliferazione e la migrazione cellulare⁸. Le cellule successivamente si organizzano in una gerarchia, con cellule della punta non proliferanti che formano filopodi sul bordo anteriore del ramo del vaso in via di sviluppo⁸. Parallelamente, le cellule del gambo a proliferazione rapida seguono le cellule della punta, contribuendo alla formazione del vaso emergente. Successivamente, altri tipi di cellule, come i periciti o le cellule muscolari lisce, vengono reclutati per stabilizzare ulteriormente il ramo nascente⁹.

Per esplorare i processi molecolari a livello delle cellule endoteliali vascolari, sono stati sviluppati numerosi protocolli in vitro e recentemente rivisti¹⁰. Questi saggi rientrano in genere in due categorie: approcci 2D più semplicistici ma scalabili e protocolli 3D più elaborati. In un recente progetto, abbiamo condotto un'analisi comparativa completa tra il saggio 2D di migrazione della ferita da graffio e il saggio 3D di germinazione degli sferoidi¹¹ per valutare l'entità delle loro differenze e la loro capacità di modellare vari aspetti dell'angiogenesi¹².

Sebbene entrambi offrano il vantaggio di essere affidabili e facilmente implementabili, a livello molecolare il saggio 3D di germinazione degli sferoidi è risultato favorevole nell'affrontare aspetti chiave dell'angiogenesi rispetto ai dati in vivo, come gli interruttori metabolici o le interazioni cellula-matrice. Poiché i saggi di angiogenesi in vitro vengono utilizzati per valutare il potenziale angiomodulatorio delle vie di segnalazione¹³ e per lo screening degli agenti terapeutici, la trasferibilità dei risultati in vitro in contesti in vivo è essenziale. Inoltre, l'opportunità di analisi omiche sui livelli di RNA e proteine per caratterizzare i cambiamenti molecolari in risposta alla modulazione mirata di processi angiogenici in condizioni controllate rimane un vantaggio importante rispetto ai setting in vivo ^14,15.

In questa pubblicazione, presentiamo saggi chiave per esplorare le questioni relative all'angiogenesi attraverso l'utilizzo di un saggio di migrazione con imaging di cellule vive e un saggio di germinazione degli sferoidi, comprese le successive analisi molecolari come il sequenziamento dell'RNA per l'analisi trascrittomica e l'immunoistochimica a livello proteico.

Protocollo

1. Coltura cellulare HUVEC

NOTA: Eseguire tutti i seguenti passaggi in condizioni di lavoro sterili (banco di lavoro sterile).

1. Espansione degli HUVEC
   1. Per entrambi i test di angiogenesi, utilizzare cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs) o cellule endoteliali microvascolari umane (HMVECs).
   2. Coltivare le cellule fino a raggiungere il 90% di confluenza in una fiaschetta T75 non rivestita con terreno di crescita delle cellule endoteliali (EGM) prima di eseguire una divisione. Eseguire il cambio medio 3 volte a settimana.
      NOTA: Per accelerare la crescita, il mezzo può essere cambiato quotidianamente. Non utilizzare gli HUVEC oltre il sesto passaggio. Lo studio ha ricevuto i risultati più coerenti eseguendo tutti gli esperimenti con HUVEC dello stesso passaggio.
2. Divisione degli HUVEC
   1. Quando gli HUVEC raggiungono la confluenza desiderata nel matraccio T75, sciacquarli una volta con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), quindi incubare le cellule con tripsina allo 0,5% per 2 minuti nell'incubatore.
      NOTA: L'esposizione prolungata alla tripsina può danneggiare la funzione HUVAC.
   2. Staccare delicatamente le celle picchiettando sul pallone. Confermare il corretto distacco con un microscopio a contrasto di fase invertito.
   3. Aggiungere 8 mL di EGM, trasferire la soluzione in una provetta e pellettare le cellule mediante centrifugazione a 250 x g per 3 minuti.
   4. Se è necessario il conteggio delle cellule, risospendere le cellule in 5 mL di EGM e utilizzare una camera Neubauer. In caso contrario, aggiungere 40 mL di EGM e distribuirlo su 4 matracci freschi per colture cellulari T75.

2. Saggio di migrazione della ferita da graffio

NOTA: Il saggio di migrazione della ferita da graffio richiede una durata di 3 giorni per il completamento (Figura 1). Eseguire tutti i seguenti passaggi in condizioni di lavoro sterili (banco di lavoro sterile).

1. Placcatura e fame delle cellule (giorno 1)
   1. Utilizzando una piastra specializzata da 96 pozzetti per l'imaging di cellule vive, seminare 20.000 HUVEC in 100 μL di EGM per pozzetto. Lasciare riposare le cellule per 6 ore nell'incubatrice.
      NOTA: Si consiglia di ottimizzare il numero di cellule considerando la velocità variabile di crescita delle cellule endoteliali vascolari tra fornitori e laboratori. L'obiettivo è ottenere un monostrato perfetto il giorno successivo prima di iniziare lo scratch. I pozzetti sovrappopolati possono alterare il comportamento delle cellule endoteliali, ad esempio mediante l'inibizione del contatto¹⁶, mentre un monostrato incompleto ostacola drasticamente l'analisi.
   2. Affamare tutti i pozzetti durante la notte con 100 μL di EBM per pozzetto integrati con il 2% di FBS.
      NOTA: Fare attenzione a non danneggiare il monostrato cellulare, soprattutto quando si utilizza una pipetta multicanale.
2. Preparazione delle soluzioni di stimolazione (giorno 2)
   1. Diluire le sostanze desiderate e i controlli nel terreno basale di crescita delle cellule endoteliali (EBM) integrato con il 2% di FBS. Per ogni pozzetto, utilizzare 100 μL di soluzione.
      NOTA: L'EBM integrato con FBS al 2% funge da controllo negativo, mentre il fattore di crescita dell'endotelio vascolare umano ricombinante (VEGF) a 25 ng/mL può essere utilizzato come controllo positivo. Utilizzando piastre da 96 pozzetti, si raccomanda che gli esperimenti siano progettati con un minimo di repliche tecniche (4 pozzetti con condizioni identiche), anche se si suggerisce di utilizzarne 8 per ottenere risultati ottimali. Sforzarsi di ridurre al minimo i potenziali effetti dei bordi o degli angoli durante la pianificazione del layout.
3. Creazione del graffio (giorno 2)
   1. Controllare le cellule al microscopio per verificare un monostrato cellulare confluente e la vitalità cellulare. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in uno strumento per la creazione di avvolti a 96 pozzetti e generare il graffio premendo la leva del dispositivo. Sollevare con cautela il coperchio dell'utensile per la creazione di ferite prima di rilasciare la leva per evitare doppi graffi.
   2. Lavare tutti i pozzetti due volte utilizzando 200 μL di EBM per pozzetto integrati con il 2% di FBS. Confermare al microscopio che i detriti siano stati rimossi con successo.
4. Stimolazione cellulare (giorno 2)
   1. Aggiungere 100 μl delle soluzioni di stimolazione o di controllo preparate per pozzetto.
5. Imaging (giorno 2-3)
   1. Acquisisci le immagini una volta all'ora per un periodo massimo di 24 ore utilizzando un programma automatizzato fornito dal microscopio per l'imaging di cellule vive.
      NOTA: Per garantire una buona qualità dell'immagine, eseguire la scansione di ogni pozzetto subito dopo averlo trasferito nell'incubatore che ospita il sistema di imaging delle cellule vive. Un tempo di acclimatazione di 30 minuti nell'incubatrice aiuta a ottenere una migliore qualità dell'immagine. Il software del microscopio è programmato per acquisire un'immagine all'ora per ogni pozzetto sulla linea mediana del graffio definito.
6. In assenza di uno strumento per la creazione di ferite e di un termocamera per cellule vive, seguire i passaggi descritti di seguito.
   1. Utilizzare un puntale per pipetta in una piastra a 24 pozzetti per indurre un graffio. Scatta immagini con un classico microscopio per colture cellulari a intervalli specifici. A tale scopo, utilizzare un microscopio motorizzato dotato di precise capacità di inseguimento x e y. Ciò consente il posizionamento automatico, garantendo un'acquisizione coerente delle immagini in posizioni predefinite.
      NOTA: Quando è necessaria l'imaging manuale, è un'opzione praticabile eseguire l'imaging solo di T0 e di un punto temporale 'x' ore dopo il trattamento. Nel protocollo descritto utilizzando HUVEC, il punto temporale T12 (12 ore dopo la stimolazione) era un punto temporale attraente con una netta separazione tra controllo negativo e positivo stimolato dal VEGF. Tuttavia, si consiglia di eseguire esperimenti iniziali con imaging ogni 2 ore o 1 ora per determinare il punto temporale ottimale per le impostazioni sperimentali specifiche in ciascun laboratorio.
7. Analisi (giorno 3)
   1. Il software del microscopio per l'imaging di cellule vive può consentire l'analisi diretta delle immagini acquisite. Definisci le maschere che delineano il prato cellulare, il graffio iniziale e le regioni di densità relativa della ferita. Determinare i confini delle celle in base alle differenze di contrasto.
      NOTA: Per gli esperimenti eseguiti con HUVEC sono stati utilizzati una regolazione della segmentazione di 1,6, un file di fori di 500 μm², una dimensione regolata di 1 pixel, un'area >500 μm e un'eccentricità >0,6. È essenziale un controllo visivo approfondito dei parametri di rilevamento delle cellule rispetto alle immagini reali. Con configurazioni ottimizzate, il software calcola automaticamente la densità relativa delle ferite (RWD) nel tempo e genera grafici temporali corrispondenti con la deviazione standard (SD) delle repliche tecniche. Questi dati possono quindi essere utilizzati per l'analisi statistica.

3. Estrazione dell'RNA con cellule coltivate 2D

NOTA: Eseguire tutti i seguenti passaggi fino al passaggio 3.3 in condizioni di lavoro sterili (banco di lavoro sterile).

1. Celle di placcatura (giorno 1)
   1. Staccare gli HUVEC secondo il passaggio 1.2 del protocollo di coltura cellulare HUVES.
   2. Seminare 50.000 cellule per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti con 2 mL di EGM per pozzetto.
   3. Cambiare il mezzo dopo 6 ore in EBM contenente il 2% di FBS (terreno affamato) per morire di fame durante la notte.
2. Trattamento delle cellule (giorno 2)
   1. Diluire gli agenti di interesse nell'EBM integrati con il 2% di FBS. Sostituire il terreno di ammortamento con la diluizione preparata e incubare le cellule per il tempo desiderato in un'incubatrice.
3. Estrazione dell'RNA (giorno 2-3)
   1. Lisi le cellule con 750 μl di Trizol per pozzetto e incubazione per 10 minuti su un agitatore orbitale.
   2. Risospendere i campioni con una pipetta da 1000 μL alcune volte e quindi conservarli in specifiche provette di RNA a basso legame (volume 1,5 mL). Conservare a -80 °C.

4. Immunocitochimica con cellule coltivate 2D

NOTA: Eseguire tutti i passaggi seguenti fino al passaggio 4.4 in condizioni di lavoro sterili (banco di lavoro sterile).

1. Preparazione dei vetrini coprioggetto
   1. Incubare 100 vetrini coprioggetti con un diametro di 12 mm in idrossido di potassio al 5% in metanolo in una provetta da 50 mL per 30 minuti agitando la soluzione applicata.
      NOTA: Questo è un passaggio molto importante per deprototonare la superficie dei vetrini coprioggetti e migliorare le condizioni per il rivestimento e la coltura. A questo punto, si consiglia vivamente di assicurarsi che i vetrini coprioggetti siano ben distribuiti all'interno del mezzo e non si secchino e si incollino insieme.
   2. Lavare i vetrini coprioggetti per 30 minuti 4 volte con acqua demineralizzata.
   3. Dopo il lavaggio, trasferirli in una soluzione isopropilica al 70% per la conservazione.
2. Rivestimento di vetrini coprioggetti
   1. Appoggiare i vetrini coprioggetti singolarmente contro la parete di una capsula di Petri quadrata per consentire l'evaporazione dell'alcol isopropilico.
   2. Dopo 5 minuti trasferire i vetrini coprioggetti in una piastra a 24 pozzetti (un vetrino coprioggetti per pozzetto). Applicare 1 mL di una soluzione di 10 mg/mL di collagene I in PBS su ciascun pozzetto e incubare per 60 minuti a 37 °C.
   3. Quindi, lavare i vetrini coprioggetti 4-5 volte per 5 minuti con PBS.
3. Coltivare le cellule
   1. Staccare gli HUVEC seguendo le procedure descritte nella fase 1.2 del protocollo di coltura cellulare HUVEC.
   2. Seminare 50.000 cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti con 2 mL di EGM per pozzetto.
   3. Dopo 6 ore, cambiare il terreno in EBM contenente il 2% di FBS per consentire alle cellule di attaccarsi al pozzetto e far morire di fame le cellule durante la notte.
   4. Il giorno successivo, gli agenti diluiti di interesse in EBM sono stati integrati con il 2% di FBS. Sostituire la soluzione affamata nei pozzetti con la diluizione preparata e incubare le cellule per il tempo desiderato in un incubatore.
4. Fissazione e bloccaggio
   1. Coltivare le cellule per il tempo desiderato, quindi lavare le cellule con PBS per 5 minuti.
   2. Fissare le cellule con paraformaldeide (PFA) al 2% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
   3. Lavare con PBS 3-4 volte per 5 min.
   4. Incubare i campioni con un tampone bloccante contenente il 5% di siero normale di capra (NGS) e lo 0,1% di Triton-X-100 in PBS per 1 ora a RT.
      NOTA: In questa fase, è importante lavare i campioni per garantire che il PFA venga rimosso completamente. Scegli la specie del siero in base all'origine dell'anticorpo secondario.
5. Macchiatura
   1. Incubare i campioni per una notte a 4 °C nel tampone bloccante con l'anticorpo primario.
   2. Il giorno successivo, per rimuovere eventuali anticorpi primari non legati, lavare i campioni 3-4 volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
   3. Successivamente, incubare i campioni per 1 ora a RT con il corrispondente anticorpo secondario e la falloidina-FITC, diluiti insieme nel tampone bloccante.
   4. Lavare altre 3-4 volte.
   5. Capovolgere i vetrini coprioggetti sui vetrini con una piccola goccia di mezzo di montaggio contenente DAPI, lasciare asciugare al buio e sigillare con smalto per unghie. Conservare i campioni al buio a 4 °C.

5. Saggio di germinazione degli sferoidi

NOTA: Il saggio di germinazione degli sferoidi richiede 3 giorni per il completamento (Figura 2). Eseguire tutti i passaggi seguenti fino al passaggio 5.7 in condizioni di lavoro sterili (banco di lavoro sterile).

1. Generazione di sferoidi in gocce sospese (giorno 1)
   1. Staccare gli HUVEC seguendo le procedure descritte nella fase 1.2 del protocollo di coltura cellulare HUVEC.
   2. Combinare 200.000 cellule con 8 mL di EGM e 2 mL di soluzione madre di methocel, garantendo una miscelazione accurata. Fare riferimento al File supplementare 1 per istruzioni sulla preparazione della soluzione madre di methocel.
   3. Erogare 25 μl di goccioline della soluzione sulla superficie interna capovolta di una grande piastra di Petri quadrata. Ruotare delicatamente il coperchio di 180° e posizionarlo sul fondo del recipiente per colture cellulari in modo che le goccioline siano appese. Posizionare il recipiente in un incubatore per colture cellulari durante la notte.
2. Preparare il gel di collagene (giorno 2)
   1. Mescolare accuratamente 2,3 mL di collagene di coda di ratto di tipo I con 0,280 mL di 10x Medium 199 fino a quando la miscela raggiunge una tonalità gialla uniforme. Mantieni questa miscela sul ghiaccio durante l'intero processo.
3. Titola il gel di collagene (giorno 2)
   1. Titolare la miscela fino a raggiungere un pH fisiologico, indicato da un colore arancione, utilizzando NaOH (2 N).
   2. Aggiungere 50 μl di tampone HEPES al prodotto finale.
      NOTA: Per garantire un intervallo dinamico ottimale per il saggio, è imperativo avvicinarsi il più possibile a un pH fisiologico. Vari lotti di collagene possono richiedere diverse quantità di NaOH. Mantenere il composto rigorosamente in ghiaccio durante tutto il processo e mescolato in modo omogeneo per tutto il tempo.
4. Raccolta degli sferoidi (giorno 2)
   1. Sciacquare le gocce pendenti dai coperchi delle colture cellulari con 20 ml di PBS.
   2. Centrifugare la soluzione per 7 minuti a 250 x g. Eliminare il surnatante e risospendere gli sferoidi in 0,1 mL di FBS e 0,4 mL di EGM picchiettando delicatamente la provetta.
   3. Aggiungere 2 mL di soluzione madre di methocel e mescolare accuratamente. Utilizzare una pipetta con una capacità minima di 5 mL per evitare di danneggiare gli sferoidi.
5. Aggiunta di sferoidi alla matrice di collagene 3D (giorno 2)
   1. Aggiungere 2 ml della miscela di collagene preparata agli sferoidi risospesi e mescolare accuratamente.
   2. Erogare 0,5 mL della miscela risultante nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e incubare in un incubatore cellulare per 30 minuti.
6. Stimolazione degli sferoidi in una matrice di collagene 3D (giorno 2)
   1. Preparare una diluizione delle sostanze desiderate in EBM. Per ogni pozzetto, utilizzare 100 μL di soluzione.
      NOTA: L'EBM funge da controllo negativo, mentre il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) a 25 ng/mL (concentrazione finale in 500 μL di matrice di collagene e 100 μL di strato EBM) può essere utilizzato come controllo positivo.
   2. Incubare per il tempo desiderato.
      NOTA: In un test standard, si consigliano 18-24 ore, ma i tempi devono essere attentamente ottimizzati in ogni laboratorio.
7. Imaging degli sferoidi (giorno 3)
   1. Utilizza un microscopio invertito e una piattaforma di imaging per acquisire immagini di tutti gli sferoidi che non sono a contatto con il bordo del pozzo, tra loro o che mostrano segni di danneggiamento. Mantieni impostazioni e livelli di zoom coerenti in tutte le condizioni.
8. Analisi (giorno 3)
   1. Utilizza lo strumento di misurazione in ImageJ Fiji per accertare la lunghezza di tutti i germogli da ogni sferoide in ogni immagine.
      NOTA: Utilizzare il plug-in fornito nel file supplementare 2, che rende l'analisi più efficiente e genera un file di .txt di output.
   2. Importa i dati in un foglio di calcolo, R o qualsiasi altro software preferito e utilizza la lunghezza cumulativa media di tutti i germogli per sferoide come lettura per ogni condizione.
      NOTA: I risultati di gel diversi non possono essere combinati sotto forma di lunghezze assolute di germinazione. I dati di ciascun gruppo di trattamento devono essere normalizzati al gruppo di controllo EBM o VEGF (lunghezza relativa della germinazione) prima che i dati possano essere uniti.

6. Estrazione dell'RNA con cellule coltivate in 3D

1. Saggio di germinazione degli sferoidi
   1. Eseguire il test di germinazione degli sferoidi come descritto nella sezione 5.
2. Lisi del gel di collagene
   1. Lavare i gel sferoidi con PBS caldo per 5 minuti.
   2. Tagliare i gel di sferoidi in quarti e trasferire tutti e 4 i quarti in una provetta da 50 ml. Utilizzare un bisturi per la dissezione meccanica dei gel.
   3. Trattare i campioni di gel con una soluzione di lisi (contenente 2 mg/mL di collagenasi D in PBS) e incubare per 45 minuti a 37 °C su un agitatore.
   4. Lavare delicatamente i gel con PBS integrato da 2 mM di EDTA per arrestare la reazione del tampone di lisi.
3. Estrazione dell'RNA
   1. Risospendere i gel lisati in 750 μL di Trizol e incubare per 10 minuti per garantire un'estrazione sufficiente dell'RNA come descritto al punto 3.3.
   2. Risospendere i campioni con una pipetta da 1000 μL alcune volte e trasferire i campioni in specifiche provette di RNA a basso legame (volume 1,5 mL). Conservare i campioni a -80 °C.

7. Immunocitochimica di sferoidi in una matrice di collagene 3D

1. Saggio di germinazione degli sferoidi
   1. Eseguire il test di germinazione degli sferoidi come descritto nella sezione 5.
2. Fissazione e bloccaggio
   1. Fissare i gel con il 4% di PFA in PBS per 1 ora.
      NOTA: Per garantire una buona fissazione delle cellule nel gel, i gel devono essere staccati con cura sui lati dei pozzetti con un bisturi e una pinzetta dopo il risciacquo con PBS.
   2. Lavare delicatamente i gel 3-4 volte con PBS, quindi staccarli completamente dalla superficie dei pozzetti e trasferirli in nuove piastre da 24 pozzetti.
   3. Incubare i gel per 1 ora a RT con la soluzione bloccante (contenente il 5% di NGS e lo 0,1% di Triton-X-100 in PBS) su un agitatore orbitale.
3. Macchiatura
   1. Incubare i campioni per una notte a 4 °C su un agitatore orbitale con l'anticorpo primario diluito in tampone bloccante.
      NOTA: La rotazione dei gel durante questa incubazione non ha migliorato la qualità della colorazione.
   2. Il giorno successivo, lavare delicatamente i gel 4-5 volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
   3. Incubare l'anticorpo secondario corrispondente, diluito con falloidina-FITC in tampone bloccante per una notte a 4 °C su un agitatore orbitale.
   4. Eseguire 4-5 fasi di lavaggio aggiuntive con PBS.
   5. Trasferire i gel sui vetrini del microscopio e montarli con due gocce di terreno di montaggio contenente DAPI su un vetrino coprioggetti posizionato su ciascun gel. Lasciare asciugare i campioni prima di sigillarli con lo smalto per unghie e conservarli al buio a 4 °C.
4. Microscopia
   1. Visualizzare tutti i campioni su un microscopio confocale. Usa l'obiettivo 20x e concentrati sulla regione di interesse. Acquisisci immagini come Z-stack, nonché immagini del singolo piano focale.
      NOTA: L'acquisizione di immagini Z-stack e del piano focale in più sezioni del campione 3D è essenziale per acquisire la rappresentazione completa, soprattutto per campioni 3D spessi.

8. Cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMVECs)

NOTA: Tutti i passaggi descritti possono essere eseguiti anche con cellule endoteliali microvascolari, ad esempio cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMVECs). In tal caso, il terreno deve essere sostituito con uno specifico terreno di coltura di cellule endoteliali microvascolari contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) per la coltivazione, nonché fasi specifiche in ciascun test. Le differenze specifiche dell'HRMVEC rispetto ai protocolli di analisi sono descritte di seguito:

1. Saggio della ferita da graffio
   1. Coltivare le cellule in un terreno di cellule endoteliali microvascolari FBS al 10% invece di EGM.
   2. Semina 20.000 cellule/pozzo.
   3. Non affamare le cellule durante la notte.
   4. Dopo aver eseguito il graffio, cambiare il terreno con un terreno di cellule endoteliali basali contenente il 5% di FBS invece di EBM con il 2% di FBS.
2. Immunocitochimica di HRMVEC coltivate 2D
   1. Coltivare le cellule in un terreno di coltura endoteliale microvascolare al 10% invece che in EGM.
   2. Non affamare le cellule durante la notte.
   3. Cambiare il mezzo subito prima del trattamento in EBM + 5% FBS invece di EBM + 2% FBS.
3. Saggio di germinazione degli sferoidi
   1. Seminare le cellule sotto forma di gocce pendenti con un terreno di coltura endoteliale microvascolare contenente il 10% di FBS invece di EGM.
4. Immunocitochimica di sferoidi in una matrice di collagene 3D
   1. Seminare le cellule sotto forma di gocce pendenti con un terreno di coltura endoteliale microvascolare contenente il 10% di FBS invece di EGM.

Risultati

Per il saggio di migrazione, è fondamentale esaminare a fondo le immagini acquisite al punto temporale t = 0 h per garantire che la presenza di un monostrato cellulare completamente formato sia rilevata con precisione dal sistema (Figura 1B). Inoltre, la chiarezza e la rettilineità del bordo del graffio dovrebbero essere confermate (Figura 1B). L'area priva di celle dovrebbe essere in gran parte priva di detriti. Al termine del test, un gruppo stimolato con, ad esempio, 25 ng/mL di VEGF come controllo positivo dovrebbe mostrare una migrazione riuscita nell'area originale graffiata (Figura 1B). Un esempio di problemi tecnici potrebbe manifestarsi come una crescita cellulare irregolare, un doppio graffio o un'ondulazione nei bordi del graffio (Figura 1C). Inoltre, è importante stabilire un intervallo dinamico sostanziale tra il controllo negativo (campioni stimolati con EBM) e il controllo positivo (campioni VEGF) (Figura 1D). Nella nostra configurazione sperimentale, consideriamo un aumento del 25% della RWD dopo 12 ore come intervallo ottimale (Figura 1D). In un test tecnico problematico, i controlli positivi e negativi non si separano correttamente, indicando un intervallo dinamico basso (Figura 1E).

Colorazione immunocitochimica di HUVEC su vetrini, visualizzati al microscopio a fluorescenza per convalidare la corretta colorazione (Figura 1F). È importante esaminare la maggior parte delle celle e identificare una regione caratteristica del vetrino. La specificità della colorazione viene valutata utilizzando un vetrino di controllo trattato solo con un anticorpo secondario per escludere il legame aspecifico (Figura 1F). I segnali di colorazione specifici devono essere esaminati criticamente in base alla localizzazione subcellulare nota della proteina bersaglio. Utilizziamo i pattern di localizzazione subcellulare insieme all'assenza di segnale nel campione di controllo come indici di un protocollo di immunocolorazione di successo.

Allo stesso modo, alcuni aspetti devono essere considerati per i saggi di germinazione degli sferoidi di alta qualità. In questo caso, la qualità dovrebbe essere valutata alla fine del saggio, ad esempio a t = 24 ore. La matrice di collagene osservata al microscopio deve mostrare omogeneità e non deve apparire friabile o ruvida (Figura 2B). Gli sferoidi stimolati con solo il terreno basale come controllo negativo e 25 ng/mL di VEGF come controllo positivo dovrebbero essere chiaramente distinguibili (Figura 2B). Inoltre, gli sferoidi dovrebbero galleggiare nel gel e non cadere a terra, dove si disperdono, indicando una bassa qualità (Figura 2C). Questo problema deriva spesso da un raffreddamento inadeguato del collagene durante la titolazione della miscela o da una titolazione eccessiva o insufficiente del pH (Figura 2C). Per ogni pozzetto dovrebbe essere possibile visualizzare un minimo di 10 sferoidi per pozzetto. Il controllo negativo (campioni stimolati con EBM) dovrebbe dimostrare un moderato tasso di germinazione basale, mentre il VEGF, che funge da controllo positivo, idealmente raddoppia o, preferibilmente, triplica l'RSL rispetto ai controlli (Figura 2D, grafico a sinistra). Anche il numero di germogli dovrebbe mostrare un intervallo dinamico simile (Figura 2D, grafico a destra). Un test tecnico non ottimale non mostrerà questo intervallo dinamico tra i controlli e potrebbe, quindi, portare a una falsa interpretazione dei dati (Figura 2E).

Le colorazioni analoghe a 2D, l'esame dei vetrini al microscopio a fluorescenza e la valutazione critica delle strutture colorate sono di grande importanza per il successo della colorazione (Figura 2F). Se la localizzazione cellulare delle strutture e l'intensità del segnale rispetto al controllo sono comprensibili, si può presumere che la colorazione abbia avuto successo.

Figura 1: Il saggio di migrazione della ferita da graffio con imaging di cellule vive. (A) Schema del saggio di migrazione della ferita da graffio. (B) Immagini che mostrano una replica tecnica di alta qualità a t = 0 h e t = 12 h. Le cellule sono state stimolate con 25 ng/mL di VEGF per fungere da controllo positivo. (C) Esempi di due repliche tecniche di bassa qualità a t = 0 h dovute a graffi impropri o doppi graffi. (D) Risultati di un test di migrazione della ferita da graffio riuscito. La corretta separazione del controllo positivo stimolato con 25 ng/mL di VEGF e del controllo negativo appena trattato con terreno basale è stata ulteriormente visualizzata mediante un diagramma a violino a t = 12 h. I dati includono 7-8 repliche tecniche per gruppo. (E) Risultati esemplari che evidenziano un test di migrazione della ferita da graffio fallito. La separazione non ottimale del controllo positivo stimolato con 25 ng/mL di VEGF e del controllo negativo appena trattato con terreno basale è stata visualizzata mediante un diagramma a violino a t = 12 h. I dati includono 7-8 repliche tecniche per gruppo. (F) Immagini esemplari di HUVEC seminate su vetrini coprioggetti e colorate per DAPI, falloidina e VEGF-R2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Il saggio di germinazione degli sferoidi. (A) Schema del saggio di germinazione degli sferoidi. (B) Immagini che mostrano il controllo negativo (sferoidi stimolati con mezzo basale) e il controllo positivo (sferoidi stimolati con VEGF 25 ng/mL) di un test tecnico ideale alla fine a t = 24 h. (C) Esempi di due sferoidi di bassa qualità a t = 24 h. Le immagini a sinistra mostrano uno sferoide danneggiato che è caduto sul fondo della lastra, il che si traduce in un corpo sferoidale allentato e in un tasso di germinazione anormalmente aumentato. L'immagine a destra visualizza il collagene con macchie di colore evidenti, creando un ambiente altamente eterogeneo che compromette significativamente la qualità del test. (D) Analisi dell'RSL (grafico a sinistra) e del numero di germogli (grafico a destra) di un saggio riuscito con un buon intervallo dinamico tra controllo negativo e positivo. I dati vengono visualizzati utilizzando un grafico a violino e includono 10-25 sferoidi per gruppo. (E) Analisi della RSL (grafico a sinistra) e del numero di germogli (grafico a destra) di un test tecnico problematico con un intervallo dinamico non ottimale tra controllo negativo e positivo. I dati vengono visualizzati utilizzando un grafico a violino e includono 10-25 sferoidi per gruppo. (F) Immagini esemplari di HUVEC dal saggio di germinazione degli sferoidi colorati per DAPI, falloidina e VEGF-R2.c

File supplementare 1: Istruzioni per la preparazione della soluzione madre di methocel. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: plug-in SpheroidCount.ijm. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

In questo rapporto, abbiamo presentato una gamma di tecniche con letture funzionali e molecolari per studiare l'angiogenesi in vitro.

Il saggio di migrazione rappresenta una tecnica consolidata utilizzata in tutti i campi del lavoro di laboratorio umido. Abbiamo scelto l'approccio di imaging di cellule vive disponibile in commercio per sfruttare il formato a 96 pozzetti adatto per esperimenti di screening e dose-risposta, la dimensione standardizzata e riproducibile della ferita creata dallo strumento WoundMaker, l'opportunità di osservare la cinetica di migrazione attraverso l'imaging time-lapse per un massimo di 24 ore e il software di quantificazione automatizzata delle immagini. Tuttavia, è necessaria la presenza di un sistema di imaging delle cellule vitali dotato di software di analisi dell'angiogenesi in laboratorio o in una struttura di base. Sono state stabilite numerose configurazioni sperimentali alternative che non richiedono microscopi specifici per l'imaging di cellule vive o altre attrezzature speciali¹⁰.

Sulla base della nostra esperienza, è fondamentale ottimizzare le impostazioni dell'analizzatore, poiché gli HUVEC e altri tipi di cellule endoteliali vascolari possono tendere a fornire uno scarso contrasto, ostacolando così la lettura automatica da parte del software del microscopio. Per risolvere questo problema, è possibile introdurre un'ulteriore fase di colorazione a fluorescenza (ad esempio, colorazione di cellule vive). I sistemi di imaging di cellule vive supportano tale colorazione e persino la colorazione multicolore per tracciare una proteina di interesse. Uno dei principali limiti del test è che la differenziazione tra migrazione cellulare e proliferazione non è sempre semplice e che i risultati del test rappresentano una combinazione di entrambi i processi. La soluzione di imaging di cellule vive utilizzata in questo studio cerca di affrontare questo problema introducendo la densità relativa della ferita (RWD). A differenza della confluenza tradizionalmente utilizzata nell'area graffiata, l'RWD valuta la confluenza all'interno dell'area graffiata rispetto all'area graffiata esterna. La migrazione nell'area graffiata eleva la RWD aumentando la confluenza al suo interno e contemporaneamente riducendo la confluenza al di fuori dell'area graffiata a causa della migrazione cellulare. Al contrario, la proliferazione cellulare aumenta anche la confluenza al di fuori dell'area graffiata, diminuendo così la RWD. È importante riconoscere che questo è un approccio di analisi strategica che riduce l'impatto della proliferazione sulla lettura finale. Per affrontare questo problema potrebbero essere necessari saggi di proliferazione complementari. In alternativa, è possibile aggiungere al test inibitori del ciclo cellulare come la mitomicina C per bloccare la proliferazione. L'implementazione dei protocolli con questi inibitori deve essere attentamente ottimizzata in ogni laboratorio per ottenere l'effetto desiderato senza ridurre l'intervallo dinamico del test. Inoltre, aumentando la frequenza di scansione di ciascun pozzetto, questa configurazione offre un'opportunità facilmente implementabile per tracciare con precisione le cellule in movimento a livello individuale, se tale tracciamento dettagliato è di particolare interesse.

Mentre il saggio di migrazione per l'imaging di cellule vive dimostra il vantaggio della scalabilità e delle analisi automatizzate e imparziali, il nostro studio precedente ha evidenziato la capacità del saggio di germinazione degli sferoidi di catturare dettagli più complessi dell'angiogenesi. Ciò include aspetti fondamentali come la formazione di cellule di punta e gambo, l'interazione cellula-matrice e un interruttore glicolitico¹². Per garantire la riproducibilità del saggio, è necessario che un ricercatore abbia esperienza nella preparazione della matrice di collagene, poiché le variazioni di pH e temperatura durante questo processo possono influire sui risultati. Inoltre, l'analisi viene condotta manualmente. L'analisi delle immagini richiede quindi molto tempo e contiene il rischio di distorsioni. Un corretto mascheramento delle condizioni durante l'analisi è essenziale per prevenire l'introduzione di distorsioni. Per affrontare questa preoccupazione, abbiamo recentemente proposto un approccio basato su reti neurali per identificare e mitigare potenziali distorsioni nell'analisi dei saggi di germinazione, che può essere facilmente implementato¹⁷. In conclusione, l'approccio migliore per convalidare i risultati è combinare entrambi i saggi. Tuttavia, è fondamentale riconoscere che possono sorgere differenze a causa della natura distinta delle impostazioni 2D e^{3D 12}.

Poiché esiste un'ampia selezione di saggi di angiogenesi in vitro 2D e 3D, è importante considerare i vantaggi e gli svantaggi dei saggi presentati rispetto ad altri metodi. Il test scratch wound, ad esempio, si concentra sulla migrazione orizzontale 2D su un piatto di plastica, mentre il test della camera di Boyden caratterizza la migrazione verticale attraverso un inserto a rete con un chemioattrattivo nella "camera esterna". Basato sulla sua semplice configurazione e lettura, il saggio scratch wound consente esperimenti ad alta produttività, in particolare nel suo formato a 96 pozzetti, fornendo un'elevata riproducibilità e la possibilità di visualizzare l'esperimento e condurre un time-lapse. Sfortunatamente, gli svantaggi del test della ferita da graffio sono la difficoltà nel distinguere tra proliferazione e migrazione, la necessità di cellule aderenti e, in assenza di uno strumento per la creazione di ferite, una maggiore variabilità dovuta a graffi disuguali. La lettura del Boyden Chamber Assay ha il vantaggio di misurare l'effetto chemiotattico delle sostanze solubili sulle cellule mobili¹⁸ e di evidenziare sia l'invasione che la migrazione. Purtroppo, gli svantaggi sono la scarsa riproducibilità e l'elevata varianza del saggio, l'incapacità di visualizzare il movimento delle cellule, l'elevato numero di cellule migrate necessarie per ottenere un segnale, l'impostazione e la lettura piuttosto lunghe ed elaborate, nonché la mancanza dell'opportunità di un'impostazione time-lapse¹⁹.

Il saggio di germinazione degli sferoidi quantifica la germinazione delle cellule endoteliali in una matrice di gel 3D, mentre il saggio di formazione del tubo caratterizza la formazione di tubi cellulari sulla superficie di una matrice di gel²⁰. Il saggio di germinazione ha il vantaggio di caratterizzare l'invasione di cellule in una matrice, nonché la proliferazione e la migrazione. Gli svantaggi sono la maggiore varianza del gel di collagene titolato e, in base a ciò, la qualità degli sferoidi. Il vantaggio del saggio di formazione del tubo è la formazione di tubi vascolari dopo un determinato periodo di tempo (a seconda della citochina) e un approccio semplice. Gli svantaggi sono la mancanza di invasione delle cellule e l'effetto del Matrigel stesso sulla formazione del tubo²¹.

Tutti gli esperimenti presentati sono stati eseguiti con HUVECs. È noto che esistono differenze significative nel comportamento delle cellule endoteliali vascolari di diversa origine (ad esempio, macro-vascolari vs. micro-vascolari)^22,23. Potrebbe quindi essere necessario convalidare i risultati sperimentali con altre linee cellulari endoteliali vascolari. Le impostazioni sperimentali erano trasferibili per l'endotelio microvascolare retinico umano (HRMVECS), tranne per il fatto che le HRMVEC richiedono concentrazioni di FBS più elevate. D'altra parte, la linea cellulare endoteliale dell'aorta bovina (BAEC) comunemente usata non potrebbe essere utilizzata nel saggio di germinazione degli sferoidi a causa di un'eccessiva velocità di germinazione basale.

Entrambi i saggi presentati condividono il limite di essere confinati a un singolo tipo di cellula. Dato che l'angiogenesi in vivo è un intricato processo multicellulare, questo aspetto cruciale non viene catturato con precisione da nessuno dei due test. Sono state sviluppate variazioni di co-coltura per entrambi i saggi, con particolare attenzione al saggio di germinazione degli sferoidi, e recentemente discusse^10,24. In alternativa, la convalida dei dati direttamente in modelli di angiogenesi in vivo pertinenti rappresenta un'opzione praticabile. I test consolidati a questo scopo includono il modello murino per la retinopatia indotta da ossigeno (OIR)²⁵, il modello²⁶ di neovascolarizzazione coroideale indotta da laser (Laser-CNV) e il test plug²⁷.

Nel complesso, sia il saggio di migrazione 2D su cellule vive che il saggio 3D di germinazione degli sferoidi, in combinazione con gli strumenti di analisi molecolare presentati, offrono una solida piattaforma per la ricerca sull'angiogenesi e sono ampiamente riconosciuti all'interno della comunità dell'angiogenesi. La combinazione di questi saggi con successive analisi in vivo per convalidare i risultati fornisce una solida base per lo studio di specifiche domande relative all'angiogenesi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
Alexa Fluor 647-coniugato AffiniPure F(ab)' 2-Frammento	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagene di tipo 1 coda di ratto	Corning	354236
Collagenasi D	Roche
Terreno basale a cellule endoteliali	Lonza	CC-3156	EBM
Terreno di crescita delle cellule endoteliali	Lonza	CC-3162	EGM
Acido etilendiamminotetraacetico	Serva	11290.02	EDTA
Siero fetale bovino	Bio& VENDI	S 0615	FBS
Cellule endoteliali della vena ombelicale umana, piastre a	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock	Sartorius	4379
Incucyte S3	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Terreno di coltura endoteliale microvascolare con il 10% di FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Isotiocianato di falloidina-fluoresceina marcato (0,5 mg/mL di metanolo)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Soluzione salina tamponata con fosfato	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Sistemi cellulari	cellule endoteliali microvascolari retiniche umane primarie	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant con NucBlue	Invitrogen di ThermoFisher Scientific	2260939
Reagente	per lisi QIAzolQIAGEN	79306
fattore di crescita endoteliale vascolare umano ricombinante	PeproTech	100-20	VEGF
Piastra di Petri quadrata	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Tripsina	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonale)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493