Questo protocollo presenta un metodo rapido e non letale per l'approvvigionamento di ghiandole paratiroidi dai maiali. La procedura consiste in tre fasi principali: preparazione suina con anestesia, recupero unilaterale del timo e identificazione ed estrazione ex vivo della ghiandola paratiroidea intratimica.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Approvvigionamento di ghiandole paratiroidi da suini donatori viventi e identificazione ex vivo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ipoparatiroidismo, spesso derivante da complicanze chirurgiche, interrompe gravemente l'omeostasi del calcio, portando a sintomi invalidanti. I trattamenti attuali offrono un sollievo limitato, evidenziando la necessità di terapie alternative come il trapianto di paratiroidi. Questo studio introduce un metodo semplice per l'approvvigionamento di paratiroidi da donatore vivente da suini, con potenziali applicazioni nella ricerca sui trapianti, in particolare per il campo dello xenotrapianto. La procedura prevede tre passaggi chiave: preparazione suina con anestesia, recupero unilaterale del timo e identificazione ed estrazione ex vivo della ghiandola paratiroidea intratimica. Il protocollo utilizza suini Landrace, con procedure che garantiscono un trattamento etico e il recupero post-operatorio. Abbiamo estratto con successo le ghiandole paratiroidi, confermandone la vitalità e l'integrità attraverso successive analisi. I livelli di PTH nel surnatante tissutale superavano i 1.000 pg/mL e la colorazione in immunofluorescenza distingueva le ghiandole paratiroidi dal tessuto timico, convalidando l'affidabilità della procedura. Questo protocollo offre un metodo rapido, non letale ed eticamente valido per l'approvvigionamento delle ghiandole paratiroidi dai suini, affrontando le differenze anatomiche tra suini e esseri umani. Offre un approccio sostenibile con implicazioni significative per la ricerca sull'ipoparatiroidismo e lo xenotrapianto.
Introduzione
Questo protocollo presenta un metodo rapido e non letale per l'approvvigionamento delle ghiandole paratiroidi dai suini. L'ipoparatiroidismo, caratterizzato da un'insufficiente secrezione di paratormoni, interrompe in modo critico l'omeostasi del calcio1. Questa condizione, prevalentemente una complicanza chirurgica dopo paratiroidectomia o tiroidectomia, si manifesta con sintomi come astenia, dolore cronico, tachicardia, convulsioni e persino malattia renale allo stadioterminale2. Occasionalmente, deriva da rare malattie autoimmuni o genetiche. I trattamenti attuali, principalmente l'integrazione orale di calcio e vitamina D o il paratormone ricombinante, forniscono solo un sollievo parziale dai sintomi sistemici come affaticamento e depressione 3,4. La crescente necessità dell'allotrapianto di paratiroidi come potenziale rimedio per l'ipoparatiroidismo grave sottolinea la necessità di stabilire protocolli di trapianto uniformi 5,6,7,8,9. Tuttavia, gli studi preclinici sul trapianto di paratiroidi rimangono limitati e mancano modelli animali standardizzati. Inoltre, il recente aumento nel campo degli xenotrapianti10,11, aumenta l'interesse per le applicazioni cliniche degli xenotrapianti, in particolare nel campo della terapia cellulare endocrina12,13. Tuttavia, i modelli suini di xenotrapianto di paratiroidi sono impegnativi a causa della complessità dell'identificazione del tessuto paratiroideo nei suini. C'è, quindi, la necessità di fornire una tecnica riproducibile, sostenibile ed etica per recuperare le ghiandole paratiroidi dai maiali per sviluppare ulteriormente lo xenotrapianto di paratiroidi.
A differenza degli esseri umani, che in genere hanno quattro ghiandole paratiroidi situate dietro la tiroide, i maiali possiedono, per la maggior parte, due ghiandole paratiroidi, ciascuna situata nella parte cranica del timo. Studi precedenti che miravano a localizzare le ghiandole paratiroidi nei suini si basavano su metodi letali per l'identificazione ex vivo o su tecniche basate su fluorofori, che possono essere difficili da implementare nello xenotrapianto 14,15,16. Proponiamo qui una tecnica semplice e non letale, adatta allo xenotrapianto, basata su due passaggi chiave: il recupero del timo suino e l'identificazione ex vivodella ghiandola paratiroidea mediante transilluminazione. Questa tecnica potrebbe essere utile per la ricerca sulla fisiologia delle paratiroidi, così come per i trapianti.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal comitato etico animale dell'Università di Lille (riferimento #20491-20190219161313).
1. Anestesia suina
- Somministrare buprenorfina (0,015 mg/kg, per via intramuscolare) 30 minuti prima della prima incisione per fornire analgesia preoperatoria.
- Eseguire un'iniezione intramuscolare di ketamina (50 mg/kg) e xilazina (3 mg/kg) per indurre la sedazione. Somministrare isoflurano al 5% per inalazione per 3-5 minuti per approfondire l'anestesia.
- Valutare la profondità dell'anestesia controllando il riflesso di chiusura delle palpebre e il riflesso di deglutizione. Intubare il maiale e posizionarlo supino sul tavolo operatorio. Ridurre la concentrazione di isoflurano al 2% tramite inalazione per il mantenimento dell'anestesia.
- Monitora continuamente la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno utilizzando un monitor veterinario multiparametrico portatile per garantire una profondità anestetica ottimale e una stabilità fisiologica durante tutta la procedura.
2. Esposizione dell'area di interesse
- Radere e pulire meticolosamente la regione cervicale, che si estende dalla zona sottomandibolare allo sterno.
- Applicare sapone antisettico, seguito da clorexidina, per garantire un campo sterile. Asciugare accuratamente l'intera area.
- Posizionare teli sterili per isolare la regione cervicale anteriore per l'intervento chirurgico.
3. Esposizione al timo suino
- Eseguire un'incisione verticale di 10 cm lungo la linea cervicale bianca utilizzando un bisturi. Sezionare attentamente l'area con le forbici Metzenbaum per separare i muscoli pretiroidei, creando un campo chirurgico chiaro.
- Posizionare un divaricatore autobloccante tra il muscolo omoioideo e la cartilagine tiroidea per facilitare la dissezione del tessuto connettivo ed esporre il timo.
NOTA: Evitare una pressione eccessiva sulla trachea per evitare lesioni. - Esporre gradualmente la parte cranica del timo e separarla con cura dalla guaina carotidea, che contiene il nervo vago, la vena giugulare interna e l'arteria carotide comune.
NOTA: Per prevenire lesioni, utilizzare l'elettrocoagulazione per ottenere l'emostasi.
4. Recupero del timo suino
- Una volta rilasciato, estrarre la parte cranica del timo, che misura tipicamente 5 - 8 cm.
- Sciacquare il timo estratto in una soluzione salina isotonica per facilitare l'identificazione della ghiandola paratiroidea.
NOTA: Questo passaggio è fondamentale per migliorare la visualizzazione e la differenziazione della struttura distintiva della ghiandola paratiroidea
5. Identificazione della ghiandola paratiroidea intratimica ex vivo
- Appiattire delicatamente il tessuto timico per facilitare l'identificazione della ghiandola paratiroidea.
NOTA: La ghiandola paratiroidea mostra una consistenza distintiva, in particolare rispetto al tessuto circostante. La capsula fibrotica della ghiandola paratiroidea è più soda e di dimensioni simili a quelle di un pisello. - Utilizzare una fonte di luce per identificare la ghiandola paratiroidea tramite transilluminazione.
NOTA: Il sistema vascolare che circonda la ghiandola paratiroidea dovrebbe essere chiaramente visibile, favorendo la sua differenziazione. - Asportare con cura la capsula ed estrarre l'intera ghiandola paratiroidea. Utilizzo della pinza Debakey per una manipolazione delicata e delle forbici Metzenbaum per una dissezione precisa. Isolare la ghiandola dal tessuto timico circostante.
- Mettere la ghiandola paratiroidea isolata in una soluzione di conservazione a freddo e mantenerla a 4 °C per preservarne la vitalità per le procedure successive.
- Incorporare il tessuto nella paraffina per un'ulteriore elaborazione.
6. Chiusura chirurgica e risveglio
- Dopo il recupero della ghiandola paratiroidea, chiudere il sito chirurgico a strati. Sutura i muscoli e i tessuti sottocutanei utilizzando suture riassorbibili. Chiudere la pelle con punti di sutura non assorbibili.
- Svezzare gradualmente il maiale dall'anestesia. Dopo aver ripreso conoscenza, monitorare il maiale per eventuali complicazioni postoperatorie immediate.
- Somministrare analgesici e antibiotici come da protocollo postoperatorio (buprenorfina da 0,03 a 0,05 mg/kg e Clamoxyl 15 mg/kg per 48 ore). Riportare i suini nella loro struttura di stabulazione per il recupero sotto controllo veterinario.
7. Protocollo di immunocolorazione
- Eseguire la deparaffinazione e la disidratazione da campioni inclusi in paraffina: xilene per 5 minuti, xilene per 10 minuti, etanolo al 100% per 5 minuti, etanolo al 90% per 7 minuti e 30, etanolo al 70% per 7 minuti e 30 minuti, etanolo al 50% per 5 minuti, acqua distillata per 5 minuti e soluzione salina fosfato (PBS) per 5 minuti.
- Eseguire il recupero dell'antigene cuocendo i campioni nel microonde nel tampone citrato pH 6, a 650 W per 9 minuti. Lasciare raffreddare i campioni nel tampone per 20 minuti. Risciacquare tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna.
- Incubare i campioni, circondati con una penna Dako, a temperatura ambiente per 20 minuti con una soluzione di blocco proteico per bloccare il legame non specifico.
- Incubare i campioni per una notte a 4°C con l'anticorpo primario (PTH Antibody (H-7), IgG-α-umano di topo, sc-398856, 1:100 ) diluito in albumina sierica bovina all'1% (BSA). Lavare due volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
- Incubare per 1 ora e 30 minuti a temperatura ambiente con l'anticorpo secondario (Alexa Fluor 488, goat-α-Mouse, A11001, 1:500) diluito in albumina sierica bovina all'1%. Lavare due volte con PBS e una volta con acqua distillata per 5 min.
- Montare i vetrini con la soluzione DAPI e conservarli a 4 °C.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Gli esiti primari di questo studio includono l'estrazione riuscita delle ghiandole paratiroidi dai suini Landrace e la successiva analisi per confermarne la vitalità e l'integrità. I risultati sono riassunti come segue. L'identificazione del tessuto paratiroideo è stata confermata intraoperatoriamente tramite transilluminazione (Figura 1A). Dopo l'estrazione, sono stati raccolti due piccoli campioni di tessuto (circa il 10% ciascuno). Un campione è stato tritato in una piastra per p...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo protocollo presenta un metodo rapido e non letale per l'approvvigionamento delle ghiandole paratiroidi nei suini. Il passaggio chiave all'interno del protocollo prevede la localizzazione del timo suino per garantire il recupero completo per ulteriori indagini ex vivo . Una volta estratto il timo, la ghiandola paratiroidea può essere facilmente identificata utilizzando la transilluminazione.
Una delle principali sfide di questa tecnica è la nece...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ringraziamenti
Ringraziamo la Società Francese del Diabete e la Fondation pour la Recherche Médicale per il sostegno e il finanziamento della ricerca.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| 22G Catetere periferico corto | Smiths Medical | 5060 | |
| Basic set II, crepe | Hartmann | 9389253 | |
| Bupaq (bupré norphine) | Virbac | ||
| Clippers Favorita II | Aesculap Schermaschinen | GT104 | |
| Bisturi monouso | Swann-Morton | 0510 | |
| Spatola per elettrodi | Erbe | 21191-002 | |
| Generatore per elettrochirurgia BE VIO 200p | Erbe | 10140-400 | |
| Euroklav 23 VS+ | MELAG | 10056 | |
| Valvola per infusione a gravità a 3 vie con punta Luer Lock mobile | Care Fusion | A64-3V | |
| Impugnatura con due pulsanti per elettrodi Slim-Line | Erbe | 20190-065 | |
| Vaporizzatore a imbuto di isoflurano | Supera Anesthesia Innovations | VAP3000 | |
| Isorane (isoflurano) | Axience | ||
| Ketamidor (ké | Axience | ||
| Light Soffitto Doppio | RIMSA | PENTA81+30E | |
| Medisorb Anidride Carbonica Assorbente | Vyaire | 8570043 | |
| Mersutures 0 | Ethicon | F2520 | |
| Microtomo | LEICA RM2255 | ||
| Miller Blade | Opticlar | 600.020 | |
| Concentratore di Ossigeno | DeVilbiss | 525KS | |
| Paxman (xilazina) | Virbac | ||
| Monitor veterinario portatile multiparametrico | Mindray | IPM 10 | |
| Laringoscopio riutilizzabile Impugnature | Opticlar | 600.080 | |
| Ventilatore per anestesia per piccoli animali | Midmark | 91806001 | |
| Iniezione di cloruro di sodio Viaflo | Baxter | ||
| Strumenti chirurgici | Kohler medizintechnik | ||
| Tavolo chirurgico | Vetinox | TA700005 | |
| Tubo tracheale | Smiths Medical | 100/179/070 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | JV453 | |
| VMS | Midmark | 91800003 | |
| Materiali e reagenti | |||
| DMEM F-12 medio | ThermoFischer | 11320033 | |
| Anticorpo paratormone | SantaCruz | sc-398856 | |
| Saggio rapido intraoperatorio del pth | Beckman Coulter | A16972 |
Riferimenti
- Gafni, R. I., Collins, M. T. Hypoparathyroidism. N. Engl. J. Med. 380, 1738-1747 (2019).
- Gosmanova, E. O., Houillier, P., Rejnmark, L., Marelli, C., Bilezikian, J. P. Renal complications in patients with chronic hypoparathyroidism on conventional therapy: a systematic literature review: Renal disease in chronic hypoparathyroidism. Rev. Endocr. Metab. Disord. 22, 297-316 (2021).
- Frey, S., et al. Impact of permanent post-thyroidectomy hypoparathyroidism on self-evaluation of quality of life and voice: results from the national qol-hypopara study. Ann. Surg. 274, 851-858 (2021).
- Büttner, M., Krogh, D., Siggelkow, H., Singer, S. What are predictors of impaired quality of life in patients with hypoparathyroidism. Clin. Endocrinol. (Oxf). 97, 268-275 (2022).
- Gadelha, D. D., Filho, W. A., Brandão, M. A. J., Montenegro, R. M. Is parathyroid allotransplantation a viable option in the treatment of permanent hypoparathyroidism? A review of the literature. Endocrine. 80 (2), 253-265 (2022).
- Sakane, E. N., Vieira, M. C. C., Vieira, G. M. M., Maeda, S. S. Treatment options in hypoparathyroidism. Arch. Endocrinol. Metab. 66, 651-657 (2022).
- Zhang, J. L. H., Appelman-Dijkstra, N. M., Schepers, A. Parathyroid allotransplantation: A systematic review. Med. Sci. 10, 19(2022).
- Goncu, B., et al. Graft survival effect of HLA-A allele matching parathyroid allotransplantation. J. Investig. Med. Off. Publ. Am. Fed. Clin. Res. 69, 785-788 (2021).
- Barczyński, M., Gołkowski, F., Nawrot, I. Parathyroid transplantation in thyroid surgery. Gland Surg. 6, 530-536 (2017).
- Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. N. Engl. J. Med. 386, 1889-1898 (2022).
- Loupy, A., et al. Immune response after pig-to-human kidney xenotransplantation: a multimodal phenotyping study. The Lancet. 402, 1158-1169 (2023).
- Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Exp. Clin. Transplant. Off. J. Middle East Soc. Organ Transplant. 21, 901-912 (2023).
- Hasse, C., et al. Parathyroid xenotransplantation without immunosuppression in experimental hypoparathyroidism: long-term in vivo function following microencapsulation with a clinically suitable alginate. World J. Surg. 24, 1361-1366 (2000).
- Oster, M., et al. Fast and reliable dissection of porcine parathyroid glands - A protocol for molecular and histological analyses. Ann. Anat. - Anat. Anz. 219, 76-81 (2018).
- Hyun, H., et al. Structure-inherent targeting of near-infrared fluorophores for parathyroid and thyroid gland imaging. Nat. Med. 21, 192-197 (2015).
- Klute, K. Contribution to the topography and histology of porcine parathyroid glands. , Justus Liebig University of Giessen. Beitrag zur Topographie und Histologie der Epithelkörperchen des Schweines. Ph.D. thesis. Justus Liebig-Universität zu Giessen (1959).
- Arndt, H. On the topography of epithelial cells in pigs with special consideration of the suitability of pigs for the production of organo-therapeutic epithelial cell preparations. Z. Anat. 81, (Zur Topographie der Epithelkörperchen beim Schwein mitbesonderer Berücksichtigung der Eignung des Schweines für die Gewinnungorgano-therapeutischer Epithelkörperchenpräparate) 191-197 (1926).
- Butylina, M., Föger-Samwald, U., Gelles, K., Pietschmann, P., Sipos, W. Challenges in establishing animal models for studying osteoimmunology of hypoparathyroidism. Front. Vet. Sci. 10, 1163903(2023).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
