Consegna di nanoparticelle di un carico utile di oligonucleotidi in un modello animale multiforme di glioblastoma

Sommario

La barriera emato-encefalica è un ostacolo significativo nella somministrazione di terapie per il glioblastoma, una malattia per la quale non esiste una cura. Qui, riportiamo una nano piattaforma terapeutica di ossido di ferro guidata da immagini in vivo che può bypassare questa barriera fisiologica in virtù delle dimensioni e accumularsi nel tumore.

Abstract

Il glioblastoma multiforme (GBM) è la forma più comune e aggressiva di tumore maligno cerebrale primario per il quale non esiste una cura. La barriera emato-encefalica è un ostacolo significativo nella somministrazione di terapie al GBM. Qui è riportata una nanopiattaforma di somministrazione terapeutica guidata da immagini, basata sull'ossido di ferro, in grado di aggirare questa barriera fisiologica in virtù delle dimensioni e di accumularsi nella regione tumorale, trasportando il suo carico utile. Questa nanopiattaforma da 25 nm è costituita da nanoparticelle di ossido di ferro rivestite di destrano reticolato marcate con colorante fluorescente Cy5.5 e contenenti oligonucleotide antisenso come carico utile. Il nucleo magnetico di ossido di ferro consente il tracciamento delle nanoparticelle attraverso la risonanza magnetica in vivo , mentre il colorante Cy5.5 consente il tracciamento mediante imaging ottico. Questo rapporto descrive in dettaglio il monitoraggio dell'accumulo di questa piattaforma di nanoparticelle (denominata MN-anti-miR10b) nei tumori di glioblastoma impiantati ortotopicamente dopo iniezione endovenosa. Inoltre, fornisce informazioni sulla somministrazione in vivo di oligonucleotidi di RNA, un problema che ha ostacolato la traduzione delle terapie a RNA in clinica.

Introduzione

Il glioblastoma multiforme (GBM) è il più alto grado di astrocitoma per il quale non esiste praticamente alcuna cura. Ogni anno a circa 15.000 persone viene diagnosticato un glioblastoma, che ha una sopravvivenza mediana di circa 15 mesi e un tasso di sopravvivenza a 5 anni del 5%¹. Negli ultimi decenni, c'è stato un miglioramento marginale della prognosi nonostante i molteplici sforzi per far progredire le opzioni terapeutiche. L'attuale standard di cura per il GBM include la resezione chirurgica massima, quando possibile, seguita da radioterapia e chemioterapia². La temozolomide (TMZ), la chemioterapia di scelta, è stata l'ultima terapia per il glioblastoma che ha dimostrato una notevole efficacia clinica; tuttavia, almeno il 50% dei tumori GBM mostra resistenza a TMZ³. Nonostante questo rigoroso regime terapeutico, c'è ancora una significativa necessità clinica di migliorare la terapia del glioblastoma.

Lo sviluppo di terapie per il GBM e altre malattie cerebrali è significativamente ostacolato dalla natura selettiva della barriera emato-encefalica (BBB). La BBB è una barriera fisiologica composta da cellule endoteliali, periciti e estremità dei piedi degli astrociti, che crea la membrana semipermeabile tra il sistema circolatorio e il cervello, limitando il libero passaggio di molecole e cellule nel cervello⁴. Sebbene protettiva nella normale fisiologia e fondamentale per l'omeostasi cerebrale, la BBB impedisce a molte terapie di raggiungere il cervello, complicando il trattamento del GBM. Gli sforzi per migliorare la somministrazione di terapie al GBM hanno portato allo sviluppo di veicoli di somministrazione basati su nanoparticelle, al miglioramento della somministrazione di farmaci a ultrasuoni focalizzati e alla somministrazione di farmaci mediata da recettori ^5,6.

Le nanoparticelle sono emerse come un mezzo promettente per lo sviluppo di terapie per una miriade di malattie, compresi i tumori. L'applicazione di nanoparticelle per scopi terapeutici e di imaging nel GBM è stata tentata utilizzando vari costrutti di nanoparticelle ^7,8. Con l'obiettivo di somministrare farmaci al GBM in combinazione con l'imaging in vivo della consegna, l'approccio proposto utilizza nanoparticelle magnetiche (MN) costituite da un nucleo di ossido di ferro e ricoperte da destrano per la stabilità. Le proprietà magnetiche di queste nanoparticelle consentono il loro rilevamento mediante risonanza magnetica (RM), mentre la semplice coniugazione chimica al rivestimento di destrano amminato consente la coniugazione di frazioni terapeutiche come molecole di RNA, frazioni mirate aggiuntive o frazioni di imaging (come il colorante ottico nel vicino infrarosso Cy5.5)^9,10. Oltre alle capacità di imaging, la nano piattaforma è in grado di prolungare l'emivita delle terapie a RNA proteggendo l'oligonucleotide dalle nucleasi endogene, migliorando la somministrazione terapeutica. Qui viene presentata l'applicazione di questa nano piattaforma per la somministrazione in vivo di oligonucleotidi terapeutici (denominati MN-anti-miR10b) al GBM, monitorata mediante imaging in vivo. In precedenza, la capacità di questa nano piattaforma di accumularsi è stata dimostrata nelle cellule GBM in vitro, causando una significativa perdita di vitalità delle cellule tumorali¹¹. Prima di eseguire studi terapeutici in vivo, è necessario dimostrare la somministrazione in vivo di questa nano piattaforma ai tumori GBM in modelli animali. Per raggiungere questo obiettivo, sono stati prodotti modelli animali ortotopici di GBM ed è stata eseguita la somministrazione endovenosa del costrutto seguita da imaging in vivo. Di seguito sono riportati i protocolli di questi studi che mostrano l'accumulo nella regione tumorale confermato dall'imaging in vivo e dalla microscopia ex vivo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Le femmine di topi nudi atimici sono stati acquistati da Jackson Labs (ceppo #007850) a 7 settimane di età e lasciati acclimatare per 1 settimana prima dell'intervento chirurgico di impianto. I topi pesavano circa 21-25 g al momento dell'impianto. Le cellule U251 che esprimono luciferasi lucciola sono state generate e fornite dalla dottoressa Ana deCarvalho¹².

1. Coltura cellulare e preparazione all'impianto

1. Colture di cellule di glioblastoma umano marcate con luciferasi, U251 nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco contenenti D-glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio e integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina a 37 °C con il 5% di CO₂.
2. Una volta che le cellule raggiungono il 70% di confluenza, tripsinizzare con tripsina/EDTA allo 0,25% per 1-2 minuti a 37 °C. Utilizzare 2-4 ml per un pallone T-75 o 4-6 ml per un pallone T-175.
3. Dopo che le cellule si sono staccate dal pallone, estinguere la reazione con un rapporto 2:1 di DMEM integrato e mescolare delicatamente mediante pipettaggio per dissociare le cellule in una sospensione a cellula singola. Trasferire le cellule in una provetta conica e pellettare le cellule mediante centrifugazione a 300 x g per 5 minuti.
4. Aspirare con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Contare le cellule con un emocitometro utilizzando la colorazione con blu di tripano per escludere le cellule morte e calcolare il numero totale di cellule vive. Pellettare nuovamente le celle, come descritto sopra.
5. Risospendere il pellet cellulare a una concentrazione di 1 x 10⁸ cellule/mL in PBS e conservare la sospensione cellulare su ghiaccio per l'impianto intracranico.

2. Impianto di tumore ortotopico a mano libera

NOTA: Questo protocollo è adattato da Irtenkauf et al. (la procedura della dottoressa Ana deCarvalho; Henry Ford Health Hermelin Brain Tumor Center)¹². Tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cabina di biosicurezza per garantire la sicurezza sia dei soggetti che dei ricercatori. Il metodo di impianto a mano libera consente una procedura più rapida per ottenere campioni di dimensioni maggiori mantenendo la qualità dell'impianto intracranico. In alternativa, è possibile utilizzare un dispositivo stereotassico per impiantare il tumore alle stesse coordinate descritte di seguito.

1. Pesare il topo nudo e atimico e somministrare una soluzione anestetica di ketamina/xilazina (100 mg/kg/10 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale con una siringa da 28 G. Posiziona il mouse in una gabbia di recupero sopra un termoforo per mantenere la temperatura corporea. Confermare l'anestesia controllando il riflesso del pedale.
2. Applicare unguento oftalmico per gli occhi, somministrare ketoprofene (5 mg/kg) per via sottocutanea con una siringa da 28 G e dare punzoni identificativi per l'orecchio.
3. Sterilizzare il sito chirurgico nella parte superiore della testa con etanolo al 70% seguito da scrub betadine e ripetere 3 volte. Quindi, praticare un'incisione di 5-7 mm con piccole forbici chirurgiche a destra della linea mediana della testa e ritrarre la pelle con una pinza fine per esporre il cranio e le linee di sutura del cranio.
4. Strofina il cranio con un batuffolo di cotone per rimuovere il periostio, consentendo l'accesso all'osso. Applicare una soluzione di perossido di idrogeno al 3% utilizzando un nuovo batuffolo di cotone per asciugare l'osso. Usando un nuovo batuffolo di cotone, rimuovere il perossido di idrogeno in eccesso e l'eventuale schiuma che potrebbe formarsi. Ripeti questo passaggio 3 volte fino a quando il bregma è visibile sul cranio e l'osso è sufficientemente asciutto per la perforazione. Un cranio sufficientemente asciutto avrà linee di sutura nettamente sbiancate e arrossamento ridotto rispetto all'aspetto iniziale.
5. Per quanto riguarda il bregma, misurare -2,5 mm mediale/laterale e -1 mm anteriore/posteriore con un righello e contrassegnare il sito di perforazione con un pennarello. Misurare di nuovo prima di forare per assicurarsi che il segno sia nella posizione corretta.
6. Prendi un trapano elettrico per microchirurgia (11.000 giri/min) con una fresa da 0,5 mm e fai con cura un foro nel cranio dove precedentemente segnato. Assorbire il sangue o il liquido che potrebbe accumularsi nel sito di perforazione con un batuffolo di cotone fresco.
7. Preparare una siringa da 33 G da microlitri dotata di un manicotto per aghi a una lunghezza dell'ago esposta di 3 mm. Aspirare 5 μL della sospensione di 1 x 10⁸ cellule/mL precedentemente preparata dopo averla brevemente ririsospesa con una pipetta e assicurarsi che non vi siano bolle nella soluzione iniettabile. Rimuovere accuratamente l'eccesso di sospensione cellulare rimasto all'esterno dell'ago e del manicotto dell'ago con un panno di isopropanolo al 70%.
8. Inserire l'ago verticalmente nel sito di perforazione fino a quando il manicotto dell'ago non interrompe l'ulteriore inserimento dell'ago. Ritrarre con cautela l'ago di circa 0,5 mm per creare spazio per l'accumulo delle cellule iniettate.
9. Iniettare lentamente la sospensione cellulare per un periodo di 1 minuto. Una volta iniettato l'intero volume, tenere l'ago in profondità per un ulteriore minuto per ridurre l'efflusso della soluzione iniettabile. Quindi, ritrarre l'ago con attenzione.
10. Con un batuffolo di cotone pulito, rimuovere il liquido che si accumula nel sito di iniezione e quindi applicare cera ossea per sigillare il foro.
11. Chiudere l'incisione con un adesivo veterinario e lasciarla asciugare. Con un batuffolo di cotone pulito, applicare la lidocaina topica come analgesico.
12. Monitorare il topo fino a quando non si riprende completamente e non è in ambulatorio. Somministrare ketoprofene (5 mg/kg) per via sottocutanea per 2 giorni dopo l'impianto per la gestione del dolore.

3. Sintesi di piattaforme di nanoparticelle

1. Sintetizzare e coniugare le nanoparticelle con Cy5.5 e oligonucleotide (anti-miR10b) come precedentemente descritto¹¹.

4. Somministrazione di MN-anti-miR10b

NOTA: In questo studio, le iniezioni sono state effettuate una volta alla settimana per 6 settimane a partire da 7 giorni dopo l'impianto, ma lo stesso protocollo può essere utilizzato per varie frequenze di iniezione.

1. Pesare il mouse e calcolare il volume di MN-anti-miR10b da somministrare al topo. Le dosi di MN-anti-miR10b sono somministrate a 20 mg Fe/kg nei modelli murini di GBM. Ad esempio, un topo di 20 g riceve un dosaggio di 80 μL di 5 mg Fe/mL di MN-anti-miR10b. I topi di controllo ricevono un volume uguale di PBS coerente con questo schema di dosaggio.
2. Preparare una siringa da 28 G con la dose di MN-anti-miR10b e assicurarsi che non ci siano bolle nella soluzione iniettabile.
3. Anestetizzare il topo con isoflurano al 2%-4% per induzione e 1,5%-2% per il mantenimento con una portata di 1,5 L/min in una scatola di induzione. Sposta il mouse su un cono nasale e continua a somministrare l'anestesia. Controllare la profondità dell'anestesia e applicare un unguento veterinario.
4. Sterilizzare la coda con una salvietta di isopropanolo al 70% e lasciare asciugare l'alcol in eccesso.
5. Ruota la coda per posizionare le vene caudali laterali nella parte superiore della coda. Quindi, mirando alla vena, inserire l'ago nella coda e stabilire il vuoto tirando indietro lo stantuffo.
6. Inserire l'ago fino a quando il sangue non entra nella siringa, indicando l'ingresso riuscito nella vena.
7. Iniettare lentamente MN-anti-miR10b e ritrarre l'ago dopo la consegna completa. Applicare pressione sul sito di iniezione con una garza fino a quando l'emorragia non si ferma.
8. Rimuovere il mouse dal cono. Monitorare il topo fino a quando non si riprende completamente e non è in ambulatorio.
   NOTA: La somministrazione in bolo di nanoparticelle può causare distress respiratorio. Monitorare attentamente il mouse e applicare immediatamente leggere compressioni toraciche se ci sono segni di distress respiratorio.

5. Imaging in vivo a bioluminescenza e fluorescenza

NOTA: L'imaging in vivo a bioluminescenza e fluorescenza viene condotto nel sistema di imaging in vivo (IVIS) prima e 24 ore dopo l'iniezione della nanoparticella.

1. Preparare la D-luciferina filtrata sterile a una concentrazione di 30 mg/mL in PBS senza Mg²⁺ e Ca²⁺.
2. Aprire il software operativo IVIS e avviare l'inizializzazione per preparare la macchina. Durante l'inizializzazione del sistema, selezionare una cartella per salvare le immagini selezionando Acquisizione > Salvataggio automatico in e definire la cartella per i file da salvare.
3. Al momento dell'imaging, pesare il topo e calcolare il volume di D-luciferina da somministrare per un dosaggio di 150 mg/kg. Preparare una siringa da 28G con il volume, proteggendo la soluzione dalla luce diretta. Questo studio ha incluso l'imaging 2 giorni dopo l'intervento chirurgico di impianto per confermare la semina e l'imaging settimanale iniziato il giorno 7 dopo l'impianto, immediatamente prima dei trattamenti settimanali.
4. Anestetizzare il topo con isoflurano al 2%-4% per induzione e 1,5%-2% per il mantenimento con una portata di 1,5 L/min in una camera di induzione. Una volta anestetizzato, strofinare delicatamente il topo per evitare di ferire ulteriormente il sito chirurgico e iniettare la dose di D-luciferina per via intraperitoneale. Lasciare che il mouse si riprenda e attendere 10 minuti prima dell'imaging per consentire al segnale di bioluminescenza di svilupparsi e stabilizzarsi.
5. Mentre il segnale di bioluminescenza si sviluppa, preparare lo scanner IVIS per l'imaging a bioluminescenza. Posizionare il tappetino nero a bassa fluorescenza sul tavolino di imaging e configurare l'array di coni del naso per il numero di soggetti da riprendere.
6. Nel software, fare clic su Creazione guidata immagini. Selezionare Imaging a bioluminescenza , quindi selezionare Apri filtro. Nella schermata successiva, selezionare Soggetto immagine e campo visivo. L'IVIS è ora pronto per l'imaging a bioluminescenza.
7. A 3 minuti prima dell'imaging, iniziare a adescare la scatola di induzione lasciando che la miscela di isoflurano/ossigeno riempia la scatola. A 2 minuti prima dell'imaging, posizionare i topi nella scatola di induzione per l'anestesia.
8. Una volta anestetizzati, spostare i topi dalla scatola di induzione all'IVIS per l'imaging e sdraiarli in posizione prona. Fornire l'anestesia di mantenimento utilizzando isoflurano al 2% durante l'imaging.
9. Una volta che i mouse sono stati inseriti nello scanner IVIS, fare clic su Acquisisci sequenza. Scattare un'immagine utilizzando le impostazioni di esposizione automatica con una soglia minima del segnale di 3.000 conteggi. L'imaging a bioluminescenza visualizza la localizzazione delle cellule di glioblastoma U251 marcate con luciferasi. L'esposizione automatica catturerà un'immagine con una lunghezza di esposizione calcolata in base al segnale più luminoso visibile fino alla lunghezza massima definita dall'utente di 5 minuti.
   NOTA: Una tipica gabbia di topi richiede una singola immagine, poiché la semina è generalmente uniforme. Nei casi con uno o più mouse luminosi, i topi possono essere rimossi e può essere eseguita un'acquisizione ripetuta per catturare meglio i segnali dai topi deboli.
10. Dopo l'imaging a bioluminescenza, modificare le impostazioni IVIS per preparare l'imaging a epifluorescenza ed eseguire scansioni a fluorescenza.
    1. Nella procedura guidata di imaging, selezionare Fluorescenza > Coppia filtrata con epiilluminazione. Nella schermata successiva, selezionare le sonde di cui eseguire l'immagine, ad esempio Cy5.5. Selezionare il soggetto dell'immagine e il campo visivo. Lo scanner IVIS è ora impostato per l'imaging a fluorescenza delle sonde selezionate nella schermata precedente.
11. Scattare un'immagine utilizzando le impostazioni di esposizione automatica con una soglia minima del segnale di 6.000 conteggi. L'imaging a fluorescenza Cy5.5 visualizza la localizzazione di MN-anti-miR10b. L'esposizione automatica catturerà un'immagine con una lunghezza di esposizione calcolata in base al segnale più luminoso visibile fino alla lunghezza massima definita dall'utente di 5 minuti.
    NOTA: L'imaging a fluorescenza raramente richiede esposizioni superiori a 1 minuto, anche nei topi di controllo iniettati con PBS. Una singola immagine è sempre sufficiente poiché la deviazione del segnale tra i topi trattati è piccola.
12. Rimuovere il mouse dall'IVIS dopo l'imaging. Monitorare fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia e dall'ambulatorio.

6. Risonanza magnetica in vivo

NOTA: L'imaging RM viene eseguito prima e 24 ore dopo l'iniezione di nanoparticelle e può essere eseguito negli stessi animali sottoposti a imaging ottico e a bioluminescenza.

1. Anestetizzare il topo in questione in una scatola di induzione con isoflurano al 2%-4% per l'induzione e all'1,5%-2% per il mantenimento con una portata di 1,5 L/min. Una volta anestetizzato, posizionare il topo prono sul letto MRI sopra il palloncino di monitoraggio respiratorio. Adatta perfettamente il cono nasale al muso per erogare l'anestesia durante l'imaging e applicare un unguento oftalmico per gli occhi.
2. Immobilizzare e posizionare la testa per la scansione utilizzando una barra per morso e barre auricolari.
3. Installare la sonda di temperatura rettale lubrificata e assicurarsi che la respirazione e il monitoraggio della temperatura funzionino. Posizionare la bobina cerebrale del topo sopra la testa inserendo i pioli sul letto del mouse nei fori sulla bobina e fissare la bobina con del nastro adesivo in posizione per ridurre il movimento durante la scansione.
4. Posizionare un piccolo cuscinetto di circolazione dell'acqua calda sopra la parte superiore del mouse per mantenere la temperatura corporea durante l'anestetizzazione. Fare attenzione a lasciare una certa distanza tra la bobina e la coperta riscaldante per limitare la distorsione dell'immagine dovuta all'interferenza dell'acqua.
5. Spostare il mouse e il piano di imaging in posizione per la scansione.
6. Regolare e abbinare le bobine MRI avviando la fase di configurazione Wobble nel software di acquisizione. Al termine del servizio della risonanza magnetica, utilizzare le manopole di sintonizzazione e corrispondenza sulla bobina per assicurarsi che la traccia sia centrata (sintonizzazione) e il più profonda possibile (corrispondenza).
7. Acquisire una scansione localizzatore a tre piani e regolare il letto di imaging per posizionare il cervello all'isocentro del magnete, se necessario.
8. Acquisisci scansioni pesate 2D T₂ per rilevare l'agente iniettato nel tumore con i seguenti parametri: tempo di ripetizione (TR) = 2500 ms, tempo di eco (TE) = 25 ms, campo visivo (FOV) 20 x 20 mm, 18 fette coronali, fessura tra le fette di 0,2 mm, risoluzione in piano 150 x 150 μm, spessore della fetta di 0,5 mm.
9. Acquisisci una mappa B0 dell'intero cervello per calcolare uno shim localizzato utilizzando l'utilità Mapshim. Quindi, utilizzare immagini pesate 3D T₂ per visualizzare le nanoparticelle con TR = 30 ms, TE = 10 ms, FOV 20 x 15 x 12 mm, risoluzione isotropa 100 μm.
10. Acquisisci la mappa T₂^* per ulteriori immagini di nanoparticelle utilizzando l'immagine pesata 2D T₂ come riferimento per la scansione della posizione sul tumore. Utilizzare TR = 800 ms, TE = 3,5 ms. FOV 20 x 20 mm, 5 fette coronali, nessuna fessura tra le fette. Risoluzione in piano 100 μm in piano. Acquisizione di 10 immagini di eco positive con spaziatura temporale di 5 ms.
11. Monitora la respirazione e la temperatura corporea durante le sequenze di imaging e regola l'isoflurano e la temperatura dell'acqua, se necessario.
12. Dopo l'imaging, rimuovere il mouse dallo scanner MRI e posizionarlo in una gabbia di recupero riscaldata. Monitorare il topo fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia e dall'ambulatorio.

7. Imaging ex vivo in bioluminescenza e fluorescenza

1. Eseguire l'imaging ex vivo a bioluminescenza e fluorescenza nell'IVIS, in modo simile all'imaging in vivo . Eseguire le operazioni di inizializzazione IVIS e di impostazione della scansione come descritto in precedenza.
2. Al punto finale sperimentale, pesare il topo e calcolare il volume di D-luciferina da somministrare per un dosaggio di 150 mg/kg. Iniettare la dose di D-luciferina ed eseguire l'imaging dal vivo 10 minuti dopo l'iniezione, come descritto in precedenza.
3. Dopo la bioluminescenza finale in vivo e l'imaging a fluorescenza, sopprimere rapidamente il topo mediante lussazione cervicale mentre è ancora sotto anestesia, sezionare il topo e raccogliere gli organi principali, compreso il cervello, su una capsula di Petri.
4. Posizionare la capsula di Petri con gli organi asportati nello scanner IVIS e visualizzare gli organi con entrambe le modalità di bioluminescenza e fluorescenza utilizzando le stesse impostazioni di acquisizione dell'imaging in vivo .
5. Congelare rapidamente tutti gli organi necessari per ulteriori analisi nell'OCT abbassando lentamente il criomold con il campione nell'OCT in una pozza poco profonda di azoto liquido con una lunga pinza fino a quando l'OCT diventa completamente bianco. Non lasciare che l'azoto liquido tocchi l'OCT liquido o abbassi lo stampo troppo rapidamente, poiché si verificheranno bolle dell'OCT. Conservare i campioni congelati a -80 °C.
6. Conservare il cervello contenente il tumore nell'OCT e congelarlo per la criosezione. Conservare a -80 °C fino al momento dell'analisi.

8. Microscopia a fluorescenza

1. Preparare il criostato per la criosezione. Impostare le temperature della camera e della testa del campione tra -15 °C e -20 °C.
2. Estrarre il cervello congelato in OCT dalla conservazione a -80 °C e posizionarlo all'interno della camera del criostato. Lasciare che i campioni si riscaldino alla temperatura della camera (-20 °C) prima di sezionarli.
3. Usando un rasoio a taglio singolo, tagliare il cervello coronalmente nel sito di iniezione. Questo di solito è visibile come una fossetta sulla superficie del cervello. Montare il campione sul disco del campione utilizzando una piccola quantità di OCT per posizionare il lato tagliato del cervello da sezionare. Applicare un'ampia pressione con il peso raffreddato all'interno della camera per garantire un montaggio stabile del campione.
4. Spostare il campione montato e il disco del campione sulla testa del campione in preparazione per il sezionamento. Tagliare il tessuto alla profondità desiderata prelevando sezioni da 20 μm, regolando l'angolo del campione per sezionare il tessuto il più vicino possibile al livello del tessuto.
5. Una volta raggiunta la profondità di tessuto desiderata, regolare il criostato per prelevare sezioni di 5 - 7 μm del campione. Montare le sezioni su vetrini pre-etichettati con descrittori come l'ID del topo, il tessuto sezionato e il numero del vetrino abbassando rapidamente il lato carico del vetrino del microscopio sulla sezione.
6. Prepara una paraformaldeide fresca al 4% (PFA). Immergere il vetrino con il fazzoletto nella soluzione di PFA per 15 minuti per fissare il tessuto. Sciacquare il vetrino con DPBS 3 volte dopo il fissaggio.
7. Alla sezione di tessuto ora fissata sul vetrino, aggiungere una goccia di 40 μl di terreno di montaggio contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), che colora i nuclei cellulari. Posizionare con cautela un vetrino coprioggetti in vetro da 24 mm x 50 mm sopra il supporto di montaggio e assicurarsi che l'intero tessuto sia stato racchiuso nel supporto di montaggio.
8. Visualizzare il tessuto utilizzando la microscopia a fluorescenza DAPI (emissione (em) a 359 nm, eccitazione (ex) a 457 nm) e Cy5.5 (ex 683 nm, em 703 nm).

Risultati

MN-anti-miR10b è stato sintetizzato e caratterizzato, come descritto in precedenza¹¹. La microscopia elettronica a trasmissione di MN-anti-miR10b mostra la morfologia e la polidispersione della nano piattaforma (Figura 1B). Questa nanopiattaforma ha una dimensione media di 25,12 ± 0,34 nm con un potenziale zeta di 13,18 ± 1,47 mV (Figura 1C,D). In questi studi, a topi atimici nudi sono state impiantate ortotopicamente cellule di glioblastoma umano U251 seguendo il protocollo sopra descritto. Sono state eseguite iniezioni endovenose sistemiche di MN-anti-miR10b a 20 mg Fe/kg. I topi sono stati soppressi e i tessuti sono stati raccolti 7 giorni dopo la somministrazione finale del nanofarmaco. I segnali di fluorescenza e bioluminescenza Cy5.5 nei topi iniettati con MN-anti-miR10b hanno mostrato una chiara co-localizzazione (Figura 2A, B), indicando la consegna delle nanoparticelle al tumore, mentre i topi di controllo non hanno mostrato alcun segnale di fluorescenza. L'imaging a fluorescenza ex vivo ha mostrato la localizzazione delle nanoparticelle nei principali organi di clearance come il fegato e i reni, che è prevista per questo tipo di nanoparticelle (Figura 2C). In uno studio separato, i topi sono stati impiantati ortotopicamente con cellule GBM, come sopra, e sottoposti a imaging RM in vivo. Le immagini pesate in T₂^* e le mappe in T₂^* sono state ottenute prima della somministrazione delle nanoparticelle e 24 ore dopo una singola dose di 20 mg Fe/kg. Una caratteristica diminuzione del segnale RM pesato in T₂ dimostra il potenziale di MN-anti-miR10b come mezzo di contrasto per la risonanza magnetica per attraversare la barriera emato-encefalica e il suo accumulo nella regione tumorale (Figura 3). Dopo l'imaging in vivo, è stata condotta la microscopia a fluorescenza per verificare ulteriormente la consegna di nanoparticelle al tumore. Come descritto sopra, i tessuti sono stati sezionati e preparati per la microscopia con colorazione DAPI. Il segnale di fluorescenza Cy5.5 è stato mostrato nella regione tumorale, confermando la consegna (Figura 4).

Figura 1. Caratterizzazione di MN-anti-miR10b. (A) Una struttura schematica di un MN-anti-miR10b. La nano piattaforma è costituita da un nucleo di ossido di ferro ricoperto di destrano, marcato con un colorante ottico Cy5.5 e coniugato con oligonucleotide terapeutico (anti-miR10b). Creato con BioRender.com. (B) Microscopia elettronica a trasmissione di MN-anti-miR10b. (C) La dimensione idrodinamica del costrutto è di 25,12 ± 0,34 nm. (D) Il potenziale zeta di MN-anti-miR10b è 13,18 ± 1,47 mV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Studi in vivo ed ex vivo nel modello di GBM. (A) L'imaging a bioluminescenza in vivo (a sinistra) e l'imaging a fluorescenza (a destra) mostrano la co-localizzazione del segnale delle nanoparticelle magnetiche nella regione tumorale. (B) La bioluminescenza ex vivo e l'imaging a fluorescenza di cervelli asportati confermano la co-localizzazione del segnale. (C) La biodistribuzione degli organi mostra un accumulo ai principali organi di clearance. B: Cervello; H: Cuore; Lu: Polmoni; Li: Fegato; S: Milza; K: Reni; M: Muscolo; (n=6 per tutti i gruppi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. In vivo Risonanza magnetica nel modello GBM. Immagini pesate in T₂^* (riga superiore) e mappe T₂^* (riga inferiore) ottenute prima (a sinistra) e 24 ore dopo l'iniezione (a destra) di MN-anti-miR10b. La diminuzione dell'intensità del segnale nell'immagine post-iniezione è indicativa dell'accumulo di ossido di ferro (n=3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Microscopia a fluorescenza ex vivo di tessuti tumorali. Immagini microscopiche rappresentative mostrano l'accumulo di nanoparticelle. Blu - DAPI, Magenta - Cy5.5. Barra della scala = 100 μm; (n=6 per tutti i gruppi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Diversi passaggi critici nei diversi metodi di convalida dell'accumulo delle nanoparticelle attraverso la BBB possono essere decisivi per il successo del protocollo. A partire dall'impianto ortotopico di cellule GBM, è importante assicurarsi che le linee di sutura del cranio siano visibili dopo l'asciugatura dell'osso; Questo aiuta nel posizionamento accurato delle cellule tumorali. Per perforare il cranio, è meglio applicare una leggera pressione sul sito di perforazione e iniziare a perforare per lasciare un'impronta superficiale nell'osso. Una volta che il segno iniziale è stato fatto e nella posizione corretta, è più facile perforare con uno slittamento minimo della punta. Interrompere immediatamente la perforazione dopo aver sfondato il cranio per ridurre al minimo i danni al cervello. Durante l'iniezione endovenosa di nanoparticelle e altri agenti, è fondamentale assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella soluzione di iniezione per evitare embolie gassose venose potenzialmente fatali. Alcuni indicatori di successo nell'ingresso nella vena caudale seguendo questo protocollo sono il sangue che viene aspirato nella siringa e la perdita di colore nella vena caudale attorno alla punta dell'ago. Per l'imaging ex vivo a bioluminescenza e fluorescenza dei tessuti asportati, è meglio lavorare rapidamente poiché il segnale di bioluminescenza inizia a decadere nel tempo. La cinetica del segnale di bioluminescenza può variare tra le linee cellulari, quindi è importante comprendere modelli specifici.

Alcuni passaggi possono essere modificati per facilitare il rilevamento della localizzazione delle nanoparticelle. Durante l'imaging in bioluminescenza in vivo , le variazioni nell'impianto delle cellule tumorali e nei tassi di crescita del tumore possono portare a differenze nel segnale di bioluminescenza. In determinate circostanze, il mouse con il segnale BLI più alto può ridurre il tempo di esposizione della scansione, portando a una diminuzione del segnale rilevato in altri topi. In questo caso, è consigliabile continuare la scansione a fluorescenza in modo che i topi rimangano nella stessa posizione per scopi di co-localizzazione BLI e FLI. Quindi, reimaging per la bioluminescenza dopo aver rimosso i topi che mostravano il segnale nella scansione BLI iniziale. Ciò comporterà che il calcolo del tempo di esposizione si baserà su questi topi a segnale più basso e, in ultima analisi, il rilevamento del tumore. Durante l'acquisizione di immagini a fluorescenza in vivo , la localizzazione delle nanoparticelle nel corpo può essere meglio accertata coprendo la coda con carta nera, che può avere un alto segnale di fluorescenza dalla presenza residua di nanoparticelle dalle iniezioni della vena caudale. In una linea di ragionamento simile, durante la scansione a fluorescenza ex vivo degli organi, l'imaging del cervello da solo può mostrare meglio la localizzazione della nanoparticella nel cervello e nella regione tumorale poiché l'accumulo della nanoparticella negli organi del sistema reticoloendoteliale può oscurare il rilevamento del segnale.

Un limite di questo metodo per la somministrazione terapeutica dell'RNA è la distribuzione sistemica delle nanoparticelle nel corpo. Come nel caso di tutte le altre iniezioni sistemiche, la terapia viene rimossa dal flusso sanguigno da organi come fegato, reni e milza, con conseguente diminuzione della consegna della nanoparticella nella regione di interesse. Per risolvere questo problema, MN-anti-miR10b è stato sintetizzato con un rivestimento reticolato di destrano per aumentare il tempo di circolazione nel corpo¹³. Nonostante gli sforzi per aumentare il tempo di circolazione e l'accumulo ottimizzando la struttura della nanoparticella, potrebbero essere necessarie iniezioni multiple della nanoparticella per un accumulo significativo nella regione tumorale, a seconda del modello specifico e dello stato della malattia.

La somministrazione di molecole terapeutiche nel GBM rappresenta una sfida significativa a causa della BBB altamente selettiva. Molti studi hanno testato veicoli di consegna basati su nanoparticelle, che alla fine sono inefficaci nella penetrazione della BBB a causa delle loro dimensioni e carica ^5,6,7. Il costrutto di nanoparticelle da 25 nm, MN-anti-miR10b, qui descritto, è in grado di superare questa barriera fisiologica e accumularsi nella regione tumorale quando iniettato per via sistemica. Questa piattaforma di nanoparticelle ha il potenziale per mediare la consegna di molecole di RNA al GBM e consente il monitoraggio dell'accumulo del veicolo di consegna utilizzando l'imaging. La biodistribuzione delle nanoparticelle di ossido di ferro segue un modello previsto, in cui si accumulano negli organi del sistema reticoloendoteliale per la clearance. Una biodistribuzione simile è stata riportata con nanoparticelle analoghe utilizzate per scopi di imaging o terapeutici. È importante sottolineare che in questi studi precedenti non vi erano indicazioni di tossicità off-target associate negli organi principali, anche a un dosaggio di 30 mg Fe/kg^14,15.

Un vantaggio di questo sistema di piattaforma di nanoparticelle sono le capacità di imaging in vivo che consentono un monitoraggio non invasivo del suo accumulo. Il colorante fluorescente nel vicino infrarosso Cy5.5 coniugato al rivestimento di destrano consente un rapido imaging ottico per rilevarne la presenza. Oltre a questa modalità, il nucleo di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico di MN-anti-miR10b rende il costrutto adatto come agente di contrasto per risonanza magnetica e rappresenta un'area di sviluppo della teranostica¹⁶. La risoluzione anatomica della risonanza magnetica in combinazione con il contrasto delle nanoparticelle di ossido di ferro può mostrare con precisione dove le nanoparticelle si accumulano nel cervello. Queste due modalità insieme rendono possibile il monitoraggio preclinico in vivo della nanopiattaforma per monitorare la consegna dell'RNA o di altri carichi utili attraverso la BEE.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Topi athymic nude "J:NU"	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Modello murino immunocompromesso
0,25% Tripsina	Gibco	25200-056	Reagente per coltura cellulare per
provetta per microcentrifuga U251 da 1,7 mL	DOT Scientific	RN1700-GMT	Per la raccolta di tessuti
10 &; L, Siringa Neuros, Modello 1701 RN, calibro 33, Stile punta 4	Hamilton	65460-06	Siringa per impianto intracranico di cellule tumorali
3M Vetbond	3M	1469SB	Adesivo tissutale per la chiusura del sito chirurgico
4% Paraformaldeide	Thermo Scientific	J199943-K2	Soluzione di fissaggio tissutale
Salvietta imbevuta di isopropoile al 70%	Cardinal	MW-APL	Salvietta antisettica topica per l'impianto del tumore e l'iniezione della vena caudale
Aperio Versa	Leica		Per la scansione di vetrini di sezioni di tessuto colorate
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	Antisettico topico per l'impianto di tumori
BioSpec 70/30	Bruker		Scanner per risonanza magnetica
Cera per ossa	Medline	DYNJBW25	Cera per ossa per sigillare il sito di impianto
Frese per microfresa	F.S.T.	19007-05	Fresa utilizzata per praticare un foro nel cranio per l'impianto del tumore
DAPI Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-20	Terreno di montaggio tissutale contenente colorante DAPI
Dulbecco' s Terreno di coltura			cellulare per U251
Fine Graefe	F.S.T.	11150-10	Strumento sugico per l'impianto del tumore
Siero fetale bovino	Corning	35-010-CV	Integratore di terreni di coltura cellulare per U251
Forbici fini - Sharp 10,5 cm	F.S.T.	14060-10	Strumento sugico per l'impianto del tumore
Glydo (Lidocaine)	Sagent	673-76	Analgesico topico per sito chirurgico
Ideal Micro Drill	CellPoint Scientific	67-1200A	Trapano utilizzato per praticare il foro nel cranio per l'impianto del tumore
Siringa da insulina 1CC 29G X 1/2"	Becton, Dickinson	324704	Siringa per iniezione di D-Luciferina e iniezione nella vena caudale di nanoparticelle
Isoflurano	Covetrus	11695067772	Anestesia
Vaporizzatore di isoflurano	SOMNI Scientific	VS6002	Apparecchio per anestesia
IVIS SpectrumCT Sistema di imaging in vivo	PerkinElmer/Revvity	128201	Scanner di imaging a bioluminescenza e fluorescenza
IVISbrite D-Luciferin Sale di potassio	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	Substrato per imaging a bioluminescenza
Ketaset (Ketamina)	Zoetis	10004027	Anestetico per chirurgia di impianto tumorale
Ketofen (Ketoprofene)	Zoetis	10004031	Analgesico per chirurgia di impianto tumorale
Leica CM1950	Leica	CM1950	Per criosezione di campioni inclusi in OCT
PBS	Gibco	14190-144	Reagente per colture cellulari e soluzione di sospensione cellulare per l'impianto di U251
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140-122	Antibiotico per terreni di coltura cellulare per U251
Unguento veterinario Puralube	MWI Veterinary	27505	Unguento oftalmico per gli occhi per la protezione durante l'impianto del tumore
Righello	F.S.T.	18000-30	Utilizzato per misurare il sito di perforazione per l'implanazione
Tissue-Tek Cryomold  Intermedio 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	Stampo da collezione per la raccolta di campioni di tessuto
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	Composto di congelamento per la raccolta di campioni di tessuto
Linea cellulare U-251 MG	Millapore Sigma	umano 9063001	Linea cellulare di glioblastoma umano
Soluzione iniettabile di xilazina, 100 mg/ml	Covetrus	1XYL006	Paralitico per chirurgia di impianto tumorale

Extra