Articolo metodologico

Immunocolorazione a montaggio intero e conteggio automatico delle cellule gangliari retiniche di topo

DOI:

10.3791/66991

⸱

4 ottobre 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sichuan Provincial Key Laboratory for Human Disease Gene Study, Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, 2School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, 3Research Unit for Blindness Prevention of Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU026), Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la procedura per isolare la retina di topo a montaggio intero ed eseguire l'immunocolorazione per marcare tutte le cellule gangliari retiniche (RGC). Il processo è seguito dall'imaging e dal conteggio automatico delle RGC utilizzando un software basato sull'intelligenza artificiale, fornendo un metodo semplice, veloce e accurato per quantificare le RGC nell'intera retina del topo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il glaucoma è una delle principali cause di cecità a livello globale, caratterizzata da un complesso meccanismo patogenetico che rende difficile il ripristino della vista. I topi fungono da preziosi modelli animali per lo studio della patogenesi e del trattamento del glaucoma grazie al loro background genetico relativamente omogeneo e alle cellule gangliari retiniche (RGC), che assomigliano strutturalmente a quelle dell'uomo. Una valutazione accurata del danno da RGC e degli esiti del trattamento nei modelli murini di glaucoma richiede la determinazione del numero di RGC in tutta la retina. Questo protocollo delinea un metodo completo che prevede l'isolamento dell'intera retina, l'etichettatura delle RGC con anticorpi specifici e il conteggio automatico rapido e accurato delle RGC utilizzando un programma basato sull'intelligenza artificiale. L'approccio semplificato consente una quantificazione efficiente e precisa del numero di RGC nelle retine di topo, facilitando la valutazione della degenerazione RGC e i potenziali interventi terapeutici. Consentendo ai ricercatori di valutare l'entità del danno da RGC, questo protocollo contribuisce a una comprensione più profonda della patogenesi del glaucoma e aiuta a sviluppare strategie di trattamento efficaci per gestire e prevenire la perdita della vista.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il glaucoma è caratterizzato dalla progressiva morte delle cellule ganglionari, che rappresenta una sfida significativa per il ripristino della vista 1,2. Questa malattia è uno dei principali obiettivi della ricerca oftalmica a causa della sua prevalenza e del suo impatto sulla vista3. I modelli murini sono indispensabili nel glaucoma
ricerca a causa del loro background genetico omogeneo, dell'elevata capacità riproduttiva e della somiglianza delle loro proprietà delle cellule gangliari con gli esseri umani4. L'obiettivo principale di questo metodo è quantificare con precisione le cellule gangliari retiniche (RGC) in modelli murini, il che è essenziale per comprendere la patogenesi del glaucoma e sviluppare trattamenti pertinenti.

La logica alla base dello sviluppo di questa tecnica deriva dalla necessità di un metodo affidabile ed efficiente per valutare la degenerazione della RGC nei modelli murini. I metodi tradizionali, come la marcatura delle RGC nelle sezioni retiniche, spesso forniscono risultati inaffidabili a causa della distribuzione non uniforme delle RGC nella retina5. La quantificazione delle RGC nell'intera retina riflette meglio i cambiamenti nel loro numero ed è fondamentale per valutare la progressione della malattia e gli interventi terapeutici.

Questo metodo offre diversi vantaggi rispetto alle tecniche alternative. Ad esempio, il conteggio manuale delle cellule gangliari retiniche (RGC) in una normale retina di topo adulto, che contiene da 40.000 a 60.000 RGC, può richiedere molto tempo ed essere soggetto a errori 6,7,8. Il software per il conteggio automatico RGC che abbiamo sviluppato consente un conteggio accurato in meno di 3 minuti, consentendo ai ricercatori di risparmiare una notevole quantità di tempo. Inoltre, il software basato sull'intelligenza artificiale utilizzato per il conteggio automatico riduce al minimo le distorsioni e migliora la riproducibilità.

Inoltre, questa tecnica fornisce un approccio standardizzato per valutare la degenerazione della RGC in diversi modelli murini e condizioni sperimentali, contribuendo con dati preziosi al campo della ricerca sul glaucoma. Il metodo è in linea con altri studi che sottolineano l'importanza dell'analisi della retina a montaggio intero per comprendere i cambiamenti retinici nelle malattie9.

Per aiutare i lettori a determinare se questo metodo è adatto alla loro applicazione, è importante notare che questa tecnica è particolarmente vantaggiosa per i ricercatori che studiano la degenerazione delle cellule gangliari retiniche (RGC) in modelli murini di glaucoma o altre malattie retiniche. Il metodo è adattabile a varie configurazioni sperimentali e offre un alto grado di accuratezza ed efficienza nel conteggio RGC, rendendolo ideale sia per studi su piccola che su larga scala. Inoltre, il design semplice del protocollo e la disponibilità di software di facile utilizzo lo rendono accessibile a ricercatori con diversi livelli di esperienza nell'analisi della retina.

Protocollo

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La procedura è conforme alle linee guida dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia per l'utilizzo degli animali nella ricerca ed è stata approvata dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Ospedale popolare provinciale del Sichuan. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6J (di 2 mesi). La Figura 1 illustra la procedura generale qui descritta. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Isolamento di retine a montaggio intero

  1. Sacrificio animale
    1. Sacrificare i topi usando la lussazione cervicale (seguendo protocolli approvati istituzionalmente) (Figura 2A). Prima della lussazione cervicale,
      Anestetizzare i topi inalando isoflurano (3%-5% in ossigeno) o mediante iniezione intraperitoneale della miscela ketamina/xilazina.
  2. Enucleazione ed elaborazione del bulbo oculare
    1. Segna il bordo della cornea sul lato dorsale del bulbo oculare con un pennarello blu per ricordare l'orientamento durante la successiva dissezione.
    2. Rimuovere i tessuti muscolari residui attaccati al bulbo oculare con le forbici. Trasferire il bulbo oculare enucleato in una provetta da microcentrifuga a fondo tondo da 2 mL riempita con 1x PBS per un breve risciacquo (Figura 2C).
  3. Fissazione
    1. Trasferire il bulbo oculare in un'altra provetta per microcentrifuga a fondo tondo da 2 ml contenente il 4% di paraformaldeide (PFA) appena prodotta per il fissaggio a 4 °C per 10 minuti (Figura 2D).
    2. Praticare una piccola incisione (circa 1-2 mm) sulla cornea utilizzando forbici sottili al microscopio da dissezione.
    3. Riposizionare il bulbo oculare nel fissativo per un'ulteriore fissazione a 4 °C per 3 ore per preservare la morfologia del tessuto (Figura 2D).
  4. Rimozione della cornea e del cristallino 1,9
    1. Praticare una piccola incisione di circa 1 mm attorno al limbus corneale, il confine tra la cornea e la sclera, utilizzando le forbici chirurgiche sottili.
    2. Tagliare con cura la circonferenza della cornea, asportandola completamente per esporre le strutture sottostanti.
    3. Usa una pinza sottile per afferrare delicatamente e sollevare con cura la lente dai tessuti circostanti per evitare danni alla retina. Mantenere l'integrità strutturale della retina con un'operazione delicata.
    4. Trasferire l'oculare in una provetta da microcentrifuga per un'ulteriore elaborazione.
      NOTA: Asportare la cornea ed estrarre la lente in modo più efficiente utilizzando la tecnica della "fessura a croce"10. Fai due fessure perpendicolari sulla cornea e usa una pinza per estrarre la lente.
  5. Incisione sclerale
    1. Tagliare una fessura precisa nella sclera con forbici oftalmiche fini per facilitare le successive fasi di dissezione (Figura 2J).
  6. Separazione della retina
    1. Inserire una pinza con i denti nell'incisione tra la sclera e la retina. Afferrare delicatamente il bordo della sclera, evitando una forza eccessiva per evitare di strappare il tessuto.
    2. Ingrandire gradualmente l'incisione muovendo la pinza lungo il confine tra la sclera e la retina con movimenti lenti e costanti della mano. Utilizzare la parte dentata della pinza per separare accuratamente la sclera dalla retina, assicurandosi che la retina non venga danneggiata (Figura 2J).
  7. Taglio retina
    1. Dividi la retina in quattro lembi di dimensioni più o meno uguali usando forbici affilate. Assicurarsi che i tagli siano circa a metà strada verso il nervo ottico e orientati a 90° l'uno dall'altro.
  8. Pulizia della retina
    1. Aprire delicatamente la retina sezionata utilizzando uno spazzolino a setole morbide e rimuovere meticolosamente i detriti dalla sua superficie (Figura 2K).
  9. Fissaggio finale
    1. Trasferire la retina isolata in una provetta da microcentrifuga contenente PFA fresco al 4% utilizzando una pipetta Pasteur monouso. Lasciare fissare il ghiaccio per altre 5 ore o durante la notte per la conservazione dei tessuti.

2. Immunocolorazione

  1. Lavaggio
    1. Lavare la retina isolata a montaggio intero in 1x PBS con una leggera agitazione per 5 minuti. Eliminare la soluzione PBS. Ripetere questo processo due volte per rimuovere i residui di fissativo e i detriti.
  2. Inceppamento
    1. Immergere la retina lavata in una soluzione tampone bloccante (1x PBS con il 4% di siero d'asino normale (NDS) e 0,2% di Triton X-100) per 30 minuti per prevenire il legame di anticorpi aspecifici e migliorare la permeabilizzazione (Figura 3A).
  3. Incubazione degli anticorpi primari
    1. Sostituire il tampone di blocco con l'anticorpo primario BRN3A (diluito 1:200 nel tampone di blocco). Incubare la retina per una notte a 4 °C per consentire il legame specifico antigene-anticorpo (Figura 3B).
  4. Lavaggio
    1. Lavare la retina tre volte con 1x PBS per 5 minuti ciascuna per rimuovere gli anticorpi primari non legati e ridurre la colorazione di fondo (Figura 3C).
  5. Incubazione secondaria degli anticorpi
    1. Incubare la retina con l'anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con Alexa594 o Alexa488 (diluito 1:300) per 2 ore a temperatura ambiente per visualizzare gli antigeni bersaglio (Figura 3D).
  6. Lavaggio
    1. Eseguire tre lavaggi consecutivi con 1x PBS per 5 minuti ciascuno per rimuovere gli anticorpi secondari in eccesso e ridurre al minimo il legame aspecifico.
  7. Montante
    1. Trasferire delicatamente la retina immunocolorata su un vetrino da microscopio, appiattendola con cura per ridurre al minimo il piegamento o la distorsione.
    2. Applicare una piccola goccia di terreno di montaggio anti-sbiadimento al centro della retina, assicurando una distribuzione uniforme su tutto il tessuto.
    3. Posizionare con cura un vetrino coprioggetti sulla retina montata, evitando bolle d'aria (Figura 3E, F).

3. Elaborazione delle immagini

NOTA: Importare l'immagine nel software di conteggio automatico RGC e iniziare a contare. Il numero di cellule BRN3A-positive per l'intera retina può essere ottenuto in pochi minuti. Scarica il software AutoCount da GitHub (https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs). Seguire i passaggi di installazione dettagliati per il software di seguito:

  1. Scaricare il codice dal collegamento GitHub . Si riceverà un file chiamato "Intelligent-quantifying-RGCs.zip". Decomprimi questo file.
  2. Scaricare i file necessari dal disco cloud (vedere Tabella dei materiali) e decomprimerli. Il file scaricato è denominato "yolov5_cpu". Decomprimi questo pacchetto nella cartella corrente per evitare problemi imprevisti.
  3. Individuare il file di configurazione del passaggio 1 e modificarne il contenuto in modo che punti al percorso "yolov5_cpu".
    NOTA: Ad esempio, se il "yolov5_cpu" scaricato viene inserito in "D:\1me\yolov5_cpu_", modificare il file "config.ini" nel passaggio 1 in "D:/1me/yolov5_cpu" (utilizzare / invece di \). (Figura 4A).
  4. Apri l'interfaccia grafica cliccando su userinterface.exe. Il caricamento iniziale potrebbe essere lento (eseguito come amministratore) (Figura 4B).
  5. Dopo aver aperto il software, verificare se il file del modello "pmse_plus.pt" è presente nella directory principale dell'unità C. Se non è presente, copiarlo in questa directory.
    NOTA: Il file del modello "pmse_plus.pt" si trova nella cartella dei pesi della cartella "yolov5", che si trova nella cartella degli RGC di quantificazione intelligente estratta (Figura 4C).
  6. Preparare le immagini da rilevare.
    NOTA: Il software consente di leggere solo una o cinque immagini alla volta. Leggere di più comporterà un errore.

4. Conteggio automatico delle celle

  1. Aprire il software di conteggio (Figura 5A).
  2. Fare clic su APRI IMMAGINE per importare l'immagine (Figura 5B).
  3. Fare clic su RUN per consentire al software di contare automaticamente le celle (Figura 5C).
    NOTA: Il software contrassegnerà le celle contate con una casella quadrata rossa e visualizzerà il conteggio delle celle nell'angolo in alto a destra (Figura 5D).

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive in dettaglio la metodologia per l'immunocolorazione a montaggio intero delle retine di topo, garantendo una meticolosa preparazione dei tessuti, un'incubazione precisa degli anticorpi e un conteggio automatizzato affidabile delle cellule. La procedura facilita la marcatura e la quantificazione robusta delle cellule gangliari retiniche (RGC), consentendo una valutazione accurata delle popolazioni cellulari in vari contesti sperimentali. Il metodo è stato utilizzato per contare le RGC in topi wild-type e modellati con glaucoma, ottenendo risultati coerenti. Un risultato rappresentativo mostra che il numero di RGC in un topo adulto normale a 2 mesi di età è di circa 45.000 (Figura 6).

Per valutare se il software di intelligenza artificiale è in grado di quantificare con precisione le RGC marcate con BRN3a in modelli normali e di malattia, abbiamo generato un modello murino di glaucoma7 indotto da N-metil-D-aspartato (NMDA). La retina a montaggio intero di questo modello è stata immunocolorata con anti-BRN3A e le RGC sono state quantificate utilizzando il software di conteggio automatico. Il risultato ha indicato una colorazione di fondo relativamente alta (Figura 7). Ciononostante, il software è stato in grado di identificare con precisione quasi tutti gli RGC. In questa retina sono state identificate un totale di 15.231 RGC, rispetto a circa 45.000-50.000 RGC in una normale retina di topo, indicando una grave degenerazione. Pertanto, il software di intelligenza artificiale può essere utilizzato efficacemente anche per contare le RGC nelle retine con una qualità di colorazione meno ottimale.

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Figura 1: Diagramma schematico per la preparazione di RGC. (A) Il bulbo oculare viene rimosso e posizionato in 1x PBS. (B) Il bulbo oculare viene fissato in PFA al 4% su ghiaccio per 3 ore. (C) Rimozione della cornea. (D) Estrazione della lente. (E) L'oculare è diviso in 4 lembi usando le forbici. (F) La sclera viene staccata e i detriti vengono rimossi delicatamente dalla superficie della retina con una spazzola morbida. (G) La retina è immunomarcata con anti-BRN3A. (H) I segnali fluorescenti vengono riprodotti utilizzando un microscopio confocale. (I) Conteggio automatico degli RGC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

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Figura 2: Isolamento della retina del topo a montaggio intero. (A) Il topo viene soppresso mediante lussazione cervicale. (B) Il mouse è posizionato su una superficie piana. (C) Il bulbo oculare viene rimosso con cura con le forbici. (D) Il bulbo oculare viene posizionato delicatamente in 1x PBS. (E) Il bulbo oculare è fissato con una pinza sul bordo della cornea. (F) Viene praticata una piccola incisione sul bordo della cornea con un ago. (G) La struttura a forma di ciotola viene rimossa dopo aver rimosso la cornea. (H) La lente viene rimossa con cura con una pinza. (I) Viene praticata una piccola incisione lungo il bordo della cornea verso il nervo ottico sulla sclera, evitando danni alla retina. (J) La sclera viene squarciata lungo l'incisione con una pinza. (K) La retina viene appiattita e pulita con un pennello. (L) La retina viene appiattita e fissata rapidamente con metanolo ghiacciato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Immunocolorazione della retina del topo a montaggio intero. (A) Dopo il lavaggio con 1x PBS, la retina viene bloccata con un tampone bloccante. (B) La retina viene incubata con un anticorpo primario a 4 °C durante la notte. (C) La retina viene lavata con 1x PBS tre volte. (D) La retina viene incubata con un anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente. (E) La retina è montata su un vetrino con RGC rivolte verso l'alto. (F) Le immagini vengono acquisite utilizzando un microscopio confocale laser. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Installazione del software di conteggio automatico. (A) Il passaggio 1 prevede l'aggiornamento del percorso del file alla directory "yolov5_cpu". (B) Viene avviata l'interfaccia grafica. (C) Verifica della presenza del file del modello nella directory principale dell'unità C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Funzionamento del software di conteggio RGC automatizzato. (A) Il software di conteggio è aperto. (B) Si fa clic sul pulsante APRI IMMAGINE per importare l'immagine. (C) Si fa clic sul pulsante RUN per avviare il conteggio automatico. (D) Le celle contate sono contrassegnate da una casella quadrata rossa e il numero di cella viene visualizzato nell'angolo in alto a destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Conteggio automatizzato degli RGC del topo. Il pannello superiore (a sinistra) mostra i risultati rappresentativi della retina a montaggio piatto immunocolorata con anti-BRN3A; il pannello superiore (a destra) mostra il conteggio automatico degli RGC con software precedentemente sviluppato. Barra di scala: 100 μm. Gli inserti dei pannelli superiori vengono ingranditi e visualizzati rispettivamente nel pannello inferiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Conteggio RGC in un modello murino di glaucoma indotto da NMDA. Pannello di sinistra: Panoramica della retina a montaggio completo, che mostra gli RGC riconosciuti dal software AI. Pannello di destra: Vista ingrandita di un'area parziale della retina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo fornisce un metodo per determinare tutte le cellule gangliari retiniche (RGC) in una retina di topo, che può essere utilizzato per monitorare la progressione della degenerazione RGC in modelli murini per studi sul glaucoma. La retina del topo è un tessuto nervoso delicato5 e isolare le retine a montatura intera dagli occhi del topo richiede una pratica ripetuta. Durante la sperimentazione, è stato riscontrato che il tempo di fissazione influisce in modo significativo sulla morfologia della retina. Per i topi intorno alle 2 settimane di età, un tempo di fissazione di 20 minuti è sufficiente per ottenere buoni risultati grazie alla sclera sottile e debole. Tuttavia, per i topi adulti di età superiore ai 2 mesi, 20 minuti di fissazione sono inadeguati. Un tempo di fissazione di 3 ore è ottimale per ottenere retine intatte a montatura intera.

Nel processo di isolamento della retina, il passaggio più impegnativo è separare la sclera dalla retina10. La sclera può essere staccata dalla retina in modo relativamente semplice utilizzando due serie di pinze con punte dentate. Utilizzando le due serie di pinze per afferrare la sclera e separarla, la sclera viene strappata in piccoli pezzi e separata dalla retina.

Un'immagine di alta qualità delle cellule gangliari retiniche (RGC) è fondamentale per un conteggio accurato. Poiché la retina è tridimensionale, non tutte le RGC sono allo stesso livello in una retina montata in piano8. Quando la retina è montata su un vetrino, dovrebbe essere allargata il più piatta possibile per facilitare l'imaging successivo. Durante l'imaging, le immagini vengono acquisite a più livelli di messa a fuoco per catturare tutte le RGC in diverse aree dell'intera retina.

In sintesi, questo protocollo fornisce una procedura standardizzata per il conteggio automatico di tutti gli RGC in una retina di topo montata in piano. Questo metodo consente agli scienziati di valutare con precisione la degenerazione della RGC nei modelli murini, migliorando l'efficienza e l'accuratezza della quantificazione della RGC. Tale precisione è fondamentale per comprendere e trattare il glaucoma e le malattie correlate.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo progetto di ricerca è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82371059 (H.Z.)), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia del Sichuan, Cina (2023JDZH0002 (H.Z.)), dall'Ufficio per la Scienza e la Tecnologia di Chengdu (2022-YF05-01984-SN (H.Z.)), e dall'Ospedale Provinciale del Popolo del Sichuan (30320230095 (J.Y.), 30420220062 (J.Y.)).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1&volte; PBSServicebioG4202
Alexa594 Capra coniugata Anti-coniglio IgG  (H+L)ThermoFisherA-11012
Anticorpo anti-BRN3A [EPR23257-285]Abcamab245230
Softwarehttps://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Disco cloudCollegamentohttps://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6 
Disco cloudBaidu linkCodice di estrazione: g44khttps://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg 
MarkerSharpie
Normal Siero d'asinoBiosharp, Labgic25030081
ParaformaldehydeMacklinP804536
ProClean 300BeyotimeST853
SaccarosioBBI, SangonA610498
Triton X-100BioFroxx, neoFroxx1139ML100
AutoCount all'unità Google

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
  2. Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population. Eye. , (2024).
  3. Atkinson, M. J., et al. A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP). Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).
  4. Guo, J., et al. A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice. Vision Res. 219, 108397(2024).
  5. Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).
  6. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  7. Zhang, J., et al. Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5. Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).
  8. Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).
  9. Claes, M., Moons, L. Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice. Cells. 11 (17), 2689(2022).
  10. Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells. J Vis Exp. (194), e65222(2023).

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