Lo studio introduce Zebra II, un sistema avanzato per l'acquisizione e l'analisi prolungata dell'ECG nel pesce zebra. Questo sistema è dotato di un sistema di perfusione indipendente ed elettrodi a punti multipli per la movimentazione di più pesci in ambienti controllati. Gli effetti acuti dell'amiodarone sono stati valutati e analizzati con il pesce zebra wild-type.
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Articolo metodologico
Zebra II come nuovo sistema per registrare segnali elettrofisiologici nel pesce zebra
In questo articolo
Sommario
Abstract
I pesci zebra e le loro linee mutanti sono stati ampiamente utilizzati in indagini biomediche, studi cardiovascolari e screening di farmaci. Nel presente studio, viene presentata la versione commerciale del nuovo sistema, Zebra II. Il protocollo dimostra l'acquisizione e l'analisi dell'elettrocardiogramma (ECG) da più zebrafish all'interno di ambienti di lavoro controllabili. Il dispositivo è composto da un sistema di perfusione esterno e indipendente, un elettrodo a 4 punti, sensori di temperatura e un sistema elettronico integrato. In studi precedenti, il prototipo del dispositivo è stato sottoposto a convalida rispetto al sistema iWORX consolidato attraverso diversi test, dimostrando una qualità dei dati e una risposta ECG simili agli interventi farmacologici. In seguito, lo studio ha approfondito l'esame dell'impatto dei farmaci anestetici e delle fluttuazioni di temperatura sull'ECG del pesce zebra, richiedendo una valutazione immediata dei dati. Grazie alla capacità dell'apparecchio di erogare costantemente anestetici e farmaci, è stato possibile estendere la raccolta dei dati ECG fino a 1 ora, notevolmente più lunga della durata di 5 minuti supportata dai sistemi attuali. Questo documento presenta un'analisi automatizzata pionieristica, basata su cloud, che utilizza i dati di quattro pesci zebra, offrendo un metodo efficiente per condurre esperimenti di combinazione e ridurre significativamente il tempo e lo sforzo. Il sistema si è dimostrato efficace nel catturare e analizzare l'ECG, in particolare nel rilevare le aritmie indotte da farmaci nel pesce zebra wild-type. Inoltre, la capacità di raccogliere dati su più canali ha facilitato l'esecuzione di studi randomizzati controllati con modelli di zebrafish. Il sistema ECG sviluppato supera i limiti esistenti, dimostrando il potenziale per accelerare notevolmente la scoperta di farmaci e la ricerca cardiovascolare che coinvolge il pesce zebra.
Introduzione
Le malattie cardiovascolari (CVD) sono la principale causa di morte in tutto il mondo. Secondo il rapporto di aggiornamento AHA 2024, circa 2552 persone muoiono ogni giorno di CVD negli Stati Uniti e il costo medio diretto e indiretto di CVD è stato stimato in 378,0 miliardi di dollari nel 2017-20181. La fibrillazione atriale (FA) è una delle aritmie cardiache più comuni negli Stati Uniti2 ed è associata a una prognosi sfavorevole, aumentando il rischio di ictus e morte sia in scenari CVD che di malattie non cardiovascolari, portando a un aumento del rischio di esiti avversi3. Questo tipo di aritmia si distingue per la sua attività elettrica rapida e irregolare negli atri, che di solito si traduce in un ritmo ventricolare veloce e irregolare4. Inoltre, dati i recenti eventi di COVID-19, c'è stato un aumento del numero di studi e prove che mostrano un aumento della comparsa di aritmia in relazione a COVID-19, principalmente alla bradicardia sinusale5. Sul lato opposto della FA, la bradicardia sinusale presenta un ritmo cardiaco ridotto e più lento, con una frequenza cardiaca inferiore a 60 battiti al minuto (bpm). Questa diagnosi richiede un elettrocardiogramma (ECG) che mostri un ritmo sinusale normale a una frequenza inferiore a 60 bpm.
Il pesce zebra, Danio rerio, ha dimostrato di essere un modello ideale per studi cardiovascolari e di sviluppo di farmaci grazie alla sua omologia con gli esseri umani sia nella morfologia, che nella fisiologia e nella genetica6,7. Nonostante abbia solo due camere distinguibili rispetto al cuore a quattro camere negli esseri umani, il pesce zebra possiede una struttura contrattile simile con un sistema di conduzione analogo8,9. Pertanto, il modello di zebrafish è adatto per la ricerca di aritmie cardiache e per esplorare l'associazione tra percorsi genetici correlati e caratteristiche elettrofisiologiche attraverso l'analisi ECG. Per quanto riguarda il design del sensore per la registrazione ECG nel pesce zebra, gli elettrodi ad ago convenzionali sono comunemente usati10. Altri studi hanno presentato alternative per gli aghi convenzionali progettando un diverso tipo di ago realizzato con materiali diversi11, questi hanno incorporato materiali come filamento di tungsteno, acciaio inossidabile e filo d'argento per valutare la qualità dei dati registrati. Insieme al kit ECG portatile, hanno cercato di creare una piattaforma universale sia per i laboratori di ricerca che per quelli educativi.
Il sistema di aghi è stato utilizzato anche in altri studi11,12,13,14 per svolgere ricerche sugli effetti biologici e/o indotti da farmaci, in cui ha mostrato risultati incoraggianti. Tuttavia, per ottenere segnali ottimali, è stato necessario inserire con cura gli aghi attraverso il derma del pesce zebra. Questa procedura invasiva può causare lesioni al cuore del pesce a causa dell'affilatura degli aghi, modificando così la morfologia del segnale13. Inoltre, posizionare con precisione l'elettrodo sul piccolo cuore senza causare danni per garantire una chiara acquisizione dell'ECG presenta una curva di apprendimento significativa. Di conseguenza, sono stati introdotti vari sistemi di sonde sostitutive, come gli array di microelettrodi (MEA) e i sensori stampati in 3D. Sia il nostro team che altri ricercatori hanno utilizzato con successo MEA per l'acquisizione dei dati, ottenendo dati che offrono un buon rapporto segnale/rumore (SNR) insieme a un'elevata risoluzione spaziale e temporale15,16,17. Ad esempio, abbiamo introdotto un MEA che avvolge il cuore del pesce, consentendo l'acquisizione di segnali ECG specifici del sito15,16. Al contrario, un altro team ha sviluppato un diverso tipo di MEA basato su un circuito stampato flessibile (FPCB) realizzato con pellicola di poliimmide finalizzato alla registrazione di elettroencefalogrammi multipli (EEG) per la ricerca sull'epilessia18. Sebbene i MEA consentano la registrazione di numerosi segnali, sono limitati dalla capacità di valutare un solo pesce alla volta a causa del numero limitato di canali elettrodici. In risposta a questa limitazione, abbiamo recentemente presentato un sistema avanzato in grado di registrare simultaneamente ECG da più fish19. Questo sistema impiega due elettrodi, ciascuno di 125 μm di spessore e realizzati in poliimmide, con elettrodi spruzzati d'oro posizionati nella parte inferiore del loro alloggiamento per facilitare l'acquisizione dei dati. Tuttavia, l'inclusione di una pompa di circolazione dell'acqua ha introdotto rumore, influenzando la qualità del rapporto segnale/rumore (SNR) dei segnali ECG. Inoltre, era necessario l'uso di strumenti di raccolta dati ingombranti e costosi, che richiedevano una connessione cablata a un computer. Sul mercato, sistemi come iWORX offrono una migliore portabilità attraverso un amplificatore compatto, ma devono affrontare problemi irrisolti: (i) il loro tempo di registrazione è troppo breve (3-5 minuti) per esperimenti che richiedono durate più lunghe, come quelli che coinvolgono effetti acuti dei farmaci; ii) la necessità di anestetizzare gli animali, che può stressarli e distorcere i dati elettrofisiologici cardiaci innati; (iii) le misurazioni manuali e sequenziali ostacolano la ricerca con un gran numero di pesci; e (iv) la necessità di un'elaborazione dei dati ECG offline e laboriosa. È importante sottolineare che non sono ancora emersi sistemi ad alto rendimento che incorporano la microelettronica per l'analisi dei fenotipi mutanti. Pertanto, la creazione di sistemi ad alto rendimento che consentano la registrazione estesa dell'ECG è fondamentale per scoprire i collegamenti tra fenotipi aritmici e genotipi mutanti, identificare più fenotipi aritmici associati a genotipi mutanti singoli e testare l'efficacia dei farmaci cardiaci utilizzando il modello zebrafish. Di conseguenza, nel 2022 abbiamo introdotto l'innovativo prototipo del sistema Zebra II. Questo nuovo sistema è in grado di eseguire registrazioni ECG estese da più pesci contemporaneamente. Per raggiungere questo obiettivo, è stato realizzato un sistema elettronico interno, che utilizza la tecnologia Internet of Things (IoT) per la trasmissione wireless dei dati e consente l'analisi dei dati attraverso un'applicazione mobile. L'inclusione della tecnologia IoT non solo ha rafforzato la flessibilità e la portabilità del sistema, ma ha anche facilitato le collaborazioni remote per la ricerca sui modelli di zebrafish. In uno studio precedente, abbiamo convalidato l'efficacia del sistema attraverso test approfonditi, dimostrando la sua capacità di 1) acquisire dati ECG contemporaneamente da quattro pesci; 2) eseguire registrazioni ECG continue per un massimo di 1 ora, che supera significativamente la capacità dei sistemi esistenti che catturano solo pochi minuti; 3) ridurre al minimo gli effetti confondenti dell'anestesia impiegando una concentrazione ridotta del 50% di Tricaina. Inoltre, il sistema ha dimostrato una forte capacità di lunghe registrazioni ECG in vari esperimenti, come quelli che coinvolgono il blocco senoatriale (SA) indotto dal sodio, le variazioni della frequenza cardiaca indotte dalla temperatura e le aritmie indotte da farmaci sia nei pesci mutanti Tg(SCN5A-D1275N) che in quelli wildtype in condizioni sperimentali controllate. L'adozione da parte del sistema di più canali elettrodici per la registrazione estesa dell'ECG consente inoltre l'esecuzione di studi randomizzati controllati, consentendo di studiare due pesci per gruppo sperimentale in condizioni identiche20. In questo articolo, presentiamo la versione aggiornata del sistema, dotata di un elettrodo a 4 punti. Questo miglioramento consente agli utenti di acquisire letture ECG da varie posizioni sul pesce, riducendo significativamente la possibilità di ottenere segnali ECG di bassa qualità. Inoltre, questa iterazione si basa e perfeziona la maggior parte delle funzionalità delineate nella ricerca precedente19. Questo sistema ECG evoluto mostra grandi promesse nell'affrontare le limitazioni esistenti, facilitando così sostanzialmente l'analisi dei fenotipi aritmici e lo screening dei farmaci nel pesce zebra. L'innovativa aggiunta dell'elettrodo a 4 punti è stata rigorosamente testata attraverso un breve studio sull'aritmia indotta da farmaci nel pesce zebra wild-type, convalidandone ulteriormente l'efficacia.
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Protocollo
Attenersi rigorosamente alle linee guida etiche garantisce il benessere e la gestione appropriata del pesce zebra coinvolto nei nostri esperimenti. Tutte le attività sperimentali sono state condotte in conformità con gli standard stabiliti dai Comitati Istituzionali per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC). Gli esperimenti e i risultati qui descritti sono stati eseguiti con l'approvazione dell'IACUC nell'ambito del protocollo autorizzato AUP-21-066.
1. Preparazione e stoccaggio delle soluzioni madre
ATTENZIONE: Preparare la soluzione madre di tricaina in una cappa aspirante, indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI).
- Misurare 400 mg di polvere di tricaina e scioglierla in 97,9 ml di acqua deionizzata (DI). Posizionare un agitatore magnetico nel contenitore e mescolare gradualmente la soluzione.
- Regolare il pH aggiungendo in modo incrementale meno di 17 ml di soluzione di NaOH. Continuare ad aggiungere gocce di NaOH fino a quando il pH raggiunge un intervallo compreso tra 6,8 e 7,2.
- Determinare la concentrazione finale della soluzione di tricaina, tenendo conto del NaOH aggiunto necessario per regolare il pH e immagazzinare.
NOTA: La soluzione di tricaina è sensibile alla luce e deve essere conservata in un contenitore di colore ambrato a 4 °C quando non viene utilizzata. - Misurare 258,13 mg di amiodarone e scioglierlo in 1 L di acqua deionizzata. Inserire un agitatore magnetico nel contenitore e mescolare per alcuni minuti fino a quando la soluzione non è completamente disciolta e priva di polvere. Conservare la soluzione in frigorifero a 4°C quando non viene utilizzata.
NOTA: L'amiodarone deve essere preparato all'interno di una cappa aspirante e conservato in frigorifero a 4 °C. Indossare sempre i DPI adeguati.
2. Allevamento ittico
- Mantenere i pesci in vasche individuali collegate ad un sistema di ricircolo dell'acqua, mantenendo la temperatura tra i 28-29°C.
- Garantire un monitoraggio continuo della qualità dell'acqua e rispettare un ciclo giorno-notte di 14 ore/10 ore.
- Dividi i 40 pesci in quattro gruppi, ciascuno composto da 10 pesci, e ospitali in vasche separate.
3. Configurazione del dispositivo
NOTA: La procedura descritta nel passaggio 3.2 deve essere eseguita per ogni camera del dispositivo (Figura 1). Sebbene ogni camera possa essere configurata in modo diverso, per coerenza nell'esperimento, è consigliabile mantenere impostazioni uniformi in tutte le camere.
- Collegare il dispositivo a una fonte di alimentazione e avviare l'operazione premendo il pulsante rosso situato sul pannello frontale.
- Naviga attraverso il touchscreen del dispositivo per scegliere la camera da configurare.
- Regolare l'impostazione del filtro passa-basso su 0,1 Hz e l'impostazione del filtro passa-alto su 500 Hz. Regolare l'impostazione del guadagno su 10.000.
- Sollevare il coperchio anteriore per accedere alle quattro camere. Prima di iniziare l'esperimento, immergere la spugna di ciascuna camera (spugna di cellulosa standard) in una soluzione di tricaina, quindi spremere il liquido in eccesso.
- Ruotare l'array di quattro elettrodi per assicurarsi che la spugna sia accessibile prima di introdurre il pesce.
4. Trattamento con amiodarone
NOTA: Utilizza l'acqua delle vasche dei pesci (acqua dei pesci) per preparare soluzioni diluite di amiodarone e tricaina. I passaggi 4.3 e 4.4 devono essere ripetuti per ogni gruppo separato nel passaggio 2.3 per ogni soluzione preparata nel passaggio 4.1.
- Seguire i passaggi descritti di seguito per diluire la soluzione madre di amiodarone.
- Diluire 8,75 mL di soluzione madre in 41,25 mL di acqua di pesce per ottenere una concentrazione di 70 μM.
- Diluire 12,5 mL di soluzione madre in 37,5 mL di acqua di pesce per ottenere una concentrazione di 100 μM.
- Diluire 25 mL di soluzione madre in 25 mL di acqua di pesce per ottenere una concentrazione di 200 μM.
- Preparare la soluzione per anestesia diluendo 4 ml di soluzione madre di tricaina in 100 ml di acqua di pesce, ottenendo una concentrazione di tricaina di 0,16 mg/ml
- Immergere ogni pesce singolarmente nella soluzione di amiodarone preparata per 5 minuti. Utilizzare i timer per monitorare accuratamente la durata dell'immersione.
- Trasferire il pesce in una soluzione di tricaina per 2-3 minuti per l'anestesia. Assicurarsi che il trattamento non causi la morte del pesce. Se un pesce mostra un comportamento anomalo, come la perdita di colore o una significativa riduzione del movimento delle branchie, rimuoverlo immediatamente dalla soluzione e rimetterlo in acqua pulita.
5. Raccolta dati ECG
NOTA: Segui immediatamente queste istruzioni dopo aver completato il passaggio 4.4. Ripetere il processo per ogni camera prima di sigillare il dispositivo. Le camere sono progettate per ospitare pesci di larghezza compresa tra 4 e 10 mm e 25-50 mm di lunghezza.
- Solleva il pesce dalla soluzione di tricaina e posizionalo sulla spugna, assicurandoti che il suo lato ventrale sia rivolto verso l'alto.
- Posizionare l'array di elettrodi a forma di rombo sopra l'area del torace del pesce per catturare i segnali ECG da quattro punti diversi contemporaneamente (Figura 2A,B). Assicurati di regolare attentamente ogni elettrodo in modo che ogni pin entri in contatto con la pelle del pesce.
- Ruotare ciascun elettrodo, abbassando il perno fino a quando non entra in contatto con la parte inferiore del pesce. Se il perno è troppo alto, ruotare la vite a testa zigrinata corrispondente in senso orario per abbassarlo fino a toccare il pesce.
- Eseguire la regolazione sopra descritta per gli elettrodi in tutte le camere.
- Chiudere il coperchio delle camere una volta che tutti gli array di elettrodi sono posizionati correttamente sopra i pesci nelle camere operative.
- Contrassegnare ciascuna camera per la registrazione selezionandola sul touchscreen, quindi avviare la registrazione facendo clic sul pulsante Registra sullo schermo.
- Fare clic sul pulsante Interrompi dopo 2 minuti, quindi fare clic sul pulsante Salva dalle finestre di prompt che si aprono sullo schermo dopo l'arresto. Salva le informazioni su un disco o sul cloud, a seconda delle specifiche esigenze di ricerca.
6. Risoluzione dei problemi del sistema di posizionamento dell'array di quattro elettrodi
NOTA: Occasionalmente, uno o più elettrodi potrebbero non riuscire a catturare un chiaro segnale ECG, richiedendo il riposizionamento. Utilizzare i seguenti passaggi per risolvere i problemi dell'array di elettrodi quando necessario.
- Premere il pulsante Stop sull'interfaccia del dispositivo per interrompere il processo di registrazione e identificare il canale o i canali con segnali incoerenti.
- Sollevare il coperchio anteriore per accedere alle camere degli elettrodi. Identificare le camere e gli elettrodi specifici che causano problemi.
- Ruotare la vite a testa zigrinata superiore in senso orario per regolare la vicinanza dell'elettrodo al pesce. Questa azione abbasserà l'elettrodo più vicino al pesce.
- Ripetere il passaggio 6.3 secondo necessità. Se il semplice avvicinamento non risolve il problema, ruotare l'elettrodo in un punto diverso del pesce fino a raggiungere un segnale soddisfacente.
7. Estrazione e analisi dei dati
NOTA: Tutta l'analisi dei dati di base presentata in questo documento utilizza la tecnica Wavelet21 per ridurre vari tipi di rumore e deviazione standard dei normali battiti sinusoidali (SDNN) per calcolare la varianza da battito a battito della FC in segmenti di un minuto.
- Una volta che i dati sono stati salvati sul disco o sul cloud, recuperali per l'analisi o inviali direttamente a un server cloud per un'ulteriore elaborazione.
- Passare ai dati salvati facendo clic sul pulsante Sfoglia sullo schermo e selezionare i set di dati da utilizzare.
- Seleziona il pulsante Estrai nelle opzioni sullo schermo e collega un'unità USB alla parte posteriore del dispositivo per estrarre i dati.
- Seguire le istruzioni del dispositivo per salvare i set di dati selezionati sull'unità esterna per il successivo recupero e analisi.
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Risultati
La capacità di registrare simultaneamente segnali ECG da più pesci rappresenta una caratteristica distintiva di questo dispositivo, offrendo un vantaggio considerevole nella riduzione del tempo necessario per la ricerca farmacologica o cardiaca su zebrafish o altre specie simili (Figura 1). La registrazione di segnali ECG accurati può risultare difficoltosa a causa delle variazioni anatomiche tra i pesci, specialmente per quanto riguarda il posizionamento degli elettrodi. Tradizionalmente, p...
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Discussione
I passaggi attuali sono stati modificati e migliorati in base a questa nuova versione del dispositivo da uno studio precedente condotto dal nostro team20. Qui è inclusa anche una progettazione assistita da computer (CAD) etichettata del dispositivo.
Come evidenziato nella guida alla risoluzione dei problemi del protocollo, il dispositivo richiede all'utente di eseguire alcuni passaggi critici con diligenza e precisione, poiché questi passaggi influiscono in modo crucial...
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Dichiarazioni
Hung Cao e Michael Lau sono i fondatori di Sensoriis, Inc. Il sistema Zebra II di Sensoriis è stato sviluppato con il supporto del NIH, con sovvenzione SBIR Phase II #R44OD024874. L'Università della California, Irvine, ha esaminato e approvato il rapporto di Hung Cao con Sensoriis, Inc. in conformità con le sue politiche in materia di conflitto di interessi. Gli altri autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Siamo grati per il supporto da parte del NIH SBIR Fase II #R44OD024874 a H.C. e M.P.H.L. Gli autori desiderano anche riconoscere il sostegno finanziario fornito dal Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologias (CONAHCYT) in Messico attraverso la borsa di studio intitolata Beca CONAHCYT Para Estudios de Doctorado en el Extranjero.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Amiodarone cloridrato | Sigma-Aldrich | PHR1164-1G | Polvere di amiodarone |
| Misuratore di pH/mV da banco | Sper Scientific | 10500308 | |
| Etilene3-amminobenzoato, sale dell'acido metansolfonico, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC118002500 | Tricaina in polvere |
| Agitatore a piastra calda Isotemp | Fisher Scientific | SP88854200 | |
| Sistema Zebra II | Sensoriis | N/A | Sistema di registrazione ECG commerciale Zebrafish |
| Sistema ECG Zebrafish | iWorx | ZS-200 | Sistema di registrazione ECG commerciale Zebrafish |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
