Lo studio introduce Zebra II, un sistema avanzato per l'acquisizione e l'analisi prolungata dell'ECG nel pesce zebra. Questo sistema è dotato di un sistema di perfusione indipendente ed elettrodi a punti multipli per la movimentazione di più pesci in ambienti controllati. Gli effetti acuti dell'amiodarone sono stati valutati e analizzati con il pesce zebra wild-type.
Articolo metodologico
Zebra II come nuovo sistema per registrare segnali elettrofisiologici nel pesce zebra
In questo articolo
Sommario
Abstract
I pesci zebra e le loro linee mutanti sono stati ampiamente utilizzati in indagini biomediche, studi cardiovascolari e screening di farmaci. Nel presente studio, viene presentata la versione commerciale del nuovo sistema, Zebra II. Il protocollo dimostra l'acquisizione e l'analisi dell'elettrocardiogramma (ECG) da più zebrafish all'interno di ambienti di lavoro controllabili. Il dispositivo è composto da un sistema di perfusione esterno e indipendente, un elettrodo a 4 punti, sensori di temperatura e un sistema elettronico integrato. In studi precedenti, il prototipo del dispositivo è stato sottoposto a convalida rispetto al sistema iWORX consolidato attraverso diversi test, dimostrando una qualità dei dati e una risposta ECG simili agli interventi farmacologici. In seguito, lo studio ha approfondito l'esame dell'impatto dei farmaci anestetici e delle fluttuazioni di temperatura sull'ECG del pesce zebra, richiedendo una valutazione immediata dei dati. Grazie alla capacità dell'apparecchio di erogare costantemente anestetici e farmaci, è stato possibile estendere la raccolta dei dati ECG fino a 1 ora, notevolmente più lunga della durata di 5 minuti supportata dai sistemi attuali. Questo documento presenta un'analisi automatizzata pionieristica, basata su cloud, che utilizza i dati di quattro pesci zebra, offrendo un metodo efficiente per condurre esperimenti di combinazione e ridurre significativamente il tempo e lo sforzo. Il sistema si è dimostrato efficace nel catturare e analizzare l'ECG, in particolare nel rilevare le aritmie indotte da farmaci nel pesce zebra wild-type. Inoltre, la capacità di raccogliere dati su più canali ha facilitato l'esecuzione di studi randomizzati controllati con modelli di zebrafish. Il sistema ECG sviluppato supera i limiti esistenti, dimostrando il potenziale per accelerare notevolmente la scoperta di farmaci e la ricerca cardiovascolare che coinvolge il pesce zebra.
Introduzione
Le malattie cardiovascolari (CVD) sono la principale causa di morte in tutto il mondo. Secondo il rapporto di aggiornamento AHA 2024, circa 2552 persone muoiono ogni giorno di CVD negli Stati Uniti e il costo medio diretto e indiretto di CVD è stato stimato in 378,0 miliardi di dollari nel 2017-20181. La fibrillazione atriale (FA) è una delle aritmie cardiache più comuni negli Stati Uniti2 ed è associata a una prognosi sfavorevole, aumentando il rischio di ictus e morte sia in scenari CVD che di malattie non cardiovascolari, portando a un aumento del rischio di esiti avversi3. Questo tipo di aritmia si distingue per la sua attività elettrica rapida e irregolare negli atri, che di solito si traduce in un ritmo ventricolare veloce e irregolare4. Inoltre, dati i recenti eventi di COVID-19, c'è stato un aumento del numero di studi e prove che mostrano un aumento della comparsa di aritmia in relazione a COVID-19, principalmente alla bradicardia sinusale5. Sul lato opposto della FA, la bradicardia sinusale presenta un ritmo cardiaco ridotto e più lento, con una frequenza cardiaca inferiore a 60 battiti al minuto (bpm). Questa diagnosi richiede un elettrocardiogramma (ECG) che mostri un ritmo sinusale normale a una frequenza inferiore a 60 bpm.
Il pesce zebra, Danio rerio, ha dimostrato di essere un modello ideale per studi cardiovascolari e di sviluppo di farmaci grazie alla sua omologia con gli esseri umani sia nella morfologia, che nella fisiologia e nella genetica6,7. Nonostante abbia solo due camere distinguibili rispetto al cuore a quattro camere negli esseri umani, il pesce zebra possiede una struttura contrattile simile con un sistema di conduzione analogo8,9. Pertanto, il modello di zebrafish è adatto per la ricerca di aritmie cardiache e per esplorare l'associazione tra percorsi genetici correlati e caratteristiche elettrofisiologiche attraverso l'analisi ECG. Per quanto riguarda il design del sensore per la registrazione ECG nel pesce zebra, gli elettrodi ad ago convenzionali sono comunemente usati10. Altri studi hanno presentato alternative per gli aghi convenzionali progettando un diverso tipo di ago realizzato con materiali diversi11, questi hanno incorporato materiali come filamento di tungsteno, acciaio inossidabile e filo d'argento per valutare la qualità dei dati registrati. Insieme al kit ECG portatile, hanno cercato di creare una piattaforma universale sia per i laboratori di ricerca che per quelli educativi.
Il sistema di aghi è stato utilizzato anche in altri studi11,12,13,14 per svolgere ricerche sugli effetti biologici e/o indotti da farmaci, in cui ha mostrato risultati incoraggianti. Tuttavia, per ottenere segnali ottimali, è stato necessario inserire con cura gli aghi attraverso il derma del pesce zebra. Questa procedura invasiva può causare lesioni al cuore del pesce a causa dell'affilatura degli aghi, modificando così la morfologia del segnale13. Inoltre, posizionare con precisione l'elettrodo sul piccolo cuore senza causare danni per garantire una chiara acquisizione dell'ECG presenta una curva di apprendimento significativa. Di conseguenza, sono stati introdotti vari sistemi di sonde sostitutive, come gli array di microelettrodi (MEA) e i sensori stampati in 3D. Sia il nostro team che altri ricercatori hanno utilizzato con successo MEA per l'acquisizione dei dati, ottenendo dati che offrono un buon rapporto segnale/rumore (SNR) insieme a un'elevata risoluzione spaziale e temporale15,16,17. Ad esempio, abbiamo introdotto un MEA che avvolge il cuore del pesce, consentendo l'acquisizione di segnali ECG specifici del sito15,16. Al contrario, un altro team ha sviluppato un diverso tipo di MEA basato su un circuito stampato flessibile (FPCB) realizzato con pellicola di poliimmide finalizzato alla registrazione di elettroencefalogrammi multipli (EEG) per la ricerca sull'epilessia18. Sebbene i MEA consentano la registrazione di numerosi segnali, sono limitati dalla capacità di valutare un solo pesce alla volta a causa del numero limitato di canali elettrodici. In risposta a questa limitazione, abbiamo recentemente presentato un sistema avanzato in grado di registrare simultaneamente ECG da più fish19. Questo sistema impiega due elettrodi, ciascuno di 125 μm di spessore e realizzati in poliimmide, con elettrodi spruzzati d'oro posizionati nella parte inferiore del loro alloggiamento per facilitare l'acquisizione dei dati. Tuttavia, l'inclusione di una pompa di circolazione dell'acqua ha introdotto rumore, influenzando la qualità del rapporto segnale/rumore (SNR) dei segnali ECG. Inoltre, era necessario l'uso di strumenti di raccolta dati ingombranti e costosi, che richiedevano una connessione cablata a un computer. Sul mercato, sistemi come iWORX offrono una migliore portabilità attraverso un amplificatore compatto, ma devono affrontare problemi irrisolti: (i) il loro tempo di registrazione è troppo breve (3-5 minuti) per esperimenti che richiedono durate più lunghe, come quelli che coinvolgono effetti acuti dei farmaci; ii) la necessità di anestetizzare gli animali, che può stressarli e distorcere i dati elettrofisiologici cardiaci innati; (iii) le misurazioni manuali e sequenziali ostacolano la ricerca con un gran numero di pesci; e (iv) la necessità di un'elaborazione dei dati ECG offline e laboriosa. È importante sottolineare che non sono ancora emersi sistemi ad alto rendimento che incorporano la microelettronica per l'analisi dei fenotipi mutanti. Pertanto, la creazione di sistemi ad alto rendimento che consentano la registrazione estesa dell'ECG è fondamentale per scoprire i collegamenti tra fenotipi aritmici e genotipi mutanti, identificare più fenotipi aritmici associati a genotipi mutanti singoli e testare l'efficacia dei farmaci cardiaci utilizzando il modello zebrafish. Di conseguenza, nel 2022 abbiamo introdotto l'innovativo prototipo del sistema Zebra II. Questo nuovo sistema è in grado di eseguire registrazioni ECG estese da più pesci contemporaneamente. Per raggiungere questo obiettivo, è stato realizzato un sistema elettronico interno, che utilizza la tecnologia Internet of Things (IoT) per la trasmissione wireless dei dati e consente l'analisi dei dati attraverso un'applicazione mobile. L'inclusione della tecnologia IoT non solo ha rafforzato la flessibilità e la portabilità del sistema, ma ha anche facilitato le collaborazioni remote per la ricerca sui modelli di zebrafish. In uno studio precedente, abbiamo convalidato l'efficacia del sistema attraverso test approfonditi, dimostrando la sua capacità di 1) acquisire dati ECG contemporaneamente da quattro pesci; 2) eseguire registrazioni ECG continue per un massimo di 1 ora, che supera significativamente la capacità dei sistemi esistenti che catturano solo pochi minuti; 3) ridurre al minimo gli effetti confondenti dell'anestesia impiegando una concentrazione ridotta del 50% di Tricaina. Inoltre, il sistema ha dimostrato una forte capacità di lunghe registrazioni ECG in vari esperimenti, come quelli che coinvolgono il blocco senoatriale (SA) indotto dal sodio, le variazioni della frequenza cardiaca indotte dalla temperatura e le aritmie indotte da farmaci sia nei pesci mutanti Tg(SCN5A-D1275N) che in quelli wildtype in condizioni sperimentali controllate. L'adozione da parte del sistema di più canali elettrodici per la registrazione estesa dell'ECG consente inoltre l'esecuzione di studi randomizzati controllati, consentendo di studiare due pesci per gruppo sperimentale in condizioni identiche20. In questo articolo, presentiamo la versione aggiornata del sistema, dotata di un elettrodo a 4 punti. Questo miglioramento consente agli utenti di acquisire letture ECG da varie posizioni sul pesce, riducendo significativamente la possibilità di ottenere segnali ECG di bassa qualità. Inoltre, questa iterazione si basa e perfeziona la maggior parte delle funzionalità delineate nella ricerca precedente19. Questo sistema ECG evoluto mostra grandi promesse nell'affrontare le limitazioni esistenti, facilitando così sostanzialmente l'analisi dei fenotipi aritmici e lo screening dei farmaci nel pesce zebra. L'innovativa aggiunta dell'elettrodo a 4 punti è stata rigorosamente testata attraverso un breve studio sull'aritmia indotta da farmaci nel pesce zebra wild-type, convalidandone ulteriormente l'efficacia.
Protocollo
Attenersi rigorosamente alle linee guida etiche garantisce il benessere e la gestione appropriata del pesce zebra coinvolto nei nostri esperimenti. Tutte le attività sperimentali sono state condotte in conformità con gli standard stabiliti dai Comitati Istituzionali per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC). Gli esperimenti e i risultati qui descritti sono stati eseguiti con l'approvazione dell'IACUC nell'ambito del protocollo autorizzato AUP-21-066.
1. Preparazione e stoccaggio delle soluzioni madre
ATTENZIONE: Preparare la soluzione madre di tricaina in una cappa aspirante, indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI).
- Misurare 400 mg di polvere di tricaina e scioglierla in 97,9 ml di acqua deionizzata (DI). Posizionare un agitatore magnetico nel contenitore e mescolare gradualmente la soluzione.
- Regolare il pH aggiungendo in modo incrementale meno di 17 ml di soluzione di NaOH. Continuare ad aggiungere gocce di NaOH fino a quando il pH raggiunge un intervallo compreso tra 6,8 e 7,2.
- Determinare la concentrazione finale della soluzione di tricaina, tenendo conto del NaOH aggiunto necessario per regolare il pH e immagazzinare.
NOTA: La soluzione di tricaina è sensibile alla luce e deve essere conservata in un contenitore di colore ambrato a 4 °C quando non viene utilizzata. - Misurare 258,13 mg di amiodarone e scioglierlo in 1 L di acqua deionizzata. Inserire un agitatore magnetico nel contenitore e mescolare per alcuni minuti fino a quando la soluzione non è completamente disciolta e priva di polvere. Conservare la soluzione in frigorifero a 4°C quando non viene utilizzata.
NOTA: L'amiodarone deve essere preparato all'interno di una cappa aspirante e conservato in frigorifero a 4 °C. Indossare sempre i DPI adeguati.
2. Allevamento ittico
- Mantenere i pesci in vasche individuali collegate ad un sistema di ricircolo dell'acqua, mantenendo la temperatura tra i 28-29°C.
- Garantire un monitoraggio continuo della qualità dell'acqua e rispettare un ciclo giorno-notte di 14 ore/10 ore.
- Dividi i 40 pesci in quattro gruppi, ciascuno composto da 10 pesci, e ospitali in vasche separate.
3. Configurazione del dispositivo
NOTA: La procedura descritta nel passaggio 3.2 deve essere eseguita per ogni camera del dispositivo (Figura 1). Sebbene ogni camera possa essere configurata in modo diverso, per coerenza nell'esperimento, è consigliabile mantenere impostazioni uniformi in tutte le camere.
- Collegare il dispositivo a una fonte di alimentazione e avviare l'operazione premendo il pulsante rosso situato sul pannello frontale.
- Naviga attraverso il touchscreen del dispositivo per scegliere la camera da configurare.
- Regolare l'impostazione del filtro passa-basso su 0,1 Hz e l'impostazione del filtro passa-alto su 500 Hz. Regolare l'impostazione del guadagno su 10.000.
- Sollevare il coperchio anteriore per accedere alle quattro camere. Prima di iniziare l'esperimento, immergere la spugna di ciascuna camera (spugna di cellulosa standard) in una soluzione di tricaina, quindi spremere il liquido in eccesso.
- Ruotare l'array di quattro elettrodi per assicurarsi che la spugna sia accessibile prima di introdurre il pesce.
4. Trattamento con amiodarone
NOTA: Utilizza l'acqua delle vasche dei pesci (acqua dei pesci) per preparare soluzioni diluite di amiodarone e tricaina. I passaggi 4.3 e 4.4 devono essere ripetuti per ogni gruppo separato nel passaggio 2.3 per ogni soluzione preparata nel passaggio 4.1.
- Seguire i passaggi descritti di seguito per diluire la soluzione madre di amiodarone.
- Diluire 8,75 mL di soluzione madre in 41,25 mL di acqua di pesce per ottenere una concentrazione di 70 μM.
- Diluire 12,5 mL di soluzione madre in 37,5 mL di acqua di pesce per ottenere una concentrazione di 100 μM.
- Diluire 25 mL di soluzione madre in 25 mL di acqua di pesce per ottenere una concentrazione di 200 μM.
- Preparare la soluzione per anestesia diluendo 4 ml di soluzione madre di tricaina in 100 ml di acqua di pesce, ottenendo una concentrazione di tricaina di 0,16 mg/ml
- Immergere ogni pesce singolarmente nella soluzione di amiodarone preparata per 5 minuti. Utilizzare i timer per monitorare accuratamente la durata dell'immersione.
- Trasferire il pesce in una soluzione di tricaina per 2-3 minuti per l'anestesia. Assicurarsi che il trattamento non causi la morte del pesce. Se un pesce mostra un comportamento anomalo, come la perdita di colore o una significativa riduzione del movimento delle branchie, rimuoverlo immediatamente dalla soluzione e rimetterlo in acqua pulita.
5. Raccolta dati ECG
NOTA: Segui immediatamente queste istruzioni dopo aver completato il passaggio 4.4. Ripetere il processo per ogni camera prima di sigillare il dispositivo. Le camere sono progettate per ospitare pesci di larghezza compresa tra 4 e 10 mm e 25-50 mm di lunghezza.
- Solleva il pesce dalla soluzione di tricaina e posizionalo sulla spugna, assicurandoti che il suo lato ventrale sia rivolto verso l'alto.
- Posizionare l'array di elettrodi a forma di rombo sopra l'area del torace del pesce per catturare i segnali ECG da quattro punti diversi contemporaneamente (Figura 2A,B). Assicurati di regolare attentamente ogni elettrodo in modo che ogni pin entri in contatto con la pelle del pesce.
- Ruotare ciascun elettrodo, abbassando il perno fino a quando non entra in contatto con la parte inferiore del pesce. Se il perno è troppo alto, ruotare la vite a testa zigrinata corrispondente in senso orario per abbassarlo fino a toccare il pesce.
- Eseguire la regolazione sopra descritta per gli elettrodi in tutte le camere.
- Chiudere il coperchio delle camere una volta che tutti gli array di elettrodi sono posizionati correttamente sopra i pesci nelle camere operative.
- Contrassegnare ciascuna camera per la registrazione selezionandola sul touchscreen, quindi avviare la registrazione facendo clic sul pulsante Registra sullo schermo.
- Fare clic sul pulsante Interrompi dopo 2 minuti, quindi fare clic sul pulsante Salva dalle finestre di prompt che si aprono sullo schermo dopo l'arresto. Salva le informazioni su un disco o sul cloud, a seconda delle specifiche esigenze di ricerca.
6. Risoluzione dei problemi del sistema di posizionamento dell'array di quattro elettrodi
NOTA: Occasionalmente, uno o più elettrodi potrebbero non riuscire a catturare un chiaro segnale ECG, richiedendo il riposizionamento. Utilizzare i seguenti passaggi per risolvere i problemi dell'array di elettrodi quando necessario.
- Premere il pulsante Stop sull'interfaccia del dispositivo per interrompere il processo di registrazione e identificare il canale o i canali con segnali incoerenti.
- Sollevare il coperchio anteriore per accedere alle camere degli elettrodi. Identificare le camere e gli elettrodi specifici che causano problemi.
- Ruotare la vite a testa zigrinata superiore in senso orario per regolare la vicinanza dell'elettrodo al pesce. Questa azione abbasserà l'elettrodo più vicino al pesce.
- Ripetere il passaggio 6.3 secondo necessità. Se il semplice avvicinamento non risolve il problema, ruotare l'elettrodo in un punto diverso del pesce fino a raggiungere un segnale soddisfacente.
7. Estrazione e analisi dei dati
NOTA: Tutta l'analisi dei dati di base presentata in questo documento utilizza la tecnica Wavelet21 per ridurre vari tipi di rumore e deviazione standard dei normali battiti sinusoidali (SDNN) per calcolare la varianza da battito a battito della FC in segmenti di un minuto.
- Una volta che i dati sono stati salvati sul disco o sul cloud, recuperali per l'analisi o inviali direttamente a un server cloud per un'ulteriore elaborazione.
- Passare ai dati salvati facendo clic sul pulsante Sfoglia sullo schermo e selezionare i set di dati da utilizzare.
- Seleziona il pulsante Estrai nelle opzioni sullo schermo e collega un'unità USB alla parte posteriore del dispositivo per estrarre i dati.
- Seguire le istruzioni del dispositivo per salvare i set di dati selezionati sull'unità esterna per il successivo recupero e analisi.
Risultati
La capacità di registrare simultaneamente segnali ECG da più pesci rappresenta una caratteristica distintiva di questo dispositivo, offrendo un vantaggio considerevole nella riduzione del tempo necessario per la ricerca farmacologica o cardiaca su zebrafish o altre specie simili (Figura 1). La registrazione di segnali ECG accurati può risultare difficoltosa a causa delle variazioni anatomiche tra i pesci, specialmente per quanto riguarda il posizionamento degli elettrodi. Tradizionalmente, per ottenere un segnale ECG chiaro è necessario posizionare l'elettrodo attivo sopra il cuore, in modo da evitare la rilevazione di battiti meccanici o artefatti di movimento, mentre l'elettrodo di riferimento viene collocato nella zona dell'addome inferiore. Tuttavia, individuare con precisione la posizione esatta del cuore può essere difficile a causa della sua profondità nei tessuti o della superficie irregolare del pesce. A volte, è necessario manovrare gli elettrodi con micromanipolatori per un posizionamento accurato, il che può richiedere diversi tentativi prima di ottenere un segnale di qualità.
Per superare queste sfide, il sistema introduce un approccio innovativo utilizzando una configurazione di quattro elettrodi invece dei tradizionali elettrodi singoli. Ogni elettrodo funziona in modo indipendente, consentendo regolazioni in tre dimensioni: su e giù (heave), inclinazione in avanti e indietro (pitch) e rotazione attorno all'asse verticale (roll). Questa flessibilità si rivela particolarmente utile quando si lavora con pesci di forme diverse, poiché permette un posizionamento preciso degli elettrodi al fine di ottenere il segnale ECG ottimale o esplorare come le letture ECG variano in base ai diversi punti di contatto sul pesce.
Questa caratteristica non solo aumenta l'efficienza degli studi cardiaci e farmacologici, ma amplia anche le possibilità per le tecniche di registrazione dell'ECG e addirittura dell'ECG. Considerando che questi metodi non sono ancora stati standardizzati e spesso vengono personalizzati per adattarsi alle condizioni specifiche del soggetto sperimentale, questo dispositivo apre nuove strade alla ricerca, offrendo metodi di raccolta dati più flessibili e affidabili (Figura 2).
Una delle caratteristiche distintive di questo sistema è la sua capacità di valutare fino a quattro farmaci diversi contemporaneamente su quattro pesci separati oppure di esaminare gli effetti di fino a quattro dosi diverse di un singolo farmaco su quattro pesci distinti. Il disegno sperimentale può variare da un'esposizione acuta breve fino a sessioni più lunghe della durata di 1 h, con dosi variabili del farmaco o modifiche delle condizioni ambientali come temperatura e anestesia. In questo studio, abbiamo condotto un esperimento breve per dimostrare l'efficacia del metodo, evidenziando in particolare il funzionamento dell'array a quattro elettrodi. Abbiamo testato tre dosi diverse di amiodarone, un farmaco antiaritmico di classe III noto per indurre bradicardia e prolungare l'intervallo QT nel pesce zebra, per un periodo di esposizione di 5 min, simile a uno studio precedente20 che ha utilizzato il primo prototipo di questo dispositivo.
In linea con ricerche precedenti, i pesci hanno mostrato sia un allungamento dell'intervallo QTc sia una riduzione della frequenza cardiaca rispetto al gruppo di controllo non trattato. Nonostante il breve tempo di esposizione, più breve rispetto a molti studi comparabili che si estendono fino a 1 h, siamo stati in grado di osservare alterazioni significative nei segnali dell'ECG e nei parametri cardiaci (Figura 3).
In che modo il trattamento con Amiodarone abbia indotto modifiche osservabili nell'ECG, aumentate con la crescita della dose, è illustrato in Figura 3A,B. In particolare, l'intervallo QTc si è allungato con ogni incremento successivo della dose rispetto al gruppo di controllo, che presentava un intervallo QTc di 330 ms. Nei gruppi trattati, gli intervalli QTc sono stati misurati a 365 ms con 70 µM di Amiodarone, 480 ms con 100 µM e 546 ms con 200 µM. Corrispondentemente, si è osservata una riduzione significativa della frequenza cardiaca in risposta alle diverse dosi di Amiodarone e agli intervalli QTc prolungati. La frequenza cardiaca è diminuita notevolmente da una media di 120 ±5 BPM nel gruppo di controllo a 105 ±10 BPM con 70 µM di Amiodarone, 90 ±5 BPM con 100 µM e 84 ±5 BPM con 200 µM (Figura 3C,D).
Sulla base di questi risultati, possiamo concludere che la nuova tecnica proposta dimostra una qualità paragonabile a quella di studi precedenti17,18, utilizzando un approccio a due elettrodi (un elettrodo di lavoro e un elettrodo di riferimento). Siamo riusciti a raccogliere dati da quattro elettrodi di lavoro, selezionandone uno ottimale per l'analisi, al fine di riportare i parametri cardiaci previsti. I criteri di selezione sono in linea con quelli dei metodi precedenti, con particolare attenzione alla chiara visualizzazione del complesso PQRST e a un rumore di base ridotto nel segnale ECG. Questo consente il calcolo degli intervalli QT e QTc e facilita l'individuazione di differenze evidenti. Inoltre, la metodologia è stata ulteriormente validata tramite test effettuati da altri tre ricercatori del nostro gruppo che non avevano partecipato allo sviluppo del dispositivo attuale. Essi hanno inizialmente applicato la metodologia preliminare suggerita dai progettisti e successivamente hanno proposto modifiche sulla base del loro feedback, portando al perfezionamento dell'approccio qui presentato. Questo processo iterativo di miglioramento si è rivelato fondamentale per ottimizzare il dispositivo, sfruttando le osservazioni di ricercatori esterni al fine di renderlo più intuitivo e efficace per future applicazioni.
Questo breve studio sulla risposta ai farmaci evidenzia l'efficienza del dispositivo non solo nel registrare contemporaneamente ECG da quattro pesci diversi in condizioni differenti, ma anche nel catturare più segnali (quattro) per singolo pesce. Questa capacità multifattoriale riduce in modo significativo il tempo e lo sforzo necessari per il posizionamento degli elettrodi e minimizza la probabilità di errori umani fornendo una selezione di segnali. Tale scelta permette di selezionare il segnale più accurato oppure di aggregare i dati provenienti da più segnali in base all'obiettivo dello studio. Tuttavia, è importante chiarire che l'utilizzo della configurazione a quattro elettrodi non garantisce automaticamente che tutti e quattro i segnali siano puliti e di alta qualità. L'obiettivo principale dell'introduzione di questa caratteristica innovativa è ridurre gli errori umani e risparmiare tempo consentendo quattro registrazioni contemporanee anziché sequenziali, risultando così più efficiente in termini di tempo e meno stressante per i pesci, considerata la loro tolleranza limitata al tempo trascorso fuori dall'acqua e sotto anestesia.
Figura 1: Sistema Zebra II. (A) Vista isometrica del dispositivo Zebra II (modello SolidWorks) con componenti indicati. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Posizionamento degli elettrodi sulle zebrafish. (A) Gradi di libertà del supporto a quattro punti per gli elettrodi (immagine concettuale). (B) Posizionamento degli elettrodi sul torace del pesce. (C) Segnale ECG ottenuto dal supporto a quattro punti per gli elettrodi (canali 1-4). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Effetti dell'esposizione acuta all'amiodarone (segnali ECG). (A) Dati rappresentativi di ECG ottenuti dal sistema e loro variazione nei parametri ECG in seguito a diverse concentrazioni di amiodarone. (B) Modifiche dell'ECG in seguito all'esposizione all'amiodarone. (C) Istogramma che descrive la differenza nella frequenza cardiaca (HR). (D) Istogramma che descrive la differenza nell'intervallo QTc nei dati ECG con diverse concentrazioni di amiodarone. *p<0.05 (analisi della varianza ad un fattore con test di Tukey). Le barre di errore indicano la deviazione standard. Questa figura è stata modificata da20. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussione
I passaggi attuali sono stati modificati e migliorati in base a questa nuova versione del dispositivo da uno studio precedente condotto dal nostro team20. Qui è inclusa anche una progettazione assistita da computer (CAD) etichettata del dispositivo.
Come evidenziato nella guida alla risoluzione dei problemi del protocollo, il dispositivo richiede all'utente di eseguire alcuni passaggi critici con diligenza e precisione, poiché questi passaggi influiscono in modo cruciale sulla qualità del segnale ECG. Coerentemente con i risultati del nostro precedente studio20, il posizionamento degli elettrodi gioca un ruolo significativo nell'acquisizione di letture ECG chiare e di alta qualità da campioni di zebrafish. Grazie a questo metodo, che amplia il numero di elettrodi di lavoro da uno a quattro e introduce ulteriori gradi di libertà, richiede ulteriori passaggi di risoluzione dei problemi e un posizionamento raffinato degli elettrodi sull'area ventrale del pesce per ottenere risultati ottimali.
I vantaggi e le nuove caratteristiche del dispositivo risiedono nella misurazione estesa per esperimenti in più fasi, studi limitati a un'ora, screening ad alta produttività con più zebrafish (quattro studi simultanei), configurazione dell'esperimento altamente controllabile, registrazioni elettrofisiologiche aggiuntive per campione (fino a quattro) e analisi e archiviazione automatizzate dei dati basate su cloud. Da ciò, vorremmo sottolineare che la questione principale da affrontare è il tempo necessario per eseguire lo screening farmacologico e gli studi cardiaci nel pesce zebra, poiché i metodi tradizionali richiedono uno screening uno per uno e più studi per raccogliere informazioni sufficienti22. Ciò offre anche un nuovo modo di utilizzare gli array multicanale per registrare l'ECG in modo più semplice rispetto a quelli che utilizzano array di microelettrodi (MEA) o circuiti stampati flessibili (FPCB)18 che richiedevano passaggi aggiuntivi nella fabbricazione degli elettrodi menzionati più la procedura necessaria per collegarli al pesce rispetto al metodo proposto che si basa anche sul contatto superficiale ma in modo meno invasivo.
I limiti del sistema non sono diversi da quelli presentati nei metodi tradizionali19,20, ma sono meno intensivi in quanto viene utilizzato un array multicanale per ridurre il numero di prove di registrazione necessarie per lo studio. Queste limitazioni si basano sul posizionamento dell'elettrodo, in quanto si consiglia di seguire il posizionamento proposto presentato nella Figura 2B. Deve anche essere chiaro che l'utente non può aspettarsi di avere registrazioni perfette durante la prima prova sui quattro canali, poiché le differenze anatomiche dei pesci e la pre-elaborazione del campione (desquamazione, procedure a torace aperto, ecc.) influenzeranno direttamente la qualità e il successo dei test.
Dichiarazioni
Hung Cao e Michael Lau sono i fondatori di Sensoriis, Inc. Il sistema Zebra II di Sensoriis è stato sviluppato con il supporto del NIH, con sovvenzione SBIR Phase II #R44OD024874. L'Università della California, Irvine, ha esaminato e approvato il rapporto di Hung Cao con Sensoriis, Inc. in conformità con le sue politiche in materia di conflitto di interessi. Gli altri autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Siamo grati per il supporto da parte del NIH SBIR Fase II #R44OD024874 a H.C. e M.P.H.L. Gli autori desiderano anche riconoscere il sostegno finanziario fornito dal Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologias (CONAHCYT) in Messico attraverso la borsa di studio intitolata Beca CONAHCYT Para Estudios de Doctorado en el Extranjero.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Amiodarone cloridrato | Sigma-Aldrich | PHR1164-1G | Polvere di amiodarone |
| Misuratore di pH/mV da banco | Sper Scientific | 10500308 | |
| Etilene3-amminobenzoato, sale dell'acido metansolfonico, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC118002500 | Tricaina in polvere |
| Agitatore a piastra calda Isotemp | Fisher Scientific | SP88854200 | |
| Sistema Zebra II | Sensoriis | N/A | Sistema di registrazione ECG commerciale Zebrafish |
| Sistema ECG Zebrafish | iWorx | ZS-200 | Sistema di registrazione ECG commerciale Zebrafish |
Riferimenti
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