Articolo di ricerca

Migliorare i risultati degli studenti con un'esperienza di ricerca universitaria basata su corsi di clonazione molecolare adattabile

DOI:

10.3791/67067

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15 novembre 2024

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1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, 2Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un modulo di clonazione molecolare adattabile di Gibson Assembly è stato impiegato in un formato di esperienza di ricerca universitaria (CURE) basato su corsi per studenti di laboratori di biologia molecolare. La valutazione dei risultati di apprendimento degli studenti ha mostrato una migliore comprensione e fiducia nella clonazione molecolare dopo il completamento del CURE e nuovi plasmidi sono stati clonati per la ricerca sulla biosintesi di prodotti naturali.

Abstract

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Il continuo progresso delle tecniche di biologia molecolare richiede che i curricula di biologia molecolare siano regolarmente perfezionati per preparare efficacemente gli studenti a entrare nel mondo del lavoro con competenze moderne. In particolare, l'emergere del Gibson Assembly, una tecnica di clonazione molecolare altamente personalizzabile e adattiva, ha fatto progredire il panorama della clonazione molecolare in numerosi ambienti di ricerca. Pertanto, abbiamo creato un modulo di clonazione Gibson Assembly per l'implementazione in un corso di laboratorio di biologia molecolare presso la California Polytechnic State University, San Luis Obispo e abbiamo valutato i risultati di apprendimento degli studenti dal modulo. Nel corso di tre iterazioni del corso, gli studenti hanno partecipato a un progetto indipendente basato su esperimenti che prevedeva la clonazione di tre librerie di plasmidi uniche per supportare progetti di ricerca sulla biosintesi di prodotti naturali. Agli studenti sono stati somministrati questionari pre e post per valutare la loro comprensione della clonazione molecolare e la loro fiducia nei termini e nelle tecniche di biologia molecolare. Le risposte degli studenti hanno mostrato un aumento significativo sia nell'apprendimento dei concetti di clonazione molecolare che nella fiducia auto-riferita con i termini e le tecniche di clonazione molecolare. Questo framework di moduli può essere generalizzato per insegnare a Gibson Assembly varie applicazioni, fornendo agli istruttori un toolkit per insegnare una tecnologia di clonazione adattabile ed emergente mentre avanzano i loro progetti di ricerca.

Introduzione

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La formazione degli studenti universitari nei concetti fondamentali della biologia molecolare e nelle tecniche di laboratorio è fondamentale per il loro sviluppo scientifico e professionale poiché queste metodologie sono comuni in vari contesti di ricerca, tra cui il mondo accademico e l'industria. Pertanto, gli studenti di biologia (concentrazione di biologia molecolare e cellulare) e biochimica presso la California Polytechnic State University, San Luis Obispo (Cal Poly) sono tenuti a seguire un corso di laboratorio di biologia molecolare di divisione superiore per apprendere e applicare questi argomenti (CHEM / BIO 475). Un curriculum di base per questo corso è stato precedentemente sviluppato in cui gli studenti eseguono il clonaggio a base di topoisomerasi (TOPO) per assemblare un plasmide contenente actina preparato da un modello di DNA complementare di lievito (cDNA)1. Gli studenti progettano esperimenti basati su domande che imitano ipotesi di ricerca autentiche, aumentando la loro familiarità con le pratiche di laboratorio e l'apprendimento basato sull'indagine. Il continuo progresso nel campo della biologia molecolare richiede che i curricula corrispondenti si adattino per preparare gli studenti con competenze moderne per la forza lavoro. In particolare, l'uso dell'Assemblea di Gibson è diventato più predominante nella comunità scientifica; mentre il metodo è stato originariamente stabilito per sintetizzare cromosomi artificiali2, oltre 5.000 pubblicazioni al momento di questo rapporto hanno fatto riferimento al lavoro originale di Gibson et al. Gibson Assembly è unico rispetto alle metodologie di clonazione tradizionali: è altamente personalizzabile e può facilmente legare più frammenti di DNA lineare senza la necessità di siti di restrizione per produrre le giunzioni. Pertanto, abbiamo visto l'opportunità di rinnovare il curriculum CHEM/BIO 475 per incorporare le moderne tecniche di clonazione molecolare e migliorare il modello di corso basato sull'indagine.

È stato stabilito che le esperienze di ricerca degli studenti contribuiscono ad aumentare la comprensione concettuale, lo sviluppo delle competenze e la persistenza nella scienza3, ma non tutti gli studenti universitari hanno l'opportunità di partecipare direttamente a un laboratorio di ricerca. Per affrontare la sfida della limitata capacità degli studenti nei laboratori di ricerca, sono state sviluppate e impiegate esperienze di ricerca universitaria basate su corsi (CURE) per aumentare l'accessibilità della scienza attraverso una ricerca autentica in classe. Sebbene le CURE varino nella loro attuazione, sono state stabilite pratiche comuni che affrontano i cinque principi della ricerca scientifica. In un CURE ben progettato, gli studenti 1) utilizzeranno pratiche scientifiche, 2) collaboreranno a un progetto di ricerca, 3) tenteranno di fare nuove scoperte, 4) contribuiranno a un lavoro rilevante al di fuori della classe e 5) rivaluteranno e rivedranno ipotesi e metodi in caso di fallimento sperimentale4. Analogamente alle tradizionali esperienze di ricerca degli studenti in laboratorio, è stato dimostrato che le CURE rafforzano la fiducia degli studenti nella scienza, nelle competenze scientifiche, nella proprietà del progetto e nella persistenza in scienza, tecnologia, ingegneria e matematica (STEM)5. Mentre le CURE che coinvolgono il clonaggio molecolare sono state riportate in precedenza 6,7,8,9,10,11,12,13, non siamo a conoscenza di alcuna che enfatizzi l'adattabilità di Gibson Assembly per creare una libreria di autentica ricerca plasmidi.

Qui, riportiamo un'espansione dell'attuale curriculum CHEM/BIO 475 basato sull'indagine presso la California Polytechnic State University, San Luis Obispo con due importanti miglioramenti: l'esperienza pratica con Gibson Assembly e la partecipazione degli studenti a un CURE, che ha fornito costrutti plasmidi originali per progetti di ricerca finanziati dalla National Science Foundation (NSF-1708919 e NSF-2300890). Nel corso di tre implementazioni di questo curriculum, gli studenti hanno contribuito a due distinti progetti di ricerca incentrati sulla biosintesi di prodotti naturali di molecole bioattive prodotte da Actinomycetota. I prodotti naturali contengono spesso farmacofori con attività antibiotiche, antimicotiche e/o antitumorali, conferendo a queste piccole molecole importanza negli sforzi di scoperta di farmaci e potenziale di rilevanza clinica14. Questa ricerca richiede la creazione di librerie di plasmidi per consentire lo studio della funzione e del potenziale ingegneristico degli enzimi biosintetici batterici. In questo CURE, gli studenti hanno progettato ed eseguito esperimenti di Gibson Assembly per clonare le librerie di plasmidi uniche pertinenti a questi progetti di ricerca (Figura 1). Inoltre, il formato e il design del modulo si distinguono perché è facilmente adattabile per generare qualsiasi plasmide di interesse per altri progetti di ricerca.

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Figura 1: Panoramica del ruolo di Gibson Assembly nel nostro laboratorio di ricerca. Gli actinomycetota producono prodotti naturali a piccole molecole con bioattività clinicamente rilevanti utilizzando cluster genici che codificano enzimi biosintetici. Nella nostra ricerca, i plasmidi contenenti un gene biosintetico vengono assemblati tramite Gibson Assembly per indagini a valle sulla funzione dell'enzima codificato. Icone scientifiche da Biorender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Panoramica del laboratorio

Il laboratorio di biologia molecolare è un corso di divisione superiore richiesto per le major di biochimica e biologia con una concentrazione di biologia molecolare e cellulare. Altri studenti che soddisfano i prerequisiti sono invitati a seguire il corso come elettivo di divisione superiore. Il corso è co-elencato tra il Dipartimento di Chimica e Biochimica e il Dipartimento di Biologia di Cal Poly. I docenti di entrambi i dipartimenti si alternano nell'insegnamento del corso ogni trimestre (due trimestri di Biologia, un quarto di Chimica e Biochimica).

La classe si riunisce in laboratorio due volte alla settimana per periodi di 170 minuti e una volta alla settimana per una lezione di 50 minuti. Le sezioni di laboratorio contengono un massimo di 16 studenti e ogni trimestre vengono offerte 2-3 sezioni di laboratorio. Il corso dura 10 settimane e l'esame finale viene somministrato durante l'ultimo incontro della settimana 10. Il tempo della lezione è dedicato alla discussione della teoria alla base di molte delle tecniche sperimentali condotte in laboratorio, nonché di argomenti attuali in biologia molecolare che non sono trattati in laboratorio. Il curriculum di base del laboratorio comprende il processo di clonazione del gene dell'actina dal lievito1, che richiede circa 7 settimane (13-14 incontri di laboratorio). Le tecniche includono il micropipettaggio, l'isolamento dell'RNA del lievito, l'amplificazione di un gene del lievito mediante la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR), il clonaggio topografico, lo screening blu-bianco, l'isolamento del plasmide e la verifica dell'inserto mediante restriction digest e PCR, l'analisi in silico dei cloni e l'analisi della sequenza del DNA. Il curriculum per le ultime 3 settimane del corso è a discrezione dell'istruttore ma prevede che gli studenti completino un "progetto indipendente" con risultati indefiniti.

Panoramica dell'esperimento

Uno degli obiettivi del nostro gruppo di ricerca sono le vie biosintetiche in Actinomycetota. Durante la progettazione del progetto indipendente, abbiamo immaginato che gli studenti creassero plasmidi attraverso Gibson Assembly da utilizzare nei nostri progetti di ricerca che studiano la biosintesi di prodotti naturali. Mentre le iterazioni del modulo del corso qui valutate erano specifiche per i plasmidi che consentono la manipolazione di percorsi biosintetici, il flusso di lavoro di Gibson Assembly è enormemente adattabile per altri progetti di clonaggio molecolare (Figura 2). Il flusso di lavoro è stato suddiviso in tre diversi esperimenti (A, B e C) che sono stati completati in due periodi di lezione e sei periodi di laboratorio (3 settimane in totale) (vedi File supplementare 1 e File supplementare 2). Gli esperimenti sono stati preceduti da fogli di lavoro per supportare la preparazione degli studenti e valutare la comprensione degli studenti (File supplementare 3, File supplementare 4 e File supplementare 5). Il flusso di lavoro viene presentato in un formato flessibile in base alle esigenze e agli interessi dell'insegnante.

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Figura 2: Flusso di lavoro del modulo Gibson Assembly. Il Giorno 1 e il Giorno 4 sono periodi di lezione in cui gli studenti completano l'analisi di sequenze in silico e la progettazione sperimentale. I giorni 2-3 e 5-8 sono riunioni di laboratorio in cui vengono condotte le fasi per clonare nuovi plasmidi tramite Gibson Assembly, seguite dall'isolamento e dallo screening. Il diagramma di flusso pittorico è raggruppato in base ai tre esperimenti eseguiti dagli studenti (A, B e C). Istruzioni e protocolli più dettagliati sono disponibili nei manuali dell'istruttore e dello studente forniti rispettivamente come File supplementare 1 e File supplementare 2 . Icone scientifiche da Biorender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il modulo di progetto indipendente Gibson Assembly è stato testato per la prima volta nel trimestre primaverile del 2019 in CHEM/BIO 475. Nel 2020 e nel 2021, il corso è stato tenuto online a causa della pandemia di SARS-CoV-2. Quando l'istruzione in presenza è ripresa nella primavera del 2022 e del 2023, gli studenti del corso sono stati invitati a partecipare a uno studio che valutava i risultati dell'apprendimento di un progetto indipendente Gibson Assembly in cui sarebbero stati clonati plasmidi originali e rilevanti per la ricerca. Nel 2019, gli studenti hanno creato una libreria di plasmidi costituita da cassette geniche del genoma di Micromonospora echinospora ATCC 15837 che sono state clonate in pKC1132 (Figura 3). Questa libreria di plasmidi viene utilizzata nel nostro laboratorio di ricerca per inattivare geni di interesse in un presunto cluster di geni biosintetici per il prodotto naturale TLN-0522015. Per completare i nostri studi sull'inattivazione genica, nel 2022 gli studenti hanno clonato una piccola libreria di geni dal presunto cluster genico TLN-05220 in pUC19 (figura3); Il nostro gruppo di ricerca ha utilizzato questi plasmidi per il subclonaggio di geni in vettori di espressione, tra cui pET28b, per la sovraespressione e la purificazione delle proteine. Gli studenti della coorte 2023 hanno contribuito al lavoro in corso su un progetto di ingegneria biosintetica sull'epoxomicina sintetasi16. In team di 3-4 persone, gli studenti hanno clonato domini ingegnerizzati di moduli di peptide sintetasi17 non ribosomiale in vari vettori di espressione proteica per ottimizzare la sovraespressione e la purificazione di questi enzimi nel nostro laboratorio di ricerca (Figura 3). La ridondanza è stata integrata nel piano di clonazione per ciascuna coorte. Ad esempio, la coorte del 2019 conteneva 44 studenti e 15 plasmidi sono stati assegnati alla classe per la clonazione. Così, la clonazione di ciascun plasmide è stata tentata due o tre volte.

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Figura 3: Riepilogo dei plasmidi clonati e degli studenti partecipanti durante le iterazioni di progetti indipendenti del 2019, 2022 e 2023. Il progetto Gibson Assembly è stato implementato tre volte. In ogni offerta, gli studenti partecipanti hanno clonato una diversa libreria di plasmidi da utilizzare in progetti di ricerca che esplorano percorsi biosintetici. I progetti del 2019 e del 2022 hanno sostenuto il nostro lavoro in corso sul prodotto naturale TLN-0522015 con due reazioni di assemblaggio Gibson in frammenti (una cassetta genica o un gene e un vettore). Il progetto del 2023 prevedeva lo scambio di domini all'interno dei moduli 1 e 2 di un enzima peptide sintetasi non ribosomiale (NRPS) coinvolto nella biosintesi dell'epoxomicina16. I frammenti tratteggiati rappresentano due diversi mutanti del dominio scambiato, mentre i colori solidi rappresentano i domini che non sono stati scambiati. In totale, sono stati generati otto diversi frammenti genici (quattro per il modulo 1 e quattro per il modulo 2) con sporgenze compatibili per il Gibson Assembly. Per ogni modulo, sono state assemblate due diverse combinazioni di tre frammenti genici con uno dei due diversi vettori (pBAD33 e pET28, quattro frammenti totali per assemblaggio), per generare otto plasmidi NRPS ingegnerizzati. Icone scientifiche da Biorender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Panoramica della valutazione

Almeno 1 settimana prima dell'inizio del progetto indipendente Gibson Assembly, gli studenti delle coorti 2022 e 2023 sono stati invitati a partecipare a un'indagine sui risultati dell'apprendimento, progettata in modo simile a uno studio condotto in un corso di laboratorio di biochimica presso Cal Poly18. Gli studenti partecipanti hanno completato un pre-questionario a scelta multipla durante la riunione di laboratorio prima dell'inizio del progetto indipendente e un post-questionario a scelta multipla durante la riunione finale di laboratorio (cioè dopo aver completato il modulo Gibson Assembly). I questionari pre e post consistevano in 28 domande identiche con due domande aggiuntive nel post-questionario (30 in totale). Sono state scritte dieci domande di contenuto per valutare la conoscenza degli studenti degli enzimi e dei meccanismi coinvolti nel clonaggio molecolare (ad esempio, reazione a catena della polimerasi [PCR], assemblaggio di Gibson, trasformazione, screening blu-bianco). Le sette domande seguenti hanno chiesto agli studenti di autovalutare la loro familiarità con i termini di clonazione molecolare (ad esempio, DNA polimerasi, esonucleasi, ligasi). Le successive 10 domande hanno permesso agli studenti di autovalutare la loro capacità di eseguire tecniche di clonaggio molecolare (ad esempio, analisi della sequenza del DNA, reazioni di digestione di restrizione, elettroforesi su gel di agarosio). Gli studenti hanno anche riferito se si sentirebbero a proprio agio nel perseguire una carriera in biologia molecolare basata sulla loro conoscenza delle tecniche di clonazione molecolare. Due domande aggiuntive sono state incluse nel post-questionario per consentire agli studenti di autovalutare il loro impegno nell'apprendimento durante il corso e se il corso è stato un'esperienza di apprendimento preziosa (Supplemental File 6 e Supplemental File 7). Tutti i dati delle risposte al questionario pre e post questionario degli studenti del 2022 e del 2023 sono stati combinati per l'analisi e sono disponibili nella Tabella supplementare S1.

Protocollo

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Gli studi che hanno coinvolto partecipanti umani sono stati esaminati e approvati da soggetti umani nel Research Institutional Review Board di Cal Poly (2022-113-CP (IRB)). I partecipanti hanno fornito il loro consenso informato scritto per partecipare a questo studio.

Il seguente protocollo delinea la preparazione dell'istruttore (passaggi 1.1-1.3), le azioni degli studenti per un modulo didattico a tre esperimenti che include la PCR per ottenere frammenti lineari (passaggi 2.1-2.7), l'assemblaggio, la trasformazione e la selezione di cloni di Gibson (passaggi 3.1-3.5), l'isolamento e lo screening dei plasmidi (passaggi 4.1-4.4) e la valutazione dei risultati di apprendimento (5.1-5.2). La preparazione dell'istruttore descrive un esempio rappresentativo di progettazione di primer e preparazione di una mappa plasmidica desiderata in silico. Tutte le sezioni del protocollo sono adattabili ad altri plasmidi desiderati. Ogni esperimento degli studenti è diviso in due incontri di laboratorio di 3 ore.

1. Preparazione dell'istruttore

  1. Progettazione di primer di Gibson Assembly utilizzando la procedura guidata di assemblaggio Benchling
    1. Determinare la fonte del modello di DNA per gli inserti genici, come il DNA genomico, il plasmide e il DNA sintetico.
      NOTA: Per i geni che saranno amplificati da modelli di DNA genomico complessi, si consiglia di determinare prima i siti di legame unici per i primer all'interno del modello di DNA genomico che sono specifici per il gene o i geni di interesse, utilizzando il National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)21, come dettagliato nel File supplementare 1. Per modelli semplici come plasmidi o DNA sintetico, procedi al passaggio successivo.
    2. Recuperare le sequenze di DNA dell'inserto genico e del vettore (ad esempio, vedere la sequenza genica della polichetide idrossilasi e la sequenza pUC19 fornite come file GenBank nel file supplementare 8). Importa la sequenza di inserimento desiderata e la sequenza vettoriale desiderata in Benchling, ciascuna come un nuovo file di sequenza di DNA. Aprire ogni sequenza importata da includere nella reazione di assemblaggio Gibson.
      NOTA: È possibile importare file di sequenze di DNA in diversi formati, tra cui GenBank e FASTA. Si può anche importare una sequenza direttamente da un database con un numero di accesso o incollare una sequenza nucleotidica copiata da un altro file o visualizzatore.
    3. Nella parte inferiore dello schermo, individuare lo strumento Assembly Wizard . Fare clic su Creazione guidata assemblaggio, quindi selezionare Crea nuovo assemblaggio. Dalle opzioni fornite, selezionate Gibson e fate clic su Avvia per iniziare l'assemblaggio.
    4. Nella finestra della sequenza vettoriale , selezionare tutte le basi da includere nell'assieme dalla spina dorsale vettoriale. Iniziare la selezione in corrispondenza della posizione nucleotidica all'estremità 3' dell'inserto genico (ad esempio, la posizione 657 di pUC19) e selezionare tutti i nucleotidi rimanenti da includere (ad esempio, attraverso la posizione 656 per includere l'intera sequenza di pUC19). Una volta selezionato, fai clic sulla scheda Backbone nella parte inferiore dello schermo| Imposta frammento.
      NOTA: Alterna tra la visualizzazione della mappa di sequenza e quella del plasmide del vettore per selezionare tutte le basi desiderate di un modello circolare. In alternativa, se si prevede di preparare il frammento vettoriale tramite digest di restrizione (invece della PCR) per l'assemblaggio di Gibson, linearizzare la sequenza della spina dorsale con un sito di taglio dell'enzima di restrizione (ad esempio, XbaI). A tale scopo, fare clic sul sito di taglio, tenere premuto Maiusc e fare nuovamente clic sul sito di taglio . Quindi fare clic su Imposta frammento per impostare la spina dorsale. Tenere presente che i primer specifici del vettore non verranno generati da Benchling se la spina dorsale viene linearizzata con un enzima di restrizione nella procedura guidata di assemblaggio.
    5. Nella finestra della sequenza di inserimento , selezionare tutte le basi dell'inserto da includere nell'assieme. Una volta selezionato, fai clic sulla scheda Inserisci nella parte inferiore dello schermo | Imposta frammento.
    6. In caso di più inserimenti genici, fare clic sul pulsante + sul lato destro della procedura guidata di assemblaggio. Nella finestra della sequenza di inserimento , selezionare tutte le basi di inserimento da includere nell'assieme. Una volta selezionato, fai clic sulla scheda Inserisci nella parte inferiore dello schermo | Imposta frammento.
    7. Una volta impostati tutti i frammenti, rinominare l'assieme con il nome del plasmide desiderato e fare clic su Assembla a destra della procedura guidata di assemblaggio. Selezionate la posizione della cartella desiderata sia per la cartella Sequenza che per la cartella Primer. Fare clic su Crea per assemblare la sequenza plasmidico ricombinante.
    8. Aprire il plasmide assemblato e fare clic su Cronologia assemblaggi per visualizzare una mappa plasmidica di base e una panoramica delle sequenze da cui è stata derivata. Assicurarsi che le posizioni dei nucleotidi per ogni frammento corrispondano al design desiderato.
    9. Nella scheda Parametri assieme , visualizzare i nomi dei primer progettati per l'assieme. Si noti che ci saranno due primer progettati per ogni inserto (uno in avanti e uno in retro), e i nomi dei primer saranno derivati dai titoli dei file di sequenza del DNA. Assicurarsi inoltre che le temperature di fusione del primer e le temperature di ricottura suggerite siano compatibili in questa finestra (vedere File supplementare 8, Primer rappresentativi).
      1. Se le temperature di fusione o di ricottura del primer non sono ideali, regolare manualmente le sequenze di primer (ad esempio, rimuovendo i nucleotidi per ridurre la temperatura di fusione) all'interno dei file della sequenza di primer. In alternativa, fare clic su Riapri e regolare le impostazioni del primer facendo clic sul pulsante Impostazioni enzima/primer accanto al pulsante Assembla nella procedura guidata di assemblaggio. Quindi, ripetere la fase di assemblaggio e riesaminare le sequenze di primer.
      2. Se una libreria di plasmidi deve essere clonata con molti geni diversi clonati nella stessa spina dorsale vettoriale,
      3. Utilizzare la stessa coppia di primer per il vettore in ogni caso. Per fare ciò, rimuovere manualmente tutti i nucleotidi dai primer vettoriali che installerebbero le sporgenze specifiche dell'inserto. Questi nucleotidi si troverebbero all'estremità 5' dell'innesco. Dopo la rimozione, assicurarsi che le temperature di fusione del primer e le temperature di ricottura siano compatibili (vedere File supplementare 8, Primer rappresentativi).
      4. Assicurarsi che tutte le coppie di primer dell'inserto abbiano temperature di fusione e temperature di ricottura molto simili.
        NOTA: Ciò ridurrà la necessità di ottimizzare la temperatura di ricottura di ogni coppia e consentirà di eseguire contemporaneamente il ciclo di tutte le reazioni PCR degli studenti utilizzando lo stesso programma di termociclatore.
    10. Una volta completata la progettazione del primer per i plasmidi desiderati, fare clic su Finalizza nella procedura guidata di assemblaggio. Ordina i primer da un'azienda di sintesi del DNA e recupera i campioni dei modelli di DNA per inserti e vettori.
    11. Testare le coppie di primer specifici per l'inserto e il vettore per ottenere temperature di ricottura ottimali utilizzando un esperimento di PCR in gradiente con i modelli di DNA. Testare inizialmente le temperature di ricottura consigliate da Benchling ± 3 °C.
    12. Una volta determinate le temperature di ricottura, creare aliquote di soluzioni di primer, modelli di DNA e reagenti necessari per le reazioni PCR per gli studenti.
  2. Prima degli esperimenti, fornisci agli studenti dei fogli di lavoro per supportare la preparazione e valutare la comprensione (Supplemental File 4, Supplemental 5 e Supplemental 6).
  3. Raccolta di dati sui risultati dell'apprendimento
    NOTA: Se sei interessato a raccogliere i dati sui risultati dell'apprendimento dal modulo Gibson Assembly e a pubblicare i risultati, ottieni l'approvazione per la ricerca con soggetti umani secondo le politiche dell'istituto.
    1. Invitare gli studenti a partecipare a un'indagine sui risultati dell'apprendimento almeno 1 settimana prima dell'inizio del progetto indipendente Gibson Assembly.
    2. Chiedi agli studenti partecipanti di completare il pre-questionario a scelta multipla (File supplementare 6) durante l'incontro di laboratorio prima dell'inizio del progetto indipendente.

2. Esperimento A: PCR per ottenere frammenti lineari

  1. Ottieni primer e soluzioni di DNA stampo per la PCR dall'istruttore.
  2. Pipettare reazioni da 25 μL tra cui DNA polimerasi MasterMix, DNA stamp, primer diretti e inversi e acqua priva di nucleasi secondo le istruzioni del manuale dello studente (vedere il file supplementare 2).
  3. Ciclica la reazione in un termociclatore secondo il manuale dello studente nel File supplementare 2. Assicurarsi che la temperatura di ricottura della reazione sia appropriata per gli inneschi e che il tempo di prolungamento sia appropriato per la lunghezza dell'amplicone desiderato. Per istruzioni dettagliate, fare riferimento a File supplementare 2 e File supplementare 3 .
  4. Conservare le reazioni PCR a 4 °C o -20 °C fino al successivo periodo di laboratorio.
  5. Analizzare 5 μL di ciascuna reazione tramite elettroforesi su gel di agarosio. Mentre il gel è in funzione, aggiungere 1 μL di enzima di restrizione DpnI a ciascuna reazione che ha utilizzato il DNA plasmidico come modello. Incubare questa miscela per 1 ora a 37 °C.
    NOTA: Il DpnI degraderà qualsiasi stampo di DNA plasmidico circolare rimasto, rendendo meno probabile l'ottenimento di falsi positivi nella fase di trasformazione.
  6. Eseguire l'imaging del gel per confermare che la PCR ha avuto successo e che è stata raggiunta l'amplificazione corretta. Purifica qualsiasi reazione PCR riuscita con un kit di purificazione PCR disponibile in commercio. Misurare la concentrazione (ng/μL) del prodotto PCR purificato utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi da utilizzare nei successivi calcoli di assemblaggio Gibson.
  7. Prima della prossima riunione di classe, progetta la ricetta di reazione per l'assemblaggio di Gibson (vedi File supplementare 2 e File supplementare 4).

3. Esperimento dello studente B: Assemblaggio, trasformazione e selezione di cloni di Gibson

  1. Pipettare la reazione di assemblaggio Gibson secondo la ricetta progettata. Incubare la reazione a 50 °C per 15 minuti. Mentre le reazioni incubano, preparatevi alla trasformazione scongelando cellule di Escherichia coli chimicamente competenti su ghiaccio.
  2. Trasformare 2 μl del gruppo Gibson in celle chimicamente competenti tramite shock termico. Pipettare 100 μl delle cellule trasformate su due piastre di selezione e distribuire con perle sterilizzate. Preparare 10-4, 10-5 e 10-6 diluizioni delle cellule rimanenti su agar Luria-Bertani (LB). Piastra 100 μL di ogni diluizione seriale su LB (nessuna selezione) e spalmata con perle sterilizzate.
    NOTA: Questo passaggio consente di calcolare l'efficienza di trasformazione.
  3. Incubare le piastre per una notte a 37 °C. Conservare le piastre a 4 °C fino al periodo successivo della lezione.
  4. Conta le colonie su tutte le piastre e calcola l'efficienza della trasformazione come indicato nel File Supplementare 2. Riavvitare una piastra selettiva con quattro colonie da una delle due piastre selettive e incubare questa piastra a 37 °C per una notte.
    NOTA: Questo serve come coltura di backup dei tuoi cloni positivi.
  5. Usando un pennarello, seleziona, cerchia ed etichetta quattro colonie distinte sulla piastra di selezione con le iniziali dello studente e un numero (ad esempio, ABC1). Recuperare una nuova piastra LB-agar contenente antibiotico per la selezione, utilizzare un pennarello per dividere la piastra in quadranti (cioè quarti), quindi utilizzare ~1/2 di ciascuna colonia per ri-striare sul quadrante rispettivamente etichettato e l'altro 1/2 per inoculare una coltura LB liquida da 5 ml per ciascuna delle quattro colonie selezionate. Assicurati di etichettare le provette con la rispettiva identità della colonia (ad esempio, ABC1) e di aggiungere la corretta concentrazione di antibiotico per la selezione. Incubare le colture liquide in un incubatore vibrante a 37 °C per una notte e la piastra di agar in un incubatore statico a 37 °C; conservare le colture liquide e le piastre a 4 °C fino al periodo di lezione successivo.

4. Esperimento C: Isolamento e screening dei plasmidi

  1. Isolare il DNA plasmidico dalle colture liquide dell'Esperimento B utilizzando un kit di miniprep. Misurare la concentrazione di plasmide isolato (in ng/μL).
  2. Progettare un digest di restrizione o uno screening PCR per analizzare i plasmidi isolati (vedere le istruzioni dettagliate nel File supplementare 2 e riportare le aspettative nel File supplementare 5).
  3. Pipettare le reazioni di restrizione o le reazioni secondo le ricette progettate e incubare alle temperature e alle durate progettate in precedenza.
  4. Analizza i risultati tramite elettroforesi su gel di agarosio.

5. Valutazione

  1. Chiedi agli studenti partecipanti di completare il post-questionario a scelta multipla (File supplementare 7) la riunione di laboratorio dopo il completamento del modulo Gibson Assembly.
  2. Combina tutti i dati delle risposte pre e post questionario per l'analisi.
    1. Esaminare la significatività statistica dell'aumento del punteggio medio di ogni singola domanda di contenuto tra i questionari utilizzando i t-test accoppiati a due code e la dimensione dell'effetto d di Cohen.
    2. Valuta l'aumento della fiducia degli studenti per ogni singolo termine e tecnica per determinare l'entità del cambiamento e la sua significatività statistica.
    3. Determina l'impatto del background degli studenti e dei fattori accademici sull'apprendimento degli studenti utilizzando il guadagno di apprendimento normalizzato (NLG) e i t-test non accoppiati.
    4. Valutare l'atteggiamento degli studenti nei confronti dell'esperienza progettuale e delle carriere in biologia molecolare valutando i punteggi medi.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Successo degli studenti nella clonazione
In ogni iterazione del modulo Gibson Assembly (2019, 2022 e 2023), agli studenti è stato chiesto di preparare un rapporto che riassumesse i loro risultati. Nel 2019, 36 studenti su 44 (81,8%) hanno riferito di aver clonato con successo i loro plasmidi sulla base dei risultati dello schermo che hanno progettato per l'esperimento C. Un totale di 14 studenti su 20 (70,0%) ha riportato successo nella clonazione dei costrutti assegnati nel 2022, mentre il progetto basato su team nel 2023 ha avuto 12 studenti su 27 (44,4% o 4 gruppi su 8) che hanno riportato successo in base alle loro analisi di screening. Le conclusioni all'interno dei rapporti degli studenti sono state esaminate dall'istruttore o dagli studenti ricercatori; Le interpretazioni degli studenti sono state corrette se si è scoperto che i risultati dello screening non supportavano le loro affermazioni. Un campione di ciascun plasmide distinto è stato analizzato mediante sequenziamento Sanger, confermando le sequenze degli inserti plasmidici per tutti i 15 plasmidi desiderati nel 2019 e per tutti i 12 plasmidi nel 2022. Nel 2023, il sequenziamento dei nanopori Oxford dell'intero plasmide è stato utilizzato per analizzare tutti gli 8 plasmidi; Tuttavia, solo 1 degli 8 plasmidi corrispondeva alla sequenza desiderata.

Valutazione basata sul contenuto dei concetti di biologia molecolare
La sezione del contenuto del questionario comprendeva 10 domande a scelta multipla che testavano la comprensione degli studenti dei concetti di biologia molecolare e clonazione molecolare. Il confronto dei punteggi medi dei contenuti pre e post questionario per tutte e 10 le domande di contenuto ha rivelato un aumento significativo dal 63,7% all'80,4% (p < 0,05, test t accoppiato a due lati; Figura 4), suggerendo che il progetto indipendente Gibson Assembly ha migliorato la comprensione degli studenti della biologia molecolare e dei concetti di clonazione. Un test d di Cohen ha determinato che questo aumento significativo corrisponde a una grande dimensione dell'effetto (d = 0,891), supportando una forte differenza tra le risposte pre e post degli studenti per le domande di contenuto.

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Figura 4: Miglioramento della comprensione da parte degli studenti della biologia molecolare e della clonazione molecolare a seguito del progetto indipendente. Grafico a scatola e baffi delle risposte degli studenti alle domande che testano il contenuto in biologia molecolare e clonazione molecolare prima e dopo il completamento del progetto indipendente (dimensione del campione, n, di 46; Pre e post questionari di Gibson Assembly rispettivamente nel file supplementare 6 e nel file supplementare 7). I punteggi medi pre e post sono stati analizzati tramite un test t accoppiato a due code, che indica un aumento significativo delle risposte corrette degli studenti (p < 0,5). Le caselle rappresentano il 50% medio dei punteggi (cioè dal 25° al 75° percentile) e i baffi rappresentano i punteggi minimo e massimo (%). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Successivamente, abbiamo esaminato se l'aumento del punteggio medio di ogni singola domanda di contenuto fosse statisticamente significativo tra i questionari pre e post. Le analisi che utilizzano i t-test accoppiati a due code hanno mostrato che le risposte degli studenti alle domande sulle reazioni PCR, sui digest di restrizione DpnI, sugli enzimi Gibson Assembly e sulle sequenze di inserti e vettori Gibson Assembly hanno avuto aumenti significativi (p < 0,05) dopo aver completato il progetto indipendente. Queste domande basate sul contenuto avevano punteggi pre-questionario relativamente bassi rispetto alla media complessiva del contenuto del 63,7%, con i punteggi più bassi nelle domande sui digestati DpnI e sugli enzimi Gibson Assembly (34,8% e 47,8%, rispettivamente). La media post-progetto per le domande di cui sopra è aumentata rispettivamente al 71,7% e all'89,1%, che è più vicina alla media complessiva dei contenuti dell'80,4%. Questi dati mostrano che alla fine del progetto, la comprensione da parte degli studenti sia dei digesti DpnI che degli enzimi di Gibson Assembly è migliorata con una dimensione dell'effetto maggiore rispetto alla sezione del contenuto complessivo del questionario (d = 0,982).

Valutazione attitudinale di termini di biologia molecolare e tecniche di laboratorio
Le domande attitudinali sono state suddivise in due sezioni nel questionario degli studenti. La prima sezione ha chiesto agli studenti di autovalutare la loro conoscenza di sette termini di biologia molecolare su una scala da 1 a 4 (da 1 = "Non ho idea di cosa significhi questo termine" a 4 = "So cosa significa questo termine e potrei facilmente spiegarlo a qualcun altro"). La confidenza media a termine è aumentata significativamente da 3,52 a 3,87 con un effetto di grandi dimensioni (p = 5,32 × 10-15 e d = 1,40, rispettivamente; Figura 5A). La seconda sezione attitudinale ha chiesto agli studenti se erano d'accordo con l'affermazione "Mi sento a mio agio nell'esibirmi..." undici diverse tecniche di laboratorio di biologia molecolare su una scala da 1 a 5 (da 1 = "Fortemente in disaccordo" a 5 = "Fortemente d'accordo"). La fiducia media degli studenti di queste undici tecniche è aumentata significativamente da 3,82 a 4,33 con una grande dimensione dell'effetto (p = 2,08 × 10-11 e d = 1,09; Figura 5B).

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Figura 5: Aumento della fiducia degli studenti nella loro comprensione della biologia molecolare e dei termini e delle tecniche di clonazione a seguito del progetto indipendente. Grafici a scatola e baffi della fiducia degli studenti nei termini di biologia molecolare (A) e nelle tecniche (B) nei pre e post questionari (Gibson Assembly Pre e Post-Questionnaires in Supplemental File 6 e Supplemental File 7, rispettivamente). Per la confidenza del termine (pannello A), gli studenti hanno selezionato la confidenza su una scala in 4 parti (da 1 a "Non ho idea di cosa significhi questo termine" a 4 "So cosa significa questo termine e potrei facilmente spiegarlo a qualcun altro"; dimensione del campione n di 45). L'affidabilità della tecnica di laboratorio (pannello B) è stata valutata su una scala in 5 parti (da 1 a 5 fortemente d'accordo; dimensione del campione n di 42). I punteggi medi pre e post sono stati analizzati tramite t-test accoppiati a due code, il che indica un aumento significativo della fiducia degli studenti sia per i set di dati del termine che per quelli della tecnica (p < 0,5). La casella mostra il 50% medio (cioè dal 25° al 75° percentile) delle risposte con i baffi che mostrano le classifiche di confidenza soggettiva minima e massima. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Abbiamo valutato l'aumento della fiducia degli studenti per ogni singolo termine e tecnica e abbiamo determinato che ogni termine, ad eccezione della DNA polimerasi e della trasformazione, ha mostrato un aumento statisticamente significativo (p < 0,05, test t accoppiato a due lati; Tabella 1). Tutti gli studenti, tranne uno, hanno contrassegnato "So cosa significa questo termine e potrei facilmente spiegarlo a qualcun altro" per il termine DNA polimerasi sia nel pre che nel post questionario, quindi non c'era spazio per miglioramenti in quel termine (Tabella 1). Per il periodo di trasformazione, il 73,91% degli studenti ha selezionato il livello di confidenza più alto (numero 4 sulla scala) nel pre-sondaggio rispetto all'80,4% nel post-sondaggio. Nove delle undici tecniche di laboratorio valutate hanno mostrato un aumento significativo della fiducia degli studenti; ciò escludeva i calcoli della molarità e l'elettroforesi su gel (Tabella 1). In media, gli studenti hanno riportato punteggi elevati prima del questionario per entrambe queste tecniche (4,71 e 4,57, rispettivamente, contro una media tecnica di 3,81), indicando che gli studenti erano già sicuri di questi termini prima del progetto Gibson Assembly. Le domande che valutavano la fiducia degli studenti su questioni di biologia generale (ad esempio, DNA polimerasi, elettroforesi su gel, calcoli di molarità) generalmente non mostravano cambiamenti statisticamente significativi (Tabella 1). Tuttavia, tutte le domande specializzate sull'assemblaggio di Gibson hanno mostrato aumenti significativi con le dimensioni dell'effetto più grandi (d > 1,6) con la tecnica "Gibson Assembly" che mostra il maggiore cambiamento nella fiducia degli studenti (Tabella 1 e Figura 6).

Tipo di contenutoTermine/TecnicaMedia Questionnare RispostaSignificatività statisticaDimensione effetto (d)
PreInserisciValore p Sì/No
Biochimica GeneraleTermine DNA polimerasi3.983.98indefinitoNo0
Tecnica di calcolo della molarità4.714.774.45E-01No0.130
Tecnica di elettroforesi su gel4.574.681.68E-01No0.254
Clonazione molecolareTecnica di progettazione dei primer3.053.577.23E-04Sì0.536
Tecnica di clonazione in silico3.614.075.75E-04Sì0.533
Termine di screening blu-bianco3.594.344.10E-06Sì0.655
Termine di screening PCR3.784.311.02E-06Sì0.936
Termine dell'Assemblea Gibson2.873.787.41E-13Sì1.69
Tecnica di assemblaggio Gibson2.594.201.14E-15Sì1.61

Tabella 1: Aumenti significativi rispetto alle questioni attitudinali focalizzate sul clonaggio molecolare, ma non sulla biochimica generale. La media del pre e del post-questionario (Gibson Assembly Pre e Post-Questionnaires in Supplemental File 6 e Supplemental File 7, rispettivamente) per selezionare le domande a termine e tecnica. I test t accoppiati a due code sono stati utilizzati per valutare la significatività (se p < 0,05, sì; se p ≥ 0,05, no). Per il termine DNA polimerasi, le risposte degli studenti erano identiche tra il pre e il post questionario, quindi p è indefinito. La dimensione dell'effetto del confronto delle risposte degli studenti per ogni pre e post domanda è stata determinata utilizzando i valori d di Cohen (d ≥ 0,8 è considerato un effetto grande). Maggiore è la dimensione dell'effetto, maggiore è la probabilità che le risposte pre e post siano distinte all'interno del set di campioni. La dimensione del campione n è 45 e 42 rispettivamente per le domande a termine e tecniche. Abbreviazione: AVG = media.

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Figura 6: Aumenti per le domande attitudinali sull'assemblaggio di Gibson. Numero di risposte per gli studenti ha riportato fiducia nel termine dell'Assemblea di Gibson (A) e nella tecnica (B) nei questionari pre e post. Le risposte di confidenza dei termini erano su una scala in 4 parti (da 1 a "Non ho idea di cosa significhi questo termine" a 4 "So cosa significa questo termine e potrei facilmente spiegarlo a qualcun altro"). Le risposte di fiducia nella tecnica di laboratorio variavano da 1-Fortemente in disaccordo a 5-Fortemente d'accordo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Successivamente abbiamo valutato se i fattori del background degli studenti influiscono su quanto uno studente ha imparato dal progetto indipendente. È stato dimostrato che sia le lacune nella percezione dei risultati19 che nelle prestazioni20 persistono nei corsi universitari STEM a causa del genere; pertanto, abbiamo utilizzato il guadagno di apprendimento normalizzato (NLG) e i t-test non accoppiati per determinare se un divario di genere simile è stato osservato in questi progetti indipendenti. Sulla base di questi test statistici, non abbiamo riscontrato che il genere degli studenti abbia avuto un impatto sui risultati di apprendimento degli studenti. Abbiamo anche verificato se fattori accademici come la specializzazione, il GPA, i voti nei corsi precedenti e il voto finale in BIO/CHEM 475 avessero un legame significativo con i risultati di apprendimento degli studenti del progetto indipendente. Mentre gli studenti che si sono laureati in biochimica (Tabella supplementare S1 e Tabella supplementare S2) avevano GPA e voti finali del corso più elevati e ciascuno individualmente mostrava un NLG medio più elevato, i t-test non accoppiati non hanno mostrato alcuna significatività statistica tra questi fattori di background individuali e i risultati dell'apprendimento. I t-test non accoppiati sono stati utilizzati anche per valutare le differenze di NLG tra le coorti del 2022 e del 2023. È stato riscontrato che la coorte del 2023 ha un guadagno di apprendimento significativamente più elevato rispetto alla coorte del 2022 per le domande di contenuto (Tabella supplementare S3). Ciò indica che, nonostante il tasso di successo della clonazione inferiore della coorte del 2023, hanno acquisito una maggiore comprensione della biologia molecolare e dei concetti di clonazione molecolare rispetto alla coorte del 2022. Sebbene le ragioni di questa differenza non siano chiare, questi dati mostrano che il successo della clonazione non è necessario per un'istruzione efficace con questo modulo.

Oltre a valutare la padronanza delle tecniche di laboratorio da parte degli studenti, abbiamo valutato i loro atteggiamenti nei confronti dell'esperienza del progetto e delle carriere in biologia molecolare. Una domanda, presente sia nelle valutazioni pre che post-progetto, ha misurato il loro livello di comfort nel perseguire carriere che coinvolgono tecniche di biologia molecolare. I risultati rivelano che il progetto ha migliorato significativamente il comfort degli studenti nelle carriere di biologia molecolare (p = 8,46 × 10-5), con un punteggio medio che è aumentato da 3,60 a 4,09 sulla nostra scala 1-5. Inoltre, il questionario post-progetto includeva domande sulla dedizione degli studenti a massimizzare la loro esperienza di apprendimento e la loro valutazione del valore del progetto. Gli intervistati hanno valutato il loro impegno con una media di 4,48 e hanno considerato il progetto un'opportunità di apprendimento molto preziosa, con un punteggio medio di valutazione di 4,73. Nel loro insieme, questi risultati sottolineano il valore del progetto indipendente nella crescita accademica degli studenti, nonché l'entusiasmo e la fiducia negli sforzi di biologia molecolare.

Tabella supplementare S1: Dati grezzi anonimizzati. Tutte le risposte degli studenti e le major dei questionari pre e post raccolti durante le iterazioni 2022 e 2023 del modulo Gibson Assembly CURE. Fare riferimento al file supplementare 6 e al file supplementare 7 per vedere rispettivamente le domande precedenti e successive corrispondenti. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare S2: Differenze nel guadagno di apprendimento normalizzato per specializzazione per ciascuna sezione del questionario. I test t non accoppiati hanno determinato che nessun tipo di domanda mostrava differenze significative nel guadagno di apprendimento normalizzato (NLG) per maggiore (p < 0,05). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare S3: Differenza nel guadagno di apprendimento normalizzato per coorte per ciascuna sezione del questionario. I t-test non accoppiati hanno mostrato che la coorte del 2023 ha un guadagno di apprendimento normalizzato (NLG) significativamente più elevato per le domande di contenuto rispetto alla coorte del 2022 (p < 0,05). Clicca qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: Manuale dell'istruttore per il modulo CURE di assemblaggio Gibson. Una guida per gli istruttori per implementare il modulo CURE di assemblaggio Gibson. Vengono fornite istruzioni passo passo agli istruttori per prepararsi al corso progettando e vagliando i primer di assemblaggio Gibson in base al modello di interesse. Vengono delineati gli argomenti e le attività che gli istruttori dovrebbero trattare durante ogni lezione e il periodo di laboratorio per gli esperimenti A-C. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Manuale dello studente per il modulo CURE di assemblaggio Gibson. Un manuale da fornire agli studenti, comprese le informazioni di base pertinenti sull'assemblaggio Gibson e sui protocolli passo-passo per ogni esperimento (A-C). Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Fogli di lavoro di pianificazione dell'esperimento A (individuale e di squadra). Fogli di lavoro individuali e di gruppo per consentire agli studenti di comprendere e prepararsi all'amplificazione PCR per frammenti di Gibson Assembly. Solo uno di questi fogli di lavoro deve essere assegnato dall'istruttore in base alla struttura del progetto indipendente (individuale o di gruppo). Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: Foglio di lavoro per la pianificazione dell'esperimento B. Foglio di lavoro per gli studenti per aiutare nei calcoli necessari per l'impostazione della reazione dell'assemblaggio di Gibson. Il numero di frammenti nel foglio di lavoro può essere regolato in base al progetto di clonazione per i plasmidi di interesse. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 5: Foglio di lavoro per la pianificazione dell'esperimento C. Foglio di lavoro dello studente per aiutare nella progettazione di un digest di restrizione o di un esperimento di PCR per lo screening del plasmide di interesse. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 6: Pre-questionario di Gibson Assembly. Questionario di ventotto domande somministrato agli studenti prima dell'inizio del modulo CURE di Gibson Assembly. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 7: Gibson Assembly Post-questionario. Questionario di trenta domande somministrato agli studenti dopo aver completato il modulo CURE di Gibson Assembly. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 8: cartella zip contenente i file di sequenza GenBank (.gb) di un gene della polichetide idrossilasi, il vettore pUC19 e il plasmide assemblato con Gibson e la tabella dei primer rappresentativi. Fare riferimento a questi file per la progettazione di primer esemplari nella procedura guidata di assemblaggio Benchling e per il completamento dei fogli di lavoro di pianificazione sperimentale. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, proponiamo un progetto di laboratorio universitario regolabile in aula che insegna agli studenti la clonazione molecolare attraverso Gibson Assembly in un contesto di ricerca basato su corsi. In totale, 28 nuovi plasmidi sono stati clonati da studenti universitari in un ambiente scolastico. Il successo riportato dai singoli studenti variava dal 44,4% all'81,8% in tre coorti e il successo complessivo della clonazione è stato dell'80% (28 dei 35 plasmidi totali assegnati sono stati clonati con successo). Il minor successo della clonazione nel 2023 è stato probabilmente dovuto a due fattori aggravanti. In primo luogo, le provette dei campioni di DNA stampo sono state etichettate con nomi molto strettamente correlati; è possibile che ci siano stati confusioni dei modelli di DNA preparati dagli studenti ricercatori, che hanno portato alla combinazione di frammenti lineari non compatibili durante la reazione di assemblaggio di Gibson eseguita dagli studenti nel laboratorio didattico. Nelle future iterazioni di questo progetto, il DNA stampo dovrebbe essere prima sequenziato o sottoposto a screening con un digest di restrizione per confermare l'identità corretta prima di essere fornito agli studenti. In secondo luogo, l'iterazione 2023 di questo progetto consisteva in assemblaggi di quattro frammenti (un vettore e tre inserti), rispetto agli assemblaggi di due frammenti degli anni precedenti (un vettore e un inserto). Ciò potrebbe anche aver ridotto il successo della clonazione per questo progetto, poiché più frammenti nell'assemblaggio Gibson possono ridurre l'efficienza di reazione22. Nelle future iterazioni di questo progetto, è possibile creare una maggiore ridondanza facendo clonare lo stesso plasmide a più gruppi o impostando più reazioni di assemblaggio di Gibson a vari rapporti inserto-vettore per aumentare la probabilità di successo della legatura e della trasformazione del plasmide. Inoltre, l'inclusione di sovrapposizioni più lunghe tra i frammenti e l'aumento del tempo di incubazione della reazione dell'assemblaggio di Gibson può aumentare il successo negli assemblaggi con 4-6 frammenti23.

Oltre alla clonazione di nuovi plasmidi, i risultati dell'indagine pre e post progetto indicano che gli studenti hanno migliorato la loro comprensione della biologia molecolare e dei concetti di clonazione molecolare, con la massima dimensione dell'effetto per le domande relative alla clonazione dell'assemblaggio di Gibson. Inoltre, la fiducia degli studenti auto-riferita nei termini di biologia molecolare e nelle tecniche di laboratorio è migliorata significativamente dopo aver completato il progetto per la maggior parte degli esaminati. L'assemblaggio Gibson è un'importante e versatile tecnica di clonazione molecolare utilizzata nella ricerca accademica e nell'industria biotecnologica2. Insegnando questi concetti e abilità pratiche in un corso di laboratorio, tutti gli studenti universitari hanno pari opportunità di laurearsi con competenza di ricerca e abilità assumibili quando entrano nel mondo del lavoro o nella formazione continua.

Il curriculum della Gibson Assembly descritto include i cinque componenti di un CURE4 di successo. Gli studenti hanno utilizzato le pratiche scientifiche progettando i propri protocolli, inclusi gli obiettivi e le aspettative basati sulle dimensioni degli ampliconi PCR e sui tagli del digest di restrizione (File supplementare 3, File supplementare 4 e File supplementare 5). Il progetto indipendente promuove la collaborazione degli studenti dividendo la preparazione di ogni frammento richiesto tra i membri di un gruppo e, infine, utilizzando i frammenti di ciascun membro del gruppo in una reazione di legatura (Experiment A Planning Worksheet (Team-Based) in Supplemental File 3). I plasmidi che questi progetti indipendenti miravano a clonare sono nuovi plasmidi di espressione rilevanti per progetti di ricerca al di fuori della classe, fornendo potenzialmente dati per la ricerca pubblicabile. Analogamente a un'esperienza di ricerca più tradizionale, le percentuali di successo della clonazione nel corso CURE non sono state del 100%. Agli studenti è stato chiesto di valutare le variabili che potrebbero aver prodotto risultati negativi e di proporre ipotesi che spieghino perché il plasmide non è stato clonato con successo, il che funge da autentica esperienza di apprendimento per gli studenti riguardo ai risultati della ricerca.

In questa iterazione Gibson Assembly CURE, gli studenti hanno clonato plasmidi pertinenti alla ricerca sui prodotti naturali Actinomycetota; Tuttavia, il flusso di lavoro è stato progettato per essere altamente adattabile anche ad altri progetti. I protocolli qui presentati sono generalizzati, consentendo agli studenti di clonare plasmidi che potrebbero essere utilizzati per una moltitudine di scopi di ricerca all'interno di sei incontri di laboratorio e due lezioni. Il framework consente agli studenti di clonare nuovi plasmidi individualmente o agli studenti di lavorare insieme per clonare un singolo plasmide da >2 frammenti lineari in un approccio basato sul team. Nel complesso, questo approccio può essere adattato per adattarsi a un'ampia gamma di progetti di ricerca che possono richiedere un utilizzo variabile di Gibson Assembly.

Questo studio ha valutato i guadagni di apprendimento degli studenti attraverso un approccio basato su CURE per l'insegnamento dell'assemblaggio Gibson, ma ulteriori informazioni potrebbero essere ottenute attraverso l'espansione dello studio. Mentre il formato pre e post questionario ha permesso la valutazione dei risultati dell'apprendimento grazie al progetto indipendente, non è stato effettuato alcun confronto con l'insegnamento basato su lezioni di Gibson Assembly. Un confronto tra il CURE basato sull'esperimento e un'attività di laboratorio basata su lezioni frontali o più tradizionali, in cui i risultati sperimentali sono già progettati per gli studenti, fornirebbe maggiori informazioni se i risultati di apprendimento dell'Assemblea Gibson migliorati fossero specifici del modello di corso CURE. Infine, mentre alcune domande relative al contenuto di Gibson Assembly hanno mostrato miglioramenti significativi nella comprensione, altre no. Le domande relative alle sovrapposizioni omologhe utilizzate nel Gibson Assembly, al modo in cui vengono installate e al modo in cui si ricombinano in una reazione di clonazione del Gibson Assembly non sono migliorate. Ciò suggerisce che ulteriori spiegazioni o un'ulteriore valutazione dell'apprendimento su questi argomenti potrebbero migliorare la comprensione degli studenti nelle future implementazioni di questo curriculum.

La struttura del progetto indipendente Gibson Assembly continua ad essere implementata presso Cal Poly. Nelle future iterazioni del corso, questo progetto sarà modificato per consentire una maggiore indipendenza degli studenti, la generazione di ipotesi e la progettazione sperimentale. Un imminente cambiamento del curriculum presso Cal Poly presenta l'opportunità di estendere il progetto indipendente per includere la progettazione di primer guidata dagli studenti, la selezione della spina dorsale vettoriale, l'analisi delle sequenze e/o i test a valle dei plasmidi, ad esempio per l'espressione proteica. Inoltre, il progetto indipendente potrebbe essere personalizzato per insegnare altre tecniche di biologia molecolare pertinenti, come la mutagenesi sito-diretta o l'editing genetico, a seconda delle esigenze dei progetti di ricerca in corso. Modificare le tecniche che gli studenti utilizzano nel progetto indipendente potrebbe fornire un maggiore discernimento su quali argomenti sono appropriati per il formato CURE e quali si rivelano difficili da implementare.

Nel complesso, questo rapporto descrive in dettaglio un modulo didattico adattabile di Gibson Assembly che implementa un CURE sia per migliorare la comprensione degli studenti di una metodologia di clonazione emergente sia per aumentare la competenza nel processo scientifico. Il progetto indipendente ha migliorato i risultati di apprendimento degli studenti e la fiducia nella maggior parte dei termini e delle tecniche di biologia molecolare valutati. Incoraggiamo l'uso e l'adattamento di questo modulo non solo per creare nuovi plasmidi di ricerca, ma anche per migliorare l'accessibilità degli studenti e la fiducia nelle tecniche di ricerca, preparando meglio gli studenti universitari per le future carriere in STEM. Idealmente, questo lavoro ispirerà miglioramenti nei curricula di biologia molecolare e incoraggerà l'adattabilità dei corsi STEM man mano che le metodologie di ricerca scientifica continuano ad evolversi.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano Andrea Laubscher per il supporto tecnico e Michael Black, Sandi Clement e Javin Oza per le utili discussioni sull'implementazione del laboratorio didattico e sulla valutazione dei risultati dell'apprendimento. Gli autori ringraziano tutti gli studenti che hanno partecipato allo studio sui risultati di apprendimento nelle coorti 2019, 2022 e 2023, nonché gli studenti di ricerca Nathan Kuhn e Aayushi Adettiwar che hanno assistito alla preparazione dei reagenti per l'implementazione del laboratorio didattico. Gli autori riconoscono anche il sostegno finanziario del William and Linda Frost Fund, del Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant e della National Science Foundation (NSF-1708919 e NSF-2300890).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Desossiribonucleotide trifosfato (dNTP, 10  mM)Fisher ScientificFERR0191Homemade' MasterMix componente
Ditiotreitolo (DTT)Fisher Scientific FERR0861Homemade' MasterMix componente
DpnI New England BiolabsR0176S1000 unità
Fisherbrand Isotemp Incubatore microbiologicoFisher Scientific15-103-0513
FisherBrand Isotemp Bagno d'acquaFisher ScientificS28124
GelRed Nucleic Acid Gel StainBiotiumNC959471910.000X
GeneJET Gel Estrazione e pulizia del DNA Micro KitThermo ScientificFERK0831100 Preps
GeneRuler 1 kb Scala del DNAFisher ScientificFERSM0314100 applicazioni
LB Broth, MillerFisher BioReagentsBP9723-500500 g
Cloruro di magnesio esaidratoFisher ScientificBP214-500Componente MasterMix fatto in casa
Mastercycler nexus X2 Termociclatore a gradienteEppendorf6337000027
Microfuge 16 CentrifugaBeckman ColtroA46474
Micromonospora echinospora batteriamericano Collezione di coltureATCC 15837
Forno a microondeGeneral Electric
Bioreagentiagarosio per biologia molecolareBP160-100100 g
Spettrofotometro per microvolumi Nanodrop OneThermo Scientific13-400-518
NEB 5-alfa Competente E. coliNew England BiolabsC2987H20 x 0,05 mL
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BiolabsE2621S10 reazioni
New Brunswick Innova 40 Agitatore orbitale da bancoNew BrunswickM1299-0090
Acqua priva di nucleasiFisher BioReagentsBP24845050 mL
PEG-8000 Fisher ScientificBP233-100Componente MasterMix fatto in casa
Phusion DNA polimerasiNew England BiolabsM0530Componente MasterMix fatto in casa
Bilancia portatileOhausSKX123
pUC19 vettoreNew England BiolabsN3041S
Q5 ad alta fedeltà 2x Master Mix New England BiolabsM0492S100 reazioni
T5 EsonucleasiEpicentroT5E4111KFatto in casa' Componente MasterMix
Taq DNA LigasiNew England BiolabsM0208Fatto in casa' Componente MasterMix
Tris-HClFisher ScientificAAA1137918Fatto in casa' Componente MasterMix
TriTrack DNA Gel Caricamento colorante (6x)Thermo ScientificFERR11615 x 1 mL
Zyppy Plasmid Miniprep KitZymo ResearchD4019100 Preps
β-Nicotinamide adenina dinucleotide (NAD+)New England BiolabsB9007SHomemade' MasterMix componente
Tipo 2440640 Fisher di

Riferimenti

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