Saggio ibrido di ensemble e singola molecola per l'imaging del movimento di CMG completamente ricostituito

Sommario

Riportiamo un saggio ibrido di ensemble e di una singola molecola per visualizzare e quantificare direttamente il movimento dell'elicasi Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) marcata in fluorescenza, completamente ricostituita, su molecole di DNA lineari tenute in posizione in una trappola ottica.

Abstract

Gli eucarioti hanno un'elicasi replicativa nota come CMG, che organizza e guida centralmente il replisoma e apre la strada alla parte anteriore delle forche di replicazione. Ottenere una profonda comprensione meccanicistica delle dinamiche del CMG è fondamentale per chiarire come le cellule raggiungano l'enorme compito di replicare in modo efficiente e accurato il loro intero genoma una volta per ciclo cellulare. Le tecniche a singola molecola sono particolarmente adatte a quantificare la dinamica del CMG grazie alla loro impareggiabile risoluzione temporale e spaziale. Tuttavia, gli studi su singole molecole del movimento del CMG si sono finora basati su CMG preformato purificato dalle cellule come un complesso, il che preclude lo studio delle fasi che portano alla sua attivazione. Qui, descriviamo un saggio ibrido di ensemble e singola molecola che ha permesso l'imaging a livello di singola molecola del movimento di CMG marcato in fluorescenza dopo aver completamente ricostituito il suo assemblaggio e l'attivazione da 36 diversi polipeptidi purificati di S. cerevisiae. Questo saggio si basa sulla doppia funzionalizzazione delle estremità di un substrato lineare di DNA con due porzioni di attacco ortogonali e può essere adattato per studiare meccanismi di elaborazione del DNA altrettanto complessi a livello di singola molecola.

Introduzione

La replicazione del DNA negli eucarioti è effettuata da un complesso proteico dinamico noto come replosoma¹. Un componente chiave di questo complesso è l'elicasi replicativa eucariotica Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), che guida e organizza centralmente il reposoma, aprendo la strada alla parte anteriore delle forcelle di replicazione ^1,2. Ottenere una profonda comprensione quantitativa della dinamica del CMG è quindi fondamentale per comprendere la dinamica del replosoma. Tale comprensione potrebbe essere acquisita con tecniche a singola molecola, che sono particolarmente adatte per studiare motori molecolari, come il CMG, grazie alla loro ineguagliabile risoluzione spaziale e temporale, e possono fornirci una comprensione quantitativa senza precedenti della loro funzione, stocasticità e dinamica 2,3,4,5,6,7,8,9.

In vivo, il CMG viene caricato e attivato in modo temporalmente separato per garantire che la replicazione avvenga solo una volta per ciclo cellulare ^1,10,11. In primo luogo, nella fase G1 del ciclo cellulare, un insieme di proteine note come fattori di carico carica il primo componente del CMG, il complesso esamerico Mcm2-7, su dsDNA 12,13,14,15,16 sotto forma di doppi esameri con una configurazione testa a testa 15,17,18 . Nel caso specifico del lievito, questo processo iniziale si verifica in specifiche sequenze di DNA note come origini della replicazione¹. Sebbene Mcm2-7 sia il nucleo motore dell'elicasi replicativa, da solo non è in grado di svolgere il DNA¹⁹ senza i due fattori attivanti l'elicasi Cdc45 e GINS, che devono essere reclutati nel carico di Mcm2-7 per dare origine a CMG 11,19,20,21 completamente attivo. Il processo di attivazione dell'elicasi avviene nella fase S del ciclo cellulare e inizia con la fosforilazione selettiva dei doppi esameri di Mcm2-7 da parte della chinasi DDK 22,23,24 regolata dal ciclo cellulare. Questi eventi di fosforilazione facilitano il reclutamento di Cdc45 e GINS nei doppi esameri Mcm2-7 10,22,23,24,25,26 da parte di un secondo set di proteine note come fattori di attivazione 10,11,26 . Il legame di Cdc45 e GINS dà origine a due elicasi CMG sorelle, che inizialmente racchiudono entrambi i filamenti del DNA parentale e si trovano ancora in una configurazione testa a testa^11,27. Nella fase finale di attivazione, il fattore di attivazione Mcm10 catalizza l'estrusione dipendente dall'idrolisi dell'ATP di un filamento di DNA da ciascuna sorella CMG¹¹. Dopo l'estrusione del filamento, le elicasi sorelle di CMG si bypassano e si separano l'una dall'altra traslocando lungo l'ssDNA in modo dipendente dall'idrolisi dell'ATP 11,20,21,28, svolgendo il DNA escludendo stericamente il filamento 29 di non traslocazione. L'intero processo è stato completamente ricostituito in vitro da un set minimo di 36 polipeptidi purificati di S. cerevisiae ^10,11.

Nonostante la squisita regolazione in vivo dell'assemblaggio e dell'attivazione del CMG descritta sopra, gli studi in vitro sul movimento di una singola molecola ricostituita di CMG 2,30,31,32,33,34 si sono finora basati su CMG pre-attivato purificato come complesso da cellule ^20,21, mancano tutti i passaggi precedenti alla sua attivazione e la natura bidirezionale del suo movimento. Questo approccio CMG pre-attivato è stato il gold standard nel campo delle singole molecole, in parte a causa della complessità biochimica della reazione di assemblaggio CMG completamente ricostituita^10,11. Questa reazione biochimica è stata difficile da tradurre dal livello biochimico di massa al livello di singola molecola per diversi motivi. In primo luogo, per massimizzare l'efficienza della reazione, i fattori di carico e di attivazione necessari per l'assemblaggio e l'attivazione del CMG sono necessari a concentrazioni comprese tra 10 e 200 nM 10,11,27. Questi intervalli di concentrazione corrispondono al limite superiore di ciò che la maggior parte delle tecniche a singola molecola può tollerare, specialmente quando si utilizzano componenti marcati in fluorescenza³⁵. Infine, CMG si è evoluto per navigare attraverso migliaia di coppie di basi in una cella 36,37,38,39. Pertanto, per studiare il suo moto su una scala spaziale biologicamente rilevante, sono necessari lunghi substrati di DNA (tipicamente di lunghezze nell'ordine di decine di kilobasi)30,31,34,40,41,42. L'impiego di substrati di DNA così lunghi pone l'ulteriore sfida che più lungo è il substrato di DNA, maggiori sono i potenziali siti di legame non specifici per le proteine e gli aggregati proteici che ha. Nel caso della CMG, quest'ultimo punto è particolarmente importante, poiché molti dei fattori di carico e di attivazione coinvolti nell'assemblaggio e nell'attivazione della CMG contengono regioni intrinsecamente disordinate⁴³ e sono inclini all'aggregazione.

Qui, riportiamo un saggio ibrido di ensemble e di singola molecola che ha permesso l'osservazione e la quantificazione del moto del CMG dopo aver completamente ricostituito il suo assemblaggio e attivazione da 36 polipeptidi purificati di S. cerevisiae ²⁸. Questo test si basa sulla doppia funzionalizzazione di entrambe le estremità di un substrato di DNA con due porzioni di attacco ortogonale: destiobiotina e digossigenina² (Figura 1A). La prima frazione, la destiobiotina, viene utilizzata per legare in modo reversibile il substrato del DNA alle perle magnetiche rivestite di streptavidina⁴⁴ (Figura 1B). Successivamente, il CMG marcato in fluorescenza viene assemblato e attivato sul DNA legato alle perle e viene utilizzato un rack magnetico per purificare e lavare i complessi DNA:CMG legati alle perle magnetiche risultanti (Figura 1C). In tal modo, la proteina in eccesso che altrimenti si aggregherebbe sul substrato di DNA viene rimossa; questo fornisce complessi DNA:CMG praticamente privi di aggregazione. I complessi intatti vengono quindi eluiti dalle perle magnetiche mediante l'aggiunta di un eccesso molare di biotina libera, che può superare l'interazione destiobiotina-streptavidina (Figura 1D). I singoli complessi DNA:CMG vengono quindi legati tra due perle di polistirene otticamente intrappolate rivestite con anticorpi anti-digossigenina (anti-Dig); per questo passaggio, viene utilizzata la seconda porzione del DNA, la digossigenina, in quanto può legarsi all'anti-Dig anche in una soluzione tampone contenente un eccesso di biotina libera (Figura 1E). Una volta che il complesso DNA:CMG è tenuto in posizione nella trappola ottica, il movimento del CMG marcato in fluorescenza viene ripreso con un laser a scansione confocale (Figura 1F). Prevediamo che questo test possa essere facilmente adattato per lo studio a livello di singola molecola di interazioni DNA:proteina altrettanto complesse.

Protocollo

1. Sintesi di substrato di DNA lineare doppiamente funzionalizzato e legame con biglie magnetiche

1. Doppia funzionalizzazione del substrato di DNA con porzioni di destiobiotina e digossigenina
   1. Linearizzare 20 μg di plasmide pGL50-ARS1 da 23,6 kb (contenente un'origine naturale di replicazione ARS1, clonato internamente e disponibile su richiesta) con 200 unità di enzima di restrizione AflII per 16 ore a 37 °C in un volume finale di 200 μL di tampone 1x (50 mM di acetato di potassio, 20 mM di Tris-acetato, 10 mM di acetato di magnesio, 100 μg/ml BSA, pH 7,9).
      NOTA: Questo passaggio può essere ridotto a 4 ore senza ridurre la resa, se più conveniente.
   2. Inattivare AflII incubando la reazione a 65 °C per 20 min. Smussare le sporgenze risultanti di TTAA a 4 nucleotidi integrando la reazione di linearizzazione di 200 μL con 60 unità di frammento di Klenow (da 3' a 5' eso-) polimerasi, 17 μL di tampone 10x (500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl₂, 10 mM DTT, pH 7,9), 33 μM di D-destiobiotina-7-dATP, 33 μM di digossigenina-11-dUTP, 33 μM dCTP, 33 μM dGTP, e acqua ultrapura fino a un volume finale di 370 μM. Incubare la reazione a 37 °C per 30 minuti.
      NOTA: In questa fase, il frammento di Klenow attenua le sporgenze ad entrambe le estremità del DNA linearizzato incorporando due nucleotidi D-destiobiotina-7-dATP e due digossigenina-11-dUTP a ciascuna estremità.
   3. Integrare la reazione con 10 mM di EDTA e inattivare il frammento di Klenow incubando la reazione a 75 °C per 20 minuti. Portare il volume di reazione a 400 μl con acqua ultrapura.
   4. Prendi quattro colonne di rotazione S-400, vorticarle per almeno 30 s per risospendere la resina, quindi centrifugarle per 1 minuto a 735 x g per rimuovere il buffer di stoccaggio. Trasferire le colonne per pulire le provette da 1,5 mL.
   5. Immediatamente, aggiungere 100 μl della soluzione di DNA a ciascuna colonna e centrifugarle per 2 minuti a 735 x g. Il DNA è ora nel flusso continuo e le colonne possono essere scartate.
   6. Raggruppare il flusso delle quattro colonne, misurare il volume con una pipetta e misurare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro. Questo verrà utilizzato per calcolare la quantità di DNA legata alle perline.
2. Legame di DNA lineare doppiamente funzionalizzato a perle magnetiche rivestite di streptavidina
   1. Vortex M-280 perle magnetiche rivestite di streptavidina per 30 s per risospenderle.
   2. Trasferire 4 mg di perle magnetiche risospese M-280 rivestite di streptavidina in una provetta pulita da 1,5 mL. Posizionare la provetta in una rastrelliera magnetica, attendere 1 minuto per la raccolta delle perle e rimuovere il tampone di conservazione.
   3. Aggiungere 1 mL di 1 tampone A (5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA e 1 M NaCl) alle perle e risospendere vorticando per 5 s. Incubare le perle a temperatura ambiente per 5 minuti.
      NOTA: Tutti i tamponi devono essere filtrati in modo sterile. Realizzare in anticipo un volume elevato di 2x buffer A, 1x buffer B (vedi sotto) e 1x buffer C (vedi sotto) per risparmiare tempo (consigliato). Questi tamponi sono quelli consigliati dal produttore delle perline magnetiche e possono essere conservati a - 20°C.
   4. Posizionare il tubo in un supporto magnetico, attendere 1 minuto per la raccolta delle perline e rimuovere il tampone A.
   5. Risospendere le microsfere in 400 μL di tampone 2x A mediante pipettaggio, quindi aggiungere 400 μL di soluzione di DNA funzionalizzato (si noti che questo diluisce il tampone 2x A a una concentrazione finale di 1x, che è ottimale per il legame del DNA alle microsfere). Miscelare delicatamente pipettando.
   6. Incubare la miscela di microsfere/DNA per una notte a 4 °C con rotazione end-over-end per consentire al DNA funzionalizzato di legarsi alle microsfere.
   7. Utilizzare il rack magnetico per rimuovere il surnatante (non gettarlo prima di averne misurato il volume con una pipetta e la concentrazione di DNA non legato con uno spettrofotometro) e lavare le perle 2 volte con 500 μL di tampone B (10 mM HEPES-KOH pH 7,6, 1 mM EDTA e 1 M KOAc) per rimuovere il DNA non specificamente legato. Lavare le perle 2 volte con 500 μL di tampone C (10 mM HEPES-KOH pH 7,6 e 1 mM EDTA), che è il tampone di conservazione raccomandato dal produttore.
      1. Calcolare la quantità totale di DNA legato alle microsfere magnetiche confrontando la quantità totale di DNA aggiunta alle perle con la quantità di DNA rimasta nel surnatante. La resa dovrebbe essere nell'intervallo di 2,3-2,9 mg di DNA (~150-190 fmol) per mg di perle magnetiche. Se si ottengono rese inferiori, verificare che le colonne S400 non siano asciutte prima di utilizzarle. Monitorare costantemente l'integrità del DNA mediante elettroforesi su gel per garantire che il substrato iniziale del DNA plasmidico non venga degradato.
   8. Risospendere le perle in 300 μl di tampone C e conservarle a 4 °C. Per evitare intaccature, fare 4 aliquote monouso da 1 mg di microsfere magnetiche e non conservare il DNA per più di 2 settimane.

2. Saggio ibrido di ensemble e singola molecola per l'imaging e la quantificazione del movimento di CMG completamente ricostituito con pinzette ottiche correlative a doppio raggio e microscopia confocale

1. Assemblaggio di ensemble e attivazione di CMG marcato in fluorescenza su DNA legato a biglie magnetiche (Figura 1C).
   NOTA: Le reazioni di assemblaggio e attivazione del CMG sono state effettuate in due fasi: carico e fosforilazione di Mcm2-7 e assemblaggio e attivazione del CMG. Se non diversamente specificato, tutte le fasi di sostituzione del tampone sono state condotte con l'aiuto di un rack magnetico, consentendo alle perle di essere raccolte dal magnete per 1 minuto e quindi rimuovendo il surnatante. Tutte le incubazioni sono state condotte in un blocco termico a temperatura controllata con un coperchio per prevenire il fotosbiancamento delle proteine fluorescenti. Se non è disponibile un coperchio, i tubi devono essere coperti con carta stagnola. La purificazione e la marcatura fluorescente di tutte le proteine impiegate in questo protocollo sono state effettuate come precedentemente descritto^10,11,28.
   1. Carico e fosforilazione di Mcm2-7
      1. Assumere 1 mg di perle magnetiche rivestite di streptavidina legate al DNA e rimuovere il tampone di conservazione (tampone C).
      2. Lavare le perle con 200 μL di tampone di caricamento (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM K glutammato, 10 mM MgOAc, 0,02% sostituto NP40, 10% glicerolo, 2 mM DTT, 100 μg/mL BSA e 5 mM ATP).
      3. Rimuovere il tampone di caricamento e risospendere le perle in 75 μL di tampone di caricamento. Miscelare delicatamente pipettando.
      4. Aggiungere ORC a una concentrazione finale di 37,5 nM al DNA legato alla perlina e incubare la reazione per 5 minuti a 30 °C con agitazione a 800 giri/min.
      5. Aggiungere Cdc6 a una concentrazione finale di 50 nM e incubare la reazione per 5 minuti a 30 °C con agitazione a 800 giri/min.
      6. Aggiungere Mcm2-7/Cdt1 (o marcato in fluorescenza Mcm2-7^{JF646-Halo-Mcm3}/Cdt1) a una concentrazione finale di 100 nM e incubare la reazione per 20 minuti a 30 °C con agitazione a 800 giri/min.
      7. Aggiungere DDK a una concentrazione finale di 100 nM e incubare la reazione per 30 minuti a 30 °C con agitazione a 800 giri/min.
      8. Rimuovere il surnatante e lavare il DNA legato alla perlina (che ora contiene esameri Mcm2-7 fosforilati) con 200 μL di tampone ad alto contenuto di sale (HSW) (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 300 mM KCl, 10 mM MgOAc, 0,02% sostituto NP40, 10% glicerolo, 1 mM DTT e 400 μg/mL BSA). Miscelare mediante pipettaggio, assicurandosi che le perle siano completamente risospese nel tampone e che non siano visibili grumi.
      9. Rimuovere il tampone HSW e lavare le perle una volta con 200 μL di tampone CMG (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM K glutammato, 10 mM MgOAc, 0,02% sostituto NP40, 10% glicerolo, 1 mM DTT e 400 μg/mL BSA).
   2. Assemblaggio e attivazione di CMG marcato in fluorescenza
      1. Rimuovere il tampone CMG e risospendere le microsfere legate al DNA in 50 μL di tampone CMG integrato con 5 mM di ATP.
      2. Aggiungere 50 nM Dpb11, 200 nM GINS, 30 nM Polɛ, 20 nM S-CDK, 50 nM Cdc45^LD555, 30 nM Sld3/7, 55 nM Sld2 e 10 nM Mcm10 al DNA legato alla perlina. Per questo passaggio, mescola tutte le proteine in una provetta immediatamente prima di aggiungerle al DNA e mettilo sul ghiaccio. Aggiungere il DNA legato a perline risospeso al mix proteico. Incubare la reazione per 15 minuti a 30 °C con agitazione a 800 giri/min.
      3. Lavare le perle 3 volte con 200 μL di tampone HSW. Lavare le perle una volta con 200 μL di tampone CMG.
   3. Eluizione di complessi DNA:CMG intatti da biglie magnetiche (Figura 1D)
      1. Rimuovere il tampone CMG ed eluire i complessi DNA:CMG dalle biglie magnetiche risospendendo le biglie magnetiche legate al DNA contenenti CMG in 200 μL di tampone di eluizione (tampone CMG integrato con 10 mM di biotina). Incubare a temperatura ambiente per 1 ora con agitazione a 800 giri/min.
      2. Posizionare la provetta in una rastrelliera magnetica e lasciare che le perle vengano raccolte per 5 minuti. Raccogliere con cura il surnatante (che ora contiene i complessi DNA:CMG eluiti) senza interrompere le perle depositate e trasferirlo in una nuova provetta.
      3. Per garantire che non rimangano microsfere nella soluzione (poiché le microsfere magnetiche rimaste nella soluzione possono interferire con la parte di intrappolamento ottico del saggio), posizionare nuovamente il surnatante raccolto in un rack magnetico e lasciare che le perle rimanenti vengano raccolte per altri 5 minuti. Raccogliere con cura il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta.
      4. Aggiungere 1400 μl di tampone CMG ai 200 μl di surnatante. Il campione è ora pronto per l'imaging di una singola molecola.
2. Imaging a singola molecola di CMG completamente ricostituito con pinzette ottiche correlative a doppio raggio e microscopia confocale (Figura 1E-G).
   NOTA: La parte a singola molecola del saggio è condotta in una configurazione commerciale che combina pinzette ottiche a doppio raggio con microscopia confocale e microfluidica^45,46 (Figura 1E-G), ma può anche essere condotto in una configurazione autocostruita. La configurazione commerciale qui utilizzata è dotata di una cella a flusso microfluidico con cinque ingressi (denominati rispettivamente canali 1-5) e un'uscita (Figura 1E). Nei passaggi seguenti, tutti i nomi dei pulsanti e/o dei pannelli sono specifici per il software fornito con questa configurazione commerciale.
   1. Utilizzare i cinque ingressi nella configurazione commerciale come segue: iniettare i canali 1-3 da sinistra e utilizzarli per l'intrappolamento delle microsfere (Canale 1), il legame del complesso DNA-proteina (Canale 2) e il controllo della presenza di CMG (Canale 3). Utilizzare i canali 4 e 5 come serbatoi proteici e posizioni di scambio tampone. Prima di ogni esperimento, passivare la cella a flusso microfluidico per almeno 30 minuti con 1 mg/mL di albumina sierica bovina, seguita da Pluronic F-127 allo 0,5% disciolto in acqua ultrapura.
      1. Assicurarsi che il contenuto di ciascun canale in ogni esperimento sia quello descritto (Figura 1E):
         Canale 1: Perle di polistirene rivestite di anti-digossigenina (diametro 2,06 μm) diluite 1:50 in PBS;
         Canale 2: complessi DNA:CMG eluiti da biglie magnetiche;
         Canale 3: Tampone di imaging (tampone CMG integrato con 2 mM di 1,3,5,7 cicloottatetraene, 2 mM di 4-nitrobenzilalcolo e 2 mM di Trolox);
         Canali 4 e 5: tampone di imaging integrato con 25 nM di RPA, 10 nM di Mcm10 e 5 mM di ATP, 5 mM di ATPγS o nessun nucleotide.
   2. Prima dell'esperimento, regolare la potenza del laser di intrappolamento per ottenere una rigidità di 0,3 pN/nm in entrambe le trappole^33,46 facendo clic sul pulsante Ricalibra nel pannello Power Controls del software. Impostare la dimensione dei pixel confocali su 50 x 50 nm, la dimensione dell'immagine su 160 x 18 pixel, il tempo di illuminazione per pixel su 0,2 ms e la frequenza dei fotogrammi su 5 s nel pannello Scansione immagine del software. Impostare il controllo della temperatura su 30 °C nel pannello Temperatura.
      NOTA: Inoltre, si consiglia di impostare la velocità massima dello stadio (utilizzata per spostarsi tra i canali) a 0,2 mm/s per ridurre al minimo la dissociazione del CMG dal DNA da parte della forza di trascinamento.
   3. Far fluire tutte le soluzioni nella cella di flusso a una pressione costante di 0,5 bar nella porta di iniezione (che può essere impostata nel pannello Barra di pressione del software). Quindi, disattivare il flusso nei canali 4 e 5. Dopo aver fatto scorrere inizialmente tutte le soluzioni, ridurre la pressione a 0,2 bar.
   4. Spostare i laser di intercettazione sul canale 1 fino a quando non viene catturato un cordone in ciascuna trappola ottica. Sposta le perline intrappolate sul canale 2 muovendo il joystick mentre premi il grilletto. Quindi, pesca un complesso DNA:CMG spostando la perlina destra verso e lontano dalla perlina sinistra usando il joystick senza premere il grilletto, fino a quando non viene intrappolato un laccio del DNA (che è noto monitorando la curva forza-estensione del DNA⁴⁷ intrappolato nel pannello FD Viewer del software).
      1. Per il tethering del DNA, assicurarsi di inserire la lunghezza del DNA e il valore di temperatura corretto nel pannello Modello di riferimento, che traccerà automaticamente un modello teorico estensibile a catena simile a un verme del costrutto di DNA nel pannello FD Viewer. Se una singola molecola di DNA viene catturata tra le due perline, il comportamento di forza-estensione del DNA dovrebbe corrispondere strettamente al modello di catena estensibile a forma di verme tracciato. Assicurati che questo sia il caso monitorando la curva sperimentale forza-estensione, che il software traccerà automaticamente sopra quella teorica.
         NOTA: Le deviazioni dal modello teorico possono indicare la presenza di più molecole di DNA legate tra le perle e/o la presenza di aggregati proteici legati al DNA e che lo compattano. Per prevenire la dissociazione mediata dalla forza delle proteine dal DNA, non superare una tensione di 10 pN durante questo test iniziale.
   5. Spostare le perline sul canale 3 e interrompere immediatamente il flusso in tutti i canali. Eseguire una scansione di prova di un fotogramma nel canale 3 per confermare la presenza di CMG, illuminando con un laser da 561 nm a una potenza di 4 μW misurata sull'obiettivo. Regola le potenze del laser di imaging nel pannello Laser di eccitazione. Se presente, il CMG apparirà come macchie bidimensionali limitate alla diffrazione, come mostrato nella Figura 1G e nella Figura 2A.
      1. Se non è possibile rilevare il DNA, controllare il canale 2 per verificare la presenza di bolle, che possono rallentare il flusso nel canale 2 (rispetto ai canali 1 e 3). Se sono presenti bolle, aumentare la pressione nel canale da 2 a 1 bar per cercare di far passare le bolle.
   6. Se è presente CMG, spostare il cavo del DNA sul canale 4 o 5 per l'imaging; In caso contrario, riattivare il flusso, scartare le perline e tornare al passaggio 2.2.4.
   7. Nei canali 4 o 5, regolare la distanza tra le perle per ottenere una tensione iniziale di 2 pN nel cavo del DNA. A tale scopo, inserire 2 pN nel pannello Spettroscopia di forza e fare clic sul pulsante Abilita per avviare un morsetto di forza. Una volta che la tensione iniziale raggiunge i 2 pN, disabilitare il morsetto di forza prima dell'imaging facendo clic sul pulsante Abilita nel pannello Spettroscopia di forza.
   8. Immagine CMG^Cdc45-LD555 ogni 5 s con un laser da 561 nm a una potenza di 4 μW misurata sull'obiettivo (Figura 1F). Per questo, fai clic sul pulsante Avvia scansione nel pannello Scansione immagine. In tali scansioni, il CMG mostrerà come macchie bidimensionali limitate alla diffrazione, come nell'esempio nella Figura 1G.
      1. Se si osserva CMG ma non sembra muoversi prima dello sbiancamento, testare tutte le proteine utilizzate per l'attività della nucleasi, poiché le tacche sul DNA causeranno la dissociazione del CMG dal DNA⁴¹, riducendo gravemente la sua apparente processività.
         NOTA: Una potenza laser di 4 μW dovrebbe fornire risultati coerenti se si utilizza il microscopio commerciale utilizzato qui. Se si utilizza una configurazione casalinga, si consiglia di stimare empiricamente la potenza laser ottimale. Una potenza laser ottimale dovrebbe fornire un segnale sufficiente dal fluoroforo per localizzarlo con la precisione desiderata e una durata del fluoroforo vicina all'intervallo di tempo desiderato dell'esperimento.
         NOTA: Sebbene questa pubblicazione si concentri sull'insieme ibrido e sul saggio a singola molecola, abbiamo precedentemente pubblicato una descrizione completa dell'analisi dei dati generati con questo saggio⁴⁸.

Risultati

Se eseguito correttamente, il protocollo qui descritto dovrebbe produrre complessi DNA:CMG praticamente privi di aggregati. Una reazione priva di aggregazione non dovrebbe ostruire nessuno dei canali nella cella a flusso microfluidico e dovrebbe essere possibile allungare le molecole di DNA intrappolate fino a un'estensione end-to-end entro il 10% della sua lunghezza di contorno senza rompere il DNA. Al contrario, se c'è aggregazione nella reazione, le molecole di DNA possono talvolta essere compattate dagli aggregati, causando spesso la rottura del DNA se allungate. Un buon modo per riconoscere gli aggregati proteici è osservare le scansioni 2D del DNA. In una reazione priva di aggregazione, la CMG appare come macchie discrete, simmetriche e limitate dalla diffrazione che affollano scarsamente il DNA, come quelle nelle scansioni mostrate nella Figura 2A. Al contrario, gli aggregati sono meno discreti, a volte blob asimmetrici che affollano una lunghezza maggiore del DNA, come quelli nelle scansioni mostrate nella Figura 2B. Inoltre, se il saggio viene eseguito con successo e si ottiene un'elevata purezza delle proteine purificate, si osserverà un movimento a lungo raggio del CMG in presenza di ATP, come osservato nel chimografo mostrato in Figura 2C.

Figura 1: Descrizione pittorica di un insieme ibrido e di un saggio a singola molecola per l'immagine e la quantificazione del moto di CMG completamente ricostituito. (A) Un DNA lineare di 23,6 kb contenente un'origine di replicazione ARS1 presente in natura è doppiamente funzionalizzato ad entrambe le estremità con porzioni di destiobiotina e digossigenina. (B) Il DNA doppiamente funzionalizzato è legato a perle magnetiche rivestite di streptavidina attraverso le sue frazioni di destiobiotina. (C) Il CMG viene assemblato e attivato gradualmente sul DNA legato a biglie magnetiche con diverse fasi di lavaggio incluse per rimuovere le proteine non legate e gli aggregati proteici in eccesso. (D) I complessi DNA:CMG intatti vengono quindi eluiti dalle sfere magnetiche mediante l'aggiunta di un eccesso di biotina libera, che supera l'interazione destiobiotina-streptavidina. (E) I singoli complessi DNA:CMG sono legati tra due perle di polistirene otticamente intrappolate rivestite di anti-digossigenina con l'aiuto di una cella a flusso microfluidico. Si noti che l'interazione Dig-anti-Dig è ortogonale alle interazioni biotina-avidina, quindi non è influenzata dalla presenza di biotina libera. (F) Una volta tenuti in posizione dalle pinzette ottiche, i complessi DNA:CMG vengono trasferiti in diverse condizioni tampone, dove il piano del DNA viene quindi scansionato con un laser a scansione confocale per visualizzare il movimento del CMG lungo il DNA nel tempo. (G) Il pannello superiore mostra un diagramma di un complesso DNA:CMG tenuto in posizione tra due perle di polistirene rivestite otticamente intrappolate anti-Dig scansionate da un laser a scansione confocale. Il pannello inferiore mostra un esempio di scansione 2D di CMG legato a un DNA tenuto in posizione con una trappola ottica. Il DNA non è etichettato in questi esperimenti, ma può essere pensato come una linea orizzontale che attraversa il centro dell'immagine. Questa cifra è stata modificata da²⁸. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempi di dati di un esperimento riuscito e di uno non riuscito. (A) Esempi di scansioni 2D di un DNA contenente CMG in un campione privo di aggregazione. In entrambe le scansioni, il CMG mostra macchie simmetriche e discrete limitate dalla diffrazione, scarsamente distribuite lungo il DNA. (B) Esempi di scansioni 2D di un DNA contenente CMG in un campione contenente aggregati. In entrambe le scansioni, il CMG forma macchie meno simmetriche che affollano il DNA. (C) Chimografo che mostra la posizione sul DNA di macchie limitate dalla diffrazione del CMG nel tempo in presenza di ATP, mostrando il movimento a lungo raggio dei complessi CMG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Passaggi critici e importanti controlli di qualità dei reagenti
Qui vengono evidenziati i passaggi critici e i controlli di qualità dei reagenti biologici nel test. In primo luogo, la purezza delle proteine utilizzate è importante perché la degradazione del DNA causata anche da piccoli contaminanti nucleasi nei campioni proteici influenzerà negativamente i dati. Questo perché solo le molecole di DNA intatte (o parzialmente intaccate) possono essere intrappolate nelle pinzette ottiche a doppio raggio. Ancora più importante, le tacche sul DNA causeranno la dissociazione di CMG⁴¹, complicando l'osservazione del movimento a lungo raggio di CMG. Si consiglia vivamente di testare l'attività nucleasica di ogni proteina purificata, nonché di monitorare costantemente l'integrità del substrato plasmidico di partenza per garantire che l'intaccatura sia ridotta al minimo. Il secondo passo importante è l'attenta rimozione delle biglie magnetiche dopo l'eluizione dei complessi DNA:CMG. La rimozione del surnatante in questa fase deve essere eseguita lentamente in modo da non disturbare le perle raccolte. Se le perle magnetiche vengono lasciate nel campione fatto volare nelle pinzette ottiche, spesso colpiscono le perle di polistirene intrappolate otticamente, causandone la fuoriuscita dalla trappola ottica e complicando l'acquisizione dei dati. Infine, i complessi DNA:CMG devono essere maneggiati con cura nelle pinzette ottiche. A tal fine, si raccomanda di non aumentare la tensione del DNA oltre i 10 pN, poiché l'applicazione della forza può dissociare il CMG dal DNA. Inoltre, il movimento tra i canali nella cella a flusso microfluidico dovrebbe essere fatto il più lentamente possibile (~ 0,2 mm/s) per evitare che le forze di trascinamento risultanti dissociino il CMG dal DNA.

Modifiche del metodo
Ci sono diverse fasi del test che potrebbero essere modificate. Ad esempio, abbiamo dimostrato che il tempo di eluizione può essere ridotto da 60 minuti a 30 minuti senza influire in modo significativo sulla resa dell'eluizione. Inoltre, si consiglia di integrare il tampone di eluizione con una concentrazione bassa (inferiore a 1 mM) di ATP o ATPγS per evitare che il CMG si diffonda dalle estremità del DNA e per stabilizzare in generale il CMG²⁸. Inoltre, sebbene le composizioni dei tamponi e le concentrazioni proteiche che riportiamo qui siano basate su quelle impiegate in precedenti lavori biochimici d'insieme e su singole molecole^11,18, il saggio che descriviamo è pienamente compatibile con altri protocolli per assemblare CMG^26,27. Pertanto, qualsiasi progresso biochimico riportato per aumentare l'efficienza dell'assemblaggio o dell'attivazione del CMG potrebbe e dovrebbe essere implementato nella maggior parte del saggio per aumentare la resa. Infine, l'aumento del tempo tra i fotogrammi aumenta il tempo totale in cui il CMG può essere visualizzato, facilitando l'osservazione del movimento del CMG a lungo raggio prima dello sbiancamento con fluoroforo.

Limitazioni del metodo
Il metodo ibrido che descriviamo è limitato in quanto è possibile visualizzare CMG solo dopo la sua attivazione in blocco. Sarà necessario ulteriore lavoro per osservare l'attivazione di CMG in tempo reale. Un'altra importante limitazione è che, mentre ci aspettiamo che il CMG sia assemblato in coppie 17,26,27, il numero totale di complessi CMG per DNA che osserviamo è per lo più uno ²⁸, suggerendo che il CMG, o almeno Cdc45, si dissocia dal DNA durante la manipolazione dei sensibili complessi DNA:CMG. La riduzione del numero di passaggi di manipolazione prima dell'imaging a singola molecola, nonché lo sviluppo di migliori strategie di passivazione per i tubi di plastica e il vetro della cella a flusso microfluidico, sono in grado di aumentare questa resa.

Significato del metodo
Gli studi sul movimento di una singola molecola di CMG hanno finora impiegato CMG pre-attivato purificato come complesso da cellule. Sebbene relativamente più semplice, questo approccio CMG pre-attivato è limitato in quanto manca uno qualsiasi dei passaggi che portano all'attivazione del CMG, così come la natura bidirezionale del CMG e del movimento replisome. D'altra parte, la ricostituzione completa dell'assemblaggio e dell'attivazione del CMG ha il potenziale per studiare qualsiasi fase di pre-attivazione, nonché per studiare il movimento del CMG in modo bidirezionale. Tuttavia, questo approccio è più difficile da tradurre dal livello biochimico di massa al livello di singola molecola, poiché coinvolge molti più fattori e passaggi proteici purificati. Il saggio che descriviamo qui ha contribuito a superare queste sfide permettendoci di visualizzare il movimento di CMG completamente ricostituito a livello di singola molecola, permettendoci di accedere ad alcune dinamiche di pre-attivazione precedentemente mancate²⁸. Inoltre, anche se vediamo per lo più un CMG per DNA, siamo stati in grado di osservare diverse istanze di due complessi CMG che si muovono in direzioni opposte e abbiamo persino potuto catturare la separazione iniziale di CMG fratelli l'uno dall'altro²⁸, fornendo alcune informazioni sulla creazione di una replicazione bidirezionale.

Un altro vantaggio di questo test rispetto al precedente movimento del CMG risiede nella natura completamente a doppio filamento del substrato di DNA che impieghiamo (Figura 1A). In precedenti lavori di CMG pre-attivato, il modo più comune di legare il CMG al substrato di DNA è attraverso un lembo di ssDNA da 3'. Ciò si traduce in un costrutto di DNA che non può essere facilmente vincolato torsionalmente e quindi impedisce lo studio del ruolo del superavvolgimento nella progressione del replosoma. Al contrario, il nuovo approccio che descriviamo qui potrebbe avere il potenziale per essere adattato per studiare il ruolo della coppia in questo processo, poiché il substrato di DNA utilizzato è completamente a doppio filamento.

Applicazioni più ampie del metodo
Il saggio ibrido descritto aprirà la strada verso la completa ricostituzione di un replisoma eucariotico completo, consentendo a noi e ad altri di osservare e quantificare le importanti dinamiche che consentono al reposoma di avere successo in tutti i suoi diversi compiti. Replicazione del DNA a parte, il saggio che riportiamo rappresenta un importante progresso nella traduzione di una complessa reazione biochimica dal livello biochimico di massa a quello di singola molecola. Prevediamo che questo test possa essere facilmente modificato per studiare interazioni DNA:proteine altrettanto complesse coinvolte in diversi meccanismi di elaborazione del DNA.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AflII	NEB	R0520L
Perle di polistirene rivestite anti-digossigenina	Spheroteck	DIGP-20-2
ATP soluzione	Thermo Fisher	R0441
ATPγ S	Roche	11162306001
BSA	NEB	B9000S
C-Trap	Lumicks
CutSmart Buffer	NEB	B6004S	Fornito con AflII
dCTP	Promega	U122B
D-Destiobiotin-7-dATP	Jena Bioscience	NU-835-Desthiobio
dGTP	Thermo Fisher	10218014
Digoxigenina-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
Dynabeads M-280 Perle magnetiche di streptavidina	Invitrogen	11205D
Frammento di Klenow (3'→ 5' eso-)	NEB	M0212L
Microspin S-400 HR	GE Healthcare	GE27-5140-01
NEBuffer2	NEB	B7002S	Fornito con frammento Klenow
Nonidet  P 40 Sostituto	Sigma	74385
Pluronic F-127	Sigma	P2443