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Isolamento, caratterizzazione e analisi proteomica di vescicole extracellulari derivate dal plasma per la scoperta di biomarcatori cardiovascolari

DOI:

10.3791/67083

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January 31st, 2025

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1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

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Questo articolo descrive una metodologia per l'isolamento, la caratterizzazione e la quantificazione di vescicole extracellulari (EV) derivate dal plasma umano e presenta un flusso di lavoro per l'analisi label-free del proteoma EV utilizzando cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).

Abstract

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Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle non replicabili di derivazione cellulare, racchiuse nel doppio strato lipidico. Le vescicole extracellulari stanno attualmente guadagnando attenzione nella ricerca cardiovascolare grazie al loro ruolo nella regolazione della comunicazione intercellulare, potenzialmente fungendo da preziosi biomarcatori per le malattie cardiovascolari. Tuttavia, il proteoma EV e il suo potenziale come biomarcatore nella diagnostica cardiovascolare rimangono poco compresi. Questo protocollo presenta un metodo standardizzato per l'isolamento e la quantificazione delle EV derivate dal plasma e l'analisi del loro carico proteico utilizzando campioni di plasma provenienti da pazienti che si presentano all'Unità di Dolore Toracico di un grande ospedale universitario. Dopo la flebotomia di routine, le EV vengono isolate dal plasma mediante ultracentrifugazione differenziale. L'arricchimento di specifiche proteine marcatrici EV negli isolati EV viene visualizzato mediante immunoblotting e la distribuzione dimensionale media e le concentrazioni plasmatiche di EV vengono quantificate mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle. Infine, la cromatografia liquida ad alte prestazioni e la spettrometria di massa tandem sono impiegate per l'analisi label-free del proteoma EV. Questo protocollo fornisce quindi un approccio completo per studiare e utilizzare le vescicole extracellulari derivate dal plasma come potenziali vettori di informazioni biologiche critiche, nonché per esplorare il loro potenziale come nuovi biomarcatori.

Introduction

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Le vescicole extracellulari (EV), per nomenclatura non uniformemente definita, sono nanoparticelle circondate da un doppio strato lipidico e rilasciate da vari tipi di cellule, prive della capacità di replicarsi1. Questo gruppo eterogeneo comprende gli esosomi, una sottopopolazione di EV di origine endosomiale, tipicamente compresa tra circa 40 nm e 160 nm di diametro2. Rilevabili in numerosi fluidi corporei3, le vescicole extracellulari facilitano la comunicazione intercellulare trasferendo varie biomolecole attive come proteine, mRNA, microRNA e lipidi. Pertanto....

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Protocol

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Per questo protocollo, è stata reclutata una coorte di pazienti esemplare composta da tre pazienti sani di controllo senza segni di malattia cardiovascolare apparente o sottostante e due pazienti con infarto miocardico non ST elevato (NSTEMI). L'approvazione preventiva è stata concessa dal Comitato di revisione istituzionale della Facoltà di Medicina dell'Università di Heidelberg (approvazione IRB #S-351/2015) e il consenso scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti prima del reclutamento. I pazienti sono stati reclutati dall'Unità di Dolore Toracico del Dipartimento di Cardiologia dell'Ospedale Universitario di Heidelberg sulla bas....

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Results

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Le EV sono state isolate da campioni di plasma (n = 3) di pazienti senza malattia cardiovascolare conclamata, nonché da pazienti con infarto del miocardio senza sopraslivellamento del tratto ST (NSTEMI; n = 2), utilizzando il protocollo di ultracentrifugazione differenziale stabilito. Un'adeguata separazione delle EV plasmatiche è stata confermata dall'immunoblotting delle proteine arricchite di EV TSG-101, annessina 5 (Anx5) e CD9 negli isolati di EV rispetto al plasma depleto di EV degli stessi pazienti (

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Discussion

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Questo protocollo fornisce una metodologia reale, passo dopo passo e pronta all'uso per la separazione e la caratterizzazione delle vescicole extracellulari plasmatiche, nonché un'introduzione a un'analisi del proteoma non marcato adatta per l'integrazione nella pratica clinica di routine. Una descrizione dettagliata e il rigoroso rispetto di una metodologia unificata per l'isolamento delle vescicole extracellulari da campioni di plasma sono importanti per garantire la riproducibilità de.......

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Disclosures

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EG ha ricevuto onorari per docenti da Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim; ha ricevuto sovvenzioni istituzionali per la ricerca da Roche Diagnostics e Daiichi Sankyo e lavora come consulente per Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis e Boehringer Ingelheim, al di fuori del lavoro presentato. JBK ha ricevuto finanziamenti relativi al progetto dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK) e da Roche Diagnostics. Gli altri autori dichiarano di non avere conflitti di interesse in relazione all'opera presentata.

Acknowledgements

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Gli autori ringraziano Heidi Deigentasch, Amelie Werner ed Elisabeth Mertz per il loro supporto organizzativo durante questo progetto.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Bufffer per campioni LaemmliBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
Flacone in policarbonato da 26,3 mL con tappo per ultracentrifugazioneBeckman Coulter355654
5810R Centrifuga da bancoEppendorf5811000015
Acetonitrile (ACN)Biosolve0001204101BS
Ditiotreitolo (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537
Acido formico 99% ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
Iodoacetamide (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
Spettrometro di massa Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS tampone di corsaThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical NS300
Nanosight NTA 3.2 SoftwareMalvern Panalytical 
NuPAGE 4  bis 12 %, gel proteici Bis-TrisInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 ultracentrifuga da pavimentoBeckman Coulter521-4180
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific26619
Cocktail di inibitori della proteasi/fosfatasi (100X)Cell Signaling Technology5872S
Marcatore proteicoThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Spettrometro di massa ibrido quadrupolo-orbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
Colorazione rapida Serva35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 &; m 1 gDr. Maischr119.aq.0001
SDS-PAGE gel commercialeThermo FisherNW00100BOX
S-Monovette  Citrat 9NC 0,106 mol/l 3,2%Sarstedt02.1067.001
Concentratore Speed vacSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, giugno 2020) database di proteineUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Tampone bicarbonato di trietilammonio (TEAB)Sigma-AldrichT7408
Acido trifluoroacetico (TFA) per HPLC >99%, 100 mLSigma-Aldrich302031-100ML
Tripsina MS-GradeThermo Fisher90058
Tipo 50.2 Ti Rotore ad angolo fissoColtro Beckman337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
WaterBiosolve0023214102BS

References

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  1. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Kalluri, R., Lebleu, V. S.

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Plasma Extracellular VesiclesCardiovascular BiomarkersEV IsolationProteomic AnalysisNanoparticle TrackingDifferential UltracentrifugationImmunoblottingProtein BiomarkersClinical ProteomicsPlasma Biomarker Discovery

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