Method Article

Isolamento, caratterizzazione e analisi proteomica di vescicole extracellulari derivate dal plasma per la scoperta di biomarcatori cardiovascolari

DOI:

10.3791/67083

⸱

January 31st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Angiology and Pulmonology, University Hospital Heidelberg, 2Heart and Vascular Center, Semmelweis University, 3Core Facility for Mass Spectrometry and Proteomics, Centre for Molecular Biology at Heidelberg University (ZMBH), 4German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner site Heidelberg/Mannheim

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo descrive una metodologia per l'isolamento, la caratterizzazione e la quantificazione di vescicole extracellulari (EV) derivate dal plasma umano e presenta un flusso di lavoro per l'analisi label-free del proteoma EV utilizzando cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle non replicabili di derivazione cellulare, racchiuse nel doppio strato lipidico. Le vescicole extracellulari stanno attualmente guadagnando attenzione nella ricerca cardiovascolare grazie al loro ruolo nella regolazione della comunicazione intercellulare, potenzialmente fungendo da preziosi biomarcatori per le malattie cardiovascolari. Tuttavia, il proteoma EV e il suo potenziale come biomarcatore nella diagnostica cardiovascolare rimangono poco compresi. Questo protocollo presenta un metodo standardizzato per l'isolamento e la quantificazione delle EV derivate dal plasma e l'analisi del loro carico proteico utilizzando campioni di plasma provenienti da pazienti che si presentano all'Unità di Dolore Toracico di un grande ospedale universitario. Dopo la flebotomia di routine, le EV vengono isolate dal plasma mediante ultracentrifugazione differenziale. L'arricchimento di specifiche proteine marcatrici EV negli isolati EV viene visualizzato mediante immunoblotting e la distribuzione dimensionale media e le concentrazioni plasmatiche di EV vengono quantificate mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle. Infine, la cromatografia liquida ad alte prestazioni e la spettrometria di massa tandem sono impiegate per l'analisi label-free del proteoma EV. Questo protocollo fornisce quindi un approccio completo per studiare e utilizzare le vescicole extracellulari derivate dal plasma come potenziali vettori di informazioni biologiche critiche, nonché per esplorare il loro potenziale come nuovi biomarcatori.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le vescicole extracellulari (EV), per nomenclatura non uniformemente definita, sono nanoparticelle circondate da un doppio strato lipidico e rilasciate da vari tipi di cellule, prive della capacità di replicarsi1. Questo gruppo eterogeneo comprende gli esosomi, una sottopopolazione di EV di origine endosomiale, tipicamente compresa tra circa 40 nm e 160 nm di diametro2. Rilevabili in numerosi fluidi corporei3, le vescicole extracellulari facilitano la comunicazione intercellulare trasferendo varie biomolecole attive come proteine, mRNA, microRNA e lipidi. Pertanto, le EV forniscono informazioni sulla loro cellula di origine attraverso marcatori di superficie e biomolecole specifici della cellula, con le loro proprietà fortemente influenzate dalle condizioni della cellula madre e del suo ambiente4. Queste caratteristiche hanno portato a un crescente interesse per il potenziale ruolo delle vescicole extracellulari come biomarcatori, in particolare nel contesto delle malattie cardiovascolari.

Numerosi studi in vitro e in vivo hanno dimostrato che lo stress ipossico miocardico porta ad un aumento del rilascio di EV 5,6,7. La ricerca contemporanea sul carico EV si è in gran parte concentrata sul microRNA legato alle EV, che ha il potenziale per fungere da biomarcatore nella diagnosi di varie malattie cardiovascolari 8,9,10. Al contrario, le prove sul proteoma EV circolante rimangono relativamente scarse, con ancora meno studi che indagano l'EV plasmatica nei pazienti cardiovascolari. In due studi completi sulla vescicola extravescicoidale derivata dal plasma da pazienti affetti da infarto del miocardio, gli autori hanno identificato un profilo specifico del proteoma vescicoidale extracellulare indotto da ischemia con potenziale rilevanza diagnostica 6,11.

L'elaborazione metodologica delle vescicole extracellulari si è storicamente dimostrata impegnativa e attualmente non esiste una raccomandazione definitiva per l'approccio ottimale all'isolamento, alla caratterizzazione e alla quantificazione delle vescicole extracellulari. I metodi comunemente usati per l'isolamento delle vescicole extracellulari includono l'ultracentrifugazione differenziale, la centrifugazione a gradiente di densità e i metodi di filtrazione come la cromatografia ad esclusione dimensionale1. Secondo le attuali linee guida di consenso, la caratterizzazione degli isolati di EV dovrebbe includere l'evidenza di almeno tre marcatori proteici tipici di superficie EV, come tetraspanine o annessine, combinati con una modalità di imaging1. Per esaminare il carico di EV a livello proteico, vengono utilizzati più frequentemente metodi basati su anticorpi come il Western blot o l'ELISA.

Date le sfide metodologiche associate all'isolamento e all'elaborazione delle vescicole extracellulari circolanti, questo protocollo presenta un percorso completo dal reclutamento dei pazienti e dalla raccolta dei campioni al successivo isolamento, caratterizzazione e quantificazione delle vescicole extracellulari plasmatiche. Inoltre, questo studio mostra un flusso di lavoro per l'isolamento immediato delle vescicole extracellulari derivate dal plasma dai pazienti che si presentano al pronto soccorso (Chest Pain Unit) presso un centro di assistenza terziaria nel sud-ovest della Germania, seguito dall'analisi senza marcatura del proteoma plasmatico EV specifico per la malattia mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). L'obiettivo è quello di facilitare un'analisi ad alto rendimento per identificare proteine differenzialmente arricchite legate alle EV in un'ampia coorte di pazienti con diverse malattie cardiovascolari ischemiche, congenite o (auto)immuni alla diagnosi iniziale e durante la progressione e/o la risoluzione della malattia. Questo approccio di screening proteomico cerca di identificare modelli di arricchimento proteico specifico per le vescicole extracellulari associato a percorsi patologici distinti, con l'obiettivo finale di scoprire nuovi biomarcatori proteici legati alle vescicole extracellulari per migliorare l'attuale diagnostica e il monitoraggio terapeutico nelle malattie cardiovascolari.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per questo protocollo, è stata reclutata una coorte di pazienti esemplare composta da tre pazienti sani di controllo senza segni di malattia cardiovascolare apparente o sottostante e due pazienti con infarto miocardico non ST elevato (NSTEMI). L'approvazione preventiva è stata concessa dal Comitato di revisione istituzionale della Facoltà di Medicina dell'Università di Heidelberg (approvazione IRB #S-351/2015) e il consenso scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti prima del reclutamento. I pazienti sono stati reclutati dall'Unità di Dolore Toracico del Dipartimento di Cardiologia dell'Ospedale Universitario di Heidelberg sulla base della presentazione clinica iniziale, dell'anamnesi e dei risultati dei test diagnostici.

I criteri di inclusione per i pazienti sani di controllo includevano la presentazione clinica atipica o aspecifica, i livelli di biomarcatori cardiaci entro i limiti normali, l'assenza di anamnesi di malattia cardiovascolare e i risultati normali su ulteriori test diagnostici. I criteri di esclusione includevano una storia di malignità o terapia citostatica negli ultimi cinque anni, emodialisi, sindromi da iperlipidemia familiare e qualsiasi storia di malattia cardiovascolare. L'NSTEMI è stato diagnosticato seguendo le attuali linee guida12, con stenosi coronarica emodinamicamente rilevante confermata dall'angiografia coronarica. Per ogni paziente, sono stati raccolti fino a 36 ml di sangue dalla vena antecubitale in provette di raccolta integrate con citrato tramite flebotomia13 standard e i campioni di sangue sono stati immediatamente trasportati a 4 °C per un'ulteriore elaborazione. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Isolamento delle vescicole extracellulari mediante centrifugazione differenziale

NOTA: È stato impiegato un protocollo di centrifugazione differenziale per isolare l'EV da campioni di plasma umano. Sono stati condotti due cicli di ultracentrifugazione (UC) con forza centrifuga crescente per massimizzare la purezza del pellet EV risultante.

  1. Isolamento al plasma
    1. Iniziare a elaborare campioni di sangue intero, raffreddati a 4 °C, entro 120 minuti dalla raccolta per garantire l'integrità delle vescicole extracellulari al plasma. Utilizzare provette per la raccolta del sangue integrate con citrato (0,106 mol/L di citrato) per prevenire la coagulazione.
    2. Diluire 9 mL di sangue intero citrato 1:1 in soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) per ridurre la viscosità. Aggiungere 5 mL di terreno a gradiente di densità (1,077 g/mL) per la separazione durante la centrifugazione.
    3. Centrifugare a 600 × g per 25-30 min a 4 °C. Pipettare con cura la frazione plasmatica dalla parte superiore di ciascuna colonna in provette da centrifugazione specializzate. Procedere con i passaggi successivi o congelare a -80 °C.
  2. Rimozione di detriti cellulari e corpi apoptotici
    1. Centrifugare il plasma a 20.000 × g per 15 minuti a 4 °C utilizzando un'ultracentrifuga con rotore ad angolo fisso, senza frenare. Sul fondo del tubo dovrebbe formarsi un pellet visibile di detriti cellulari e corpi apoptotici.
  3. Isolamento EV
    1. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Ultracentrifugare a 100.000 × g per 2 ore a 4 °C, senza frenare, per isolare l'EV, che formerà un pellet visibile sulla parete del tubo.
    2. Pipettare con cura il surnatante utilizzando una pipetta elettronica, lasciando circa 1 mL di plasma impoverito di EV. Passa a una pipetta da 1000 μl per il plasma rimanente, pipettando lentamente per evitare di disturbare il pellet EV. Inclinare gradualmente la provetta durante il pipettaggio per assicurarsi che non rimanga plasma nella provetta.
  4. Preparazione per l'analisi a valle
    1. Risospendere il pellet EV isolato in base ai requisiti dell'analisi a valle: per il tracciamento delle nanoparticelle, risospendere il pellet EV da 9 mL di sangue intero in 200 μL di PBS; per la LC-MS/MS, risospendere l'EV isolata da 36 mL di sangue intero in 50 μL di tampone RIPA 1x con inibitore della proteasi/fosfatasi all'1%
    2. Trasferire il pellet EV risospeso in una provetta da 1,5-2 mL. Conservare a -80 °C fino a ulteriori analisi o procedere secondo necessità.

2. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle

NOTA: La quantificazione della distribuzione media delle dimensioni delle EV nei campioni di plasma umano è stata condotta utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), un metodo di rilevamento basato su laser che analizza il moto browniano delle nanoparticelle.

  1. Diluizioni di lavoro per NTA
    1. Diluire la soluzione madre EV (pellet EV risospeso in 200 μL di PBS) con PBS ghiacciato in rapporti di 1:10, 1:50, 1:100 e 1:200. Creare varie diluizioni di lavoro per determinare la diluizione più adatta per ottenere un conteggio finale di 10-100 nanoparticelle per fotogramma durante il tracciamento delle nanoparticelle.
  2. Esecuzione di NTA
    1. Accendere lo strumento NTA e avviare il software applicabile sul computer collegato. Posiziona la camera all'interno della bara laser e fai clic su Avvia fotocamera per attivarla.
    2. Aspirare 1 mL di PBS in una siringa. Collegare la siringa al tubo anteriore e lavare accuratamente il sistema di tubi, assicurandosi che non rimanga aria nella camera. Monitora la telecamera per rilevare eventuali bolle d'aria o particelle contaminanti.
    3. Aspirare la diluizione di lavoro EV preparata in una siringa da 1 mL e iniettarla nella camera.
    4. Regolate il guadagno dello schermo in modo che corrisponda alla luminosità del monitor nelle schede Acquisizione ed Elaborazione . Modifica il livello della fotocamera per differenziare chiaramente le nanoparticelle sullo schermo.
    5. Impostare una soglia di rilevamento appropriata nella scheda Processo per regolare la sensibilità per differenziare le particelle dal rumore di fondo. Mantenere costante questo valore per tutte le misurazioni all'interno dello stesso esperimento.
    6. Metti a fuoco la fotocamera utilizzando la rotella su ciascun lato dello strumento fino a quando le nanoparticelle appaiono nitide sullo schermo.
    7. Impostare una temperatura costante (idealmente 22 °C) per tutte le misurazioni nelle impostazioni hardware , poiché il movimento browniano dipende dalla temperatura.
    8. Fare clic sul pulsante Esegui per avviare la misurazione. Immettere l'ID del campione e il solvente nella finestra pop-up.
    9. Registrare un minimo di tre video da 30 secondi per ogni esecuzione di campionamento. Far avanzare il campione tra le misurazioni per acquisire un campione rappresentativo della soluzione di nanoparticelle. Se è disponibile una pompa a siringa, impostarla a una velocità costante e registrare continuamente.
    10. Dopo la registrazione, il software calcola automaticamente la concentrazione e la distribuzione dimensionale delle nanoparticelle. Fare clic su Modifica per inserire il fattore di diluizione utilizzato per il campione, quindi salvare i risultati facendo clic su Esporta.
  3. Analisi dei dati
    1. Analizza i risultati utilizzando i file di output in un programma software statistico.

Analisi label-free del proteoma EV mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS)

NOTA: L'analisi del proteoma EV label-free è stata condotta utilizzando la separazione iniziale delle proteine attraverso l'elettroforesi su gel delle proteine EV dopo la lisi della membrana. Dopo la digestione delle proteine in gel con tripsina, i peptidi sono stati analizzati utilizzando LC-MS/MS, con spettri individuali confrontati con un database di proteomi umani. In particolare, se si desidera un'analisi non mirata dei lisati EV, si raccomanda la proteomica shotgun senza previa selezione di uno specifico intervallo di peso molecolare, rendendo superflui i passaggi 3.1.1-3.1.7 di questo protocollo.

  1. Digestione della tripsina in gel
    1. Preparare una soluzione di EV risospeso in 1x tampone RIPA aggiungendo il tampone di caricamento Laemmli secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali). Far bollire i campioni a 95 °C per 5 minuti.
    2. Caricare i campioni di EV, integrati con tampone di caricamento, insieme a una scala proteica su gel di Bis-Tris al 4%-12% per l'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE)14. Colorare il gel con Coomassie Blue per 1-4 ore per visualizzare le bande proteiche. Decolorare il gel con acqua incubando per una notte.
    3. Accisa di bande colorate con Coomassie da regioni di gel contenenti proteine di interesse utilizzando una lama di bisturi.
    4. Lavare i pezzi di gel con 60 μl di tampone bicarbonato di trietilammonio 1:1 (v/v) 50 mM (TEAB) e acetonitrile (ACN), pH 8,5, per 10 minuti. Restringere i pezzi di gel tre volte per 10 minuti ciascuno in 60 μL di ACN. Lavare nuovamente con 60 μl 50 mM TEAB, pH 8,5.
    5. Ridurre le proteine con 10 mM di ditiotreitolo (DTT) in 100 mM di TEAB a 57 °C per 30 minuti e disidratare i pezzi di gel.
    6. Alchilare le proteine con 10 mM di iodoacetamide (IAA) in 100 mM di TEAB a 25 °C per 20 minuti al buio.
    7. Lavare i pezzi di gel con 60 μL di 100 mM di TEAB e restringerli due volte per 10 minuti ciascuno in 60 μL di ACN.
    8. Aggiungere 50 mM di soluzione di tripsina TAB, concentrata di conseguenza, ai pezzi di gel secco. Incubare per 4 ore a 37 °C. Estinguere la reazione aggiungendo 20 μl di acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1%.
    9. Estrarre i peptidi risultanti incubando con 30 μl di TFA 1:1 (v/v) 0,1% e ACN per 30 minuti. Disidratare i gel con 20 μL di ACN per 20 min, quindi lavare nuovamente con 30 μL di 100 mM TEAB per 20 min.
    10. Restringere il gel due volte con 20 μL di ACN per 20 minuti ciascuno.
    11. Concentrare il surnatante raccolto da ogni fase di estrazione in una centrifuga sottovuoto e sciogliere il campione in 15 μl di TFA allo 0,1%.
  2. Analisi LC-MS/MS
    1. Esecuzione dell'analisi LC-MS/MS nanoflow utilizzando uno spettrometro di massa per cromatografia liquida ad alta risoluzione accoppiato a un analizzatore di trappole ioniche elettrostatiche.
    2. Utilizzare acido formico (FA) allo 0,1%/ACN all'1% come solvente A e FA allo 0,1%/ACN all'89,9% come solvente B.
    3. Separare i peptidi in un gradiente lineare di 25 minuti: iniziare dal 3% di solvente B, aumentare B al 23% in 21 minuti, quindi al 38% in 4 minuti e procedere con un lavaggio al 95% B.
    4. Aziona lo spettrometro di massa in modalità di acquisizione dipendente dai dati, alternando automaticamente tra MS e MS2. Acquisizione di spettri MS (m/z 400-1600) con una risoluzione di 60.000 a m/z 400, generando spettri MS2 per un massimo di 15 precursori utilizzando un'energia di collisione normalizzata di 27 e una larghezza di isolamento di 1,4 m/z.
  3. Ricerca nel database delle proteine
    1. Ricerca degli spettri MS/MS rispetto al database delle proteine Swiss-Prot Homo sapiens (UP000005640, giugno 2020) e a un database personalizzato di contaminanti (parte di MaxQuant, MPI Martinsried15,16) utilizzando Proteome Discoverer 2.5 con Sequest HT.
    2. Configurare le impostazioni del programma come segue: impostare la tolleranza di massa dello ione frammento su 0,02 Da e la tolleranza di massa dello ione genitore su 5 ppm. Specificare la tripsina come enzima utilizzato per la digestione e impostare il carbamidometile come modificazione fissa per la cisteina, con ossidazione (metionina) e deamidazione (asparagina, glutammina) come modificazioni variabili. Includono l'acetilazione, la perdita di metionina e la loro combinazione come modifiche variabili del terminale proteico.
    3. Quantificare i peptidi utilizzando la modalità quantificatore di ioni precursori, utilizzando il metodo Top N Average (n = 3) per il calcolo dell'abbondanza proteica17.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le EV sono state isolate da campioni di plasma (n = 3) di pazienti senza malattia cardiovascolare conclamata, nonché da pazienti con infarto del miocardio senza sopraslivellamento del tratto ST (NSTEMI; n = 2), utilizzando il protocollo di ultracentrifugazione differenziale stabilito. Un'adeguata separazione delle EV plasmatiche è stata confermata dall'immunoblotting delle proteine arricchite di EV TSG-101, annessina 5 (Anx5) e CD9 negli isolati di EV rispetto al plasma depleto di EV degli stessi pazienti (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo fornisce una metodologia reale, passo dopo passo e pronta all'uso per la separazione e la caratterizzazione delle vescicole extracellulari plasmatiche, nonché un'introduzione a un'analisi del proteoma non marcato adatta per l'integrazione nella pratica clinica di routine. Una descrizione dettagliata e il rigoroso rispetto di una metodologia unificata per l'isolamento delle vescicole extracellulari da campioni di plasma sono importanti per garantire la riproducibilità de...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EG ha ricevuto onorari per docenti da Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Bayer Vital GmbH, AstraZeneca, Lilly Deutschland, Boehringer Ingelheim; ha ricevuto sovvenzioni istituzionali per la ricerca da Roche Diagnostics e Daiichi Sankyo e lavora come consulente per Roche Diagnostics, BRAHMS Thermo Scientific, Astra Zeneca, Novartis e Boehringer Ingelheim, al di fuori del lavoro presentato. JBK ha ricevuto finanziamenti relativi al progetto dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK) e da Roche Diagnostics. Gli altri autori dichiarano di non avere conflitti di interesse in relazione all'opera presentata.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano Heidi Deigentasch, Amelie Werner ed Elisabeth Mertz per il loro supporto organizzativo durante questo progetto.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4x Bufffer per campioni LaemmliBio-rad1610747
10x RIPA-BufferAbcamab156034
Flacone in policarbonato da 26,3 mL con tappo per ultracentrifugazioneBeckman Coulter355654
5810R Centrifuga da bancoEppendorf5811000015
Acetonitrile (ACN)Biosolve0001204101BS
Ditiotreitolo (DTT)Sigma-Aldrich43816-10ML
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537
Acido formico 99% ULC/MS 100Biosolve0006914143BS
Histopaque - 1077Sigma-Aldrich10771
Iodoacetamide (IAA)Sigma-AldrichI6125-5G
Spettrometro di massa Orbitrap Q Exactive HFThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS tampone di corsaThermo FisherB0001
NanoSight NS300Malvern Panalytical NS300
Nanosight NTA 3.2 SoftwareMalvern Panalytical 
NuPAGE 4  bis 12 %, gel proteici Bis-TrisInvitrogenNP0323
Optima XPN-80 ultracentrifuga da pavimentoBeckman Coulter521-4180
PageRuler Plus Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific26619
Cocktail di inibitori della proteasi/fosfatasi (100X)Cell Signaling Technology5872S
Marcatore proteicoThermo Fisher26616
Proteome Discoverer 2.5Thermo Fisher
Q Exactive Plus Spettrometro di massa ibrido quadrupolo-orbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
Colorazione rapida Serva35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 &; m 1 gDr. Maischr119.aq.0001
SDS-PAGE gel commercialeThermo FisherNW00100BOX
S-Monovette  Citrat 9NC 0,106 mol/l 3,2%Sarstedt02.1067.001
Concentratore Speed vacSavant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, giugno 2020) database di proteineUniProthttps://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Tampone bicarbonato di trietilammonio (TEAB)Sigma-AldrichT7408
Acido trifluoroacetico (TFA) per HPLC >99%, 100 mLSigma-Aldrich302031-100ML
Tripsina MS-GradeThermo Fisher90058
Tipo 50.2 Ti Rotore ad angolo fissoColtro Beckman337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
WaterBiosolve0023214102BS

References

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