Questo protocollo è progettato per studiare l'entità del danno al DNA che si verifica durante la replicazione del DNA. In condizioni neutre, l'induzione di rotture del DNA può essere facilmente valutata in un breve lasso di tempo. Inoltre, il protocollo è adattabile ad altri tipi di cellule e a vari reagenti per lo stress di replicazione.
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Articolo metodologico
Rilevamento di rotture del DNA nelle cellule umane in divisione mediante saggio della cometa neutra
In questo articolo
Sommario
Abstract
La replicazione del DNA è costantemente messa alla prova da un'ampia varietà di fattori di stress endogeni ed esogeni che possono danneggiare il DNA. Tali lesioni riscontrate durante la duplicazione del genoma possono bloccare i replisomi e convertire le forcelle di replicazione in rotture a doppio filamento. Se non riparate, queste rotture tossiche del DNA possono innescare riarrangiamenti cromosomici, portando a una maggiore instabilità del genoma e a una maggiore probabilità di trasformazione cellulare. Inoltre, le cellule tumorali mostrano uno stress di replicazione persistente, rendendo il targeting delle vulnerabilità della forcella di replicazione nelle cellule tumorali una strategia attraente per la chemioterapia. Una tecnica altamente versatile e potente per studiare le rotture del DNA durante la replicazione è il saggio della cometa. Questa tecnica di elettroforesi su gel rileva in modo affidabile l'induzione e la riparazione di rotture del DNA a livello di singola cellula. In questo articolo, viene delineato un protocollo che consente ai ricercatori di misurare l'entità del danno al DNA nelle cellule umane che si dividono mitoticamente utilizzando agenti di stallo a forcella su più tipi di cellule. L'abbinamento di questo con il punteggio automatico delle comete facilita l'analisi rapida e migliora l'affidabilità nello studio dell'induzione delle rotture del DNA.
Introduzione
Il saggio della cometa è un metodo di elettroforesi su gel utilizzato per rilevare le rotture del DNA a livello di singola cellula. Si basa sul principio che le rotture aperte del DNA migrano in condizioni elettroforetiche, mentre il DNA intatto rimane in gran parte statico. Il DNA rotto migra perché le rotture provocano il rilassamento del DNA superavvolto, causando il suo graduale trasferimento spaziale verso l'anodo nella camera elettroforetica, che si traduce in un aspetto simile a una cometa osservato dall'immunofluorescenza 1,2. L'entità del danno al DNA viene quindi misurata quantificando la quantità di....
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Protocollo
Questo protocollo (Figura 1) utilizza principalmente linee cellulari tumorali U2OS aderenti, ma è adattabile a un'ampia varietà di cellule aderenti e in sospensione coltivate in coltura tissutale. Le soluzioni e i tamponi utilizzati in questo studio sono descritti in dettaglio nella Tabella 1. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione dei materiali
- Prima del giorno dell'esperimento, mettere il flacone fornito con agarosio a basso punto di fusione (1% di agarosio a basso punto di fusione in PBS) in un bagno d....
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Risultati
Analisi dell'induzione di rottura da parte di reagenti per stress di replicazione
Le cellule U2OS sono state trattate con DMSO, 4 di mM idrossiurea (HU) o 100 nM di CPT per 4 ore e analizzate per l'accumulo di rottura mediante il test NC (Figura 6A). Mentre la CPT induce rotture durante la fase S bloccando la topoisomerasi-113, la deplezione dei pool nucleotidici indotta da HU blocca le forcelle di replicazione che vengono progressivamente converti.......
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Discussione
Questo protocollo delinea un saggio NC per valutare le rotture del DNA nelle cellule umane sottoposte a replicazione attiva. Il protocollo è relativamente semplice da eseguire e i ricercatori possono adattarlo facilmente a condizioni di pH elevato per le analisi alcaline8. Include due passaggi critici, come descritto nei passaggi 3.7 e 4.5. Nella fase 3.7, è essenziale diffondere uniformemente l'agarosio fuso con le cellule attraverso il pozzetto per evitare che le comete si sovrappongano durante .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri del laboratorio di Dungrawala per il loro contributo e feedback. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NIH R35GM137800 alla MH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | |
| Camptothecin | S1288 | ||
| Comet LMAgarose (LMA) | R& D systems | 4250-050-02 | |
| CometAssay Electrophoresis System II | R& D systems | 4250-050-ES | Include serbatoio per elettroforesi, coperchio di sicurezza, cavi, vassoi per vetrini da 2/20 pozzetti e sovrapposizione per vassoi per vetrini |
| Software CometScore | TriTek | open source | |
| CometSlide | R& D systems | 4250-050-03 | |
| DMEM, | Gibco | glucosio 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | FisherSci | D128-4 | |
| Microscopio per epifluorescenza | Keyence | BZ-X810 | |
| Siero fetale bovino - Premium | Bio-Techne | S11150 | |
| Gibco Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo | Gibco | 25300054 | |
| GraphPad Prism 10.0 | GraphPad | ||
| HEK293T cellule | ATCC | CRL-11268 | |
| cellule hTERT-RPE-1 | ATCC | CRL-4000 | |
| Idrossiurea | Millipore Sigma | H8627 | |
| Inibitore PARP Olaparib | Selleckchem | S8096 | |
| PowerPac | FisherSci | FB300Q | |
| Piastra per coltura tissutale sterile con trattamento superficiale | FisherSci | FB012927 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10.000x) | FisherSci | S7567 | |
| Cellule U2OS | ATCC | HTB-96 | |
| UVP Incubatore di ibridazione HB-1000 | FisherSci | UVP95003001 |
Riferimenti
- Olive, P. L. Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids. Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E.
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Ristampe e permessi
