Articolo metodologico

Generazione di organoidi vascolari da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

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DOI:

10.3791/67125

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13 dicembre 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2College of Dental Medicine, Division of Periodontics, Columbia University, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University at Buffalo, The State University of New York

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta un metodo per generare organoidi vascolari utilizzando cellule staminali pluripotenti umane.

Abstract

Gli organoidi vascolari derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) ricapitolano la diversità dei tipi cellulari e la complessa architettura delle reti vascolari umane. Questo modello tridimensionale (3D) ha un notevole potenziale per la modellazione della patologia vascolare e lo screening dei farmaci in vitro . Nonostante i recenti progressi, rimane una sfida tecnica fondamentale per la generazione riproducibile di organoidi con una qualità costante, che è fondamentale per i saggi e le applicazioni a valle. Qui viene presentato un protocollo modificato che migliora sia l'omogeneità che la riproducibilità della generazione di organoidi vascolari. Il protocollo modificato incorpora l'uso di micropozzetti e del cocktail CEPT (chroman 1, emricasan, poliammine e l'inibitore integrato della risposta allo stress, trans-ISRIB) per migliorare la formazione del corpo embrioide e la sopravvivenza cellulare. Gli organoidi vascolari maturi e differenziati generati utilizzando questo protocollo sono caratterizzati dalla microscopia a immunofluorescenza 3D a montaggio intero per analizzarne la morfologia e la vascolarizzazione complessa. Questo protocollo consente la produzione di organoidi vascolari di alta qualità in modo scalabile, facilitando potenzialmente il loro utilizzo nella modellazione delle malattie e nelle applicazioni di screening dei farmaci.

Introduzione

Nell'ultimo decennio sono emersi modelli microfisiologici in vitro, inclusi organoidi e sistemi tissue-on-a-chip 1,2,3. Questi sistemi tridimensionali (3D) derivati da cellule umane affrontano i limiti delle colture cellulari bidimensionali convenzionali (2D) e dei modelli animali, come la mancanza di molti componenti nel microambiente fisiologico e le differenze genetiche tra le specie, rispettivamente. Forniscono più informazioni fisiologiche e sono più adatti per la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci rispetto ai modelli convenzionali. Tra i modelli microfisiologici, è stato dimostrato che gli organoidi derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) ricapitolano efficacemente le caratteristiche architettoniche dei tessuti umani nativi e sono stati sviluppati per imitare diversi organi umani, tra cui il cervello 4,5, il rene6, il fegato 7,8 e la retina9. Qui, ci concentriamo in particolare sulla generazione di organoidi vascolari da hiPSC e delineiamo un protocollo semplificato che mira a ridurre al minimo le variazioni tra diversi campioni e lotti di organoidi, migliorando così la riproducibilità complessiva.

La vascolarizzazione svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi fisiologica in tutti gli organi umani. La formazione del sistema vascolare coinvolge i processi di vasculogenesi e angiogenesi, orchestrati attraverso le interazioni tra cellule endoteliali e murali (ad esempio, periciti e cellule muscolari lisce vascolari) e influenzati da vari stimoli10. Penninger, Wimmer e colleghi hanno sviluppato il primo metodo di generazione di organoidi vascolari11,12 che imita questi due processi. Con gli organoidi generati da questo metodo, il loro gruppo12 e noi13,14 hanno dimostrato il potenziale degli organoidi vascolari per la modellazione di disfunzioni vascolari nelle malattie. Ad esempio, nei nostri recenti lavori 13,14, sono stati osservati fenotipi distinti, come la germinazione dei vasi e le variazioni della composizione cellulare murale, tra gli organoidi vascolari che imitano la malattia e le loro controparti wild-type. Questi esempi evidenziano che il modello di organoide vascolare potrebbe fungere da piattaforma per lo screening dei farmaci imitando i malfunzionamenti vascolari correlati alla malattia.

Costruito sui lavori iniziali di generazione di organoidi vascolari11,12, viene presentato un protocollo rivisto che include l'uso di micropozzetti per facilitare la formazione di corpi embrioidi omogenei (EB), un fattore critico per ridurre al minimo le variazioni spesso osservate all'interno dello stesso lotto di generazione di organoidi. Inoltre, il cocktail CEPT, una combinazione di cromo 1, emricasan, poliammine e l'inibitore integrato della risposta allo stress (trans-ISRIB)15, viene impiegato per migliorare la vitalità delle hiPSC e delle cellule differenziate durante il processo di formazione dell'EB. Questa modifica serve principalmente a ridurre le variazioni tra i diversi campioni e lotti di organoidi. Con questo protocollo della durata di circa due settimane, è possibile produrre organoidi vascolari uniformi, in cui la vasculogenesi viene indotta per aiutare l'endotelio a organizzarsi in reti tubulari primitive il giorno 1, seguita dall'induzione dell'angiogenesi il giorno 5 per sviluppare reti vascolari complesse negli organoidi. Nei giorni 12-15, gli organoidi generati dovrebbero mostrare reti vascolari mature composte sia da endotelio che da cellule murali.

Protocollo

La Figura 1 presenta una panoramica dei passaggi coinvolti in questo protocollo. Informazioni dettagliate sui reagenti e sui materiali utilizzati in questo protocollo sono riportate nella Tabella dei materiali. Si consiglia di preriscaldare tutti i fluidi a 37 °C prima dell'uso, se non diversamente specificato. Tutti i materiali e le forniture per la coltura cellulare devono essere sterilizzati in autoclave o sterili e la manipolazione delle cellule deve essere effettuata in una cabina di biosicurezza. Inoltre, il valore del pH della miscela di collagene I deve essere attentamente regolato a pH 7,3 per evitare possibili problemi di solidificazione.

1. Mantenimento dell'iPSC umana

  1. Scongelare l'estratto della matrice della membrana basale con ghiaccio, agitare delicatamente il flacone per miscelare la soluzione e preparare aliquote da 0,5 mL in provette per microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando una pipetta P1000 e puntali pre-refrigerati. Conservare le aliquote a -20 °C per un massimo di 1 anno.
  2. Scongelare un'aliquota di estratto di matrice (0,5 mL) con ghiaccio. Miscelare con 49,5 mL di terreno DMEM/F12 pre-raffreddato in una provetta da 50 mL. Distribuire la miscela in ciascun pozzetto (1,5 ml/pozzetto) in piastre a 6 pozzetti, quindi agitare delicatamente la piastra per assicurarsi che la soluzione liquida copra l'intero pozzetto. Sigillare le piastre con pellicola di paraffina e conservarle a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
  3. Preparare il mezzo di espansione hiPSC come descritto nella Tabella 1. Prelevare aliquote dell'intero terreno (40 mL/provetta) e conservare a -20 °C per un massimo di 1 anno.
  4. Mettere una piastra pre-rivestita nell'incubatore a 37 °C per 1 ora prima della coltura hiPSC.
  5. Preriscaldare il terreno di espansione hiPSC (40 mL) a 37 °C e preparare il terreno di semina hiPSC come descritto nella Tabella 2.
  6. Trasferire la piastra rivestita dall'incubatore a 37 °C alla camera di biosicurezza. Sostituire il terreno nella piastra rivestita con il terreno di semina hiPSC (1 mL/pozzetto).
  7. Scongelare una fiala crioconservata di hiPSC dal crioserbatoio in un bagno d'acqua a 37 °C per 1 minuto.
  8. Trasferire le cellule in una provetta da 15 mL e quindi aggiungere 5 mL di terreno DMEM/F12, seguito da centrifugazione a 100 x g per 3 minuti a temperatura ambiente per raccogliere le cellule.
  9. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule con 1,5 mL di terreno di semina hiPSC. Risospendere delicatamente le cellule nella provetta da 15 mL.
  10. Aliquotare 10 μl della sospensione cellulare e miscelare con 10 μl di soluzione di blu di tripano. Trasferire 10 μL di miscela nel vetrino dell'ematocitometro e coprirla con un vetrino coprioggetti.
  11. Montare la slitta sul supporto e inserirla nel contatore automatico di celle. Attendere che lo strumento trovi la messa a fuoco o regolare manualmente la messa a fuoco premendo il pulsante di messa a fuoco +/- sullo schermo. Successivamente, utilizzare l'impostazione predefinita e premere il pulsante Capture . Utilizzare la lettura della densità cellulare LIVE come concentrazione della sospensione hiPSC preparata dal punto 1.9.
  12. Seminare 2 × 105 celle in ogni pozzetto e assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente nel pozzetto.
  13. Coltivare le cellule a 37 °C con CO2 al 5% e sostituire il terreno con un terreno di espansione hiPSC (1,5 mL/pozzetto) dopo 24 ore.
  14. Cambiare il terreno ogni giorno fino a quando le celle raggiungono una confluenza dell'80%. Controllare regolarmente la morfologia cellulare e le dimensioni della colonia per garantire l'assenza di differenziazione spontanea. Scartare la coltura e ricominciare con un nuovo lotto di hiPSC se si osserva un'ampia differenziazione spontanea (>5%).

2. Formazione EB (Giorno 0)

  1. Il giorno 0, preparare e preriscaldare il terreno DMEM/F12, il terreno di semina hiPSC e la soluzione di distacco cellulare a 37 °C per 20-30 minuti.
  2. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra a 6 pozzetti e aggiungere la soluzione di distacco cellulare preriscaldata (1,5 mL/pozzetto). Incubare la piastra a 37 °C per 5-7 minuti.
  3. Trasferire la piastra nella cabina di biosicurezza, picchiettare la piastra per staccare le colonie di hiPSC e rompere gli aggregati.
  4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL. Aggiungere 4,5 mL di terreno DMEM/F12. Pipettare delicatamente la miscela su e giù utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL cinque volte per dissociare le cellule in una sospensione a cellula singola. Evita di generare bolle.
  5. Centrifugare a 100 x g per 3 minuti a temperatura ambiente per raccogliere le cellule.
  6. Aspirare il surnatante e risospendere delicatamente le cellule con 1 mL di terreno di semina hiPSC utilizzando una pipetta P1000.
  7. Miscelare 10 μl di sospensione cellulare con 10 μl di soluzione di blu di tripano per la conta cellulare. Trasferire 10 μl della miscela nel vetrino dell'ematocitometro e coprirlo con un vetrino coprioggetti. Montare la slitta sul supporto e inserirla nel contatore automatico di celle. Dopo che lo strumento ha trovato il fuoco, premere il pulsante Capture e utilizzare la lettura della densità cellulare LIVE per determinare la concentrazione della sospensione hiPSC.
  8. Seminare le cellule nella piastra per micropozzetti a fondo tondo a bassissimo attaccamento con una densità di 2,7 × 105 cellule/pozzetto per ottenere 500-1.000 cellule per EB.
  9. Aggiungere 2 mL di terreno di semina hiPSC in ciascun pozzetto e mescolare delicatamente la soluzione per distribuire uniformemente le cellule.
  10. Coltivare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2 per 24 ore.

3. Differenziazione vascolare (Giorno 1 - 5)

  1. Il giorno 1, preparare il mezzo di induzione del mesoderma (MIM) come descritto nella Tabella 3 e nella Tabella 4 e preriscaldarlo a 37 °C per 20 minuti. Il mezzo MIM deve essere preparato fresco.
  2. Utilizzare una pipetta P200 per aspirare con cura il terreno dalla piastra a micropozzetti senza disturbare gli EB sul fondo.
  3. Aggiungere lentamente 2,5 mL di MIM utilizzando una pipetta P200. Coltivare gli EB in MIM a 37 °C con il 5% di CO2 per 2 giorni.
  4. Il giorno 3, sostituire delicatamente il terreno con 2,5 mL preriscaldati e appena preparati del terreno di differenziazione vascolare 1 (VDM1, Tabella 5) senza disturbare gli EB sul fondo del micropozzetto. Coltivare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2 per altri 2 giorni.

4. Inclusione di idrogel (giorno 5)

  1. Preparare la miscela di collagene I come descritto nella Tabella 6. Posizionare una provetta da 50 ml sul ghiaccio e aggiungere successivamente la soluzione di collagene I, H2O, 10× DMEM/F12, bicarbonato di sodio e HEPES. Mescolare accuratamente agitando delicatamente il tubo. Aggiungere 1 soluzione di NaOH M goccia a goccia agitando la soluzione miscelata per regolare il valore del pH a 7,3 e controllare il valore del pH della miscela con un pHmetro.
    NOTA: Tutte le soluzioni devono essere pre-raffreddate con ghiaccio prima dell'uso. Eseguire sempre la procedura sul ghiaccio nella cabina di biosicurezza. L'aggiunta della soluzione di NaOH è fondamentale ed è necessaria una rapida dispersione per ottenere una soluzione omogenea per evitare la polimerizzazione locale del collagene I. Il volume di NaOH può variare in base al numero di lotto della soluzione di collagene I utilizzata. Non pipettare energicamente per la miscelazione, poiché lo sforzo di taglio potrebbe causare una pre-polimerizzazione indesiderata.
  2. Preparare la miscela di collagene I-matrice della membrana basale come descritto nella Tabella 7. Aggiungere 1,25 mL di matrice della membrana basale alla miscela di collagene I da 5 mL preparata dal passaggio 4.1. Mescolare delicatamente la soluzione agitando il tubo.
  3. Mettere una piastra a 12 pozzetti sul ghiaccio per 2 minuti.
  4. Aggiungere lentamente la miscela di matrice della membrana del basamento al collagene nella piastra a 12 pozzetti (1,5 mL/pozzetto) utilizzando le punte a foro largo. Assicurati che il composto sia distribuito uniformemente.
  5. Mettere la piastra nell'incubatore a 37 °C per 2 ore per solidificare il primo strato di idrogel.
  6. Conservare la restante miscela di collagene I-basement membrane matrix sul ghiaccio per un uso successivo.
  7. Trasferire ~60 aggregati cellulari in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e raffreddare la provetta con ghiaccio per 5 minuti. Rimuovere con cautela il terreno con un puntale per pipetta P200.
    NOTA: Iniziare questo passaggio 1,5 ore dopo il passaggio 4.5.
  8. Goccia a goccia, aggiungere 1,5 mL di miscela di collagene I-membrana basale agli aggregati e mescolarli delicatamente utilizzando puntali per pipette P200 a foro largo.
  9. Trasferire la piastra con il primo strato di idrogel dall'incubatore (passaggio 4.5) alla cappa di biosicurezza.
  10. Aggiungere 1,5 mL della sospensione aggregata sullo strato polimerizzato. Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente gli aggregati. Evitare di generare bolle.
  11. Incubare la piastra a 37 °C con CO2 al 5% per altre 2 ore.
  12. Preparare il mezzo di differenziazione vascolare 2 (VDM2; Tabella 8) e preriscaldare il fluido in un bagno d'acqua a 37 °C per 20 minuti prima dell'uso.
  13. Aggiungere 2 mL di VDM2 a ciascun pozzetto e coltivare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2.
  14. Cambiare il fluido ogni 3 giorni con VDM2 preriscaldato e appena fatto.
    NOTA: (Opzionale) Gli organoidi vascolari possono essere rilasciati dalla miscela di gel rimuovendo il gel con un ago da siringa. Gli organoidi vascolari recuperati dal gel possono essere conservati singolarmente in una piastra a 96 pozzetti con VDM2 (200 μL/pozzetto). Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni.

5. 3D Saggio di immunofluorescenza

  1. Gli organoidi vascolari dovrebbero diventare maturi all'incirca il giorno 13. Per gli organoidi incorporati nell'idrogel, aspirare accuratamente il terreno e lavare con 2 mL di PBS tre volte (10 min ogni volta). Per gli organoidi recuperati dal gel (dopo il passaggio 4.14), raccogliere 6-10 organoidi in una provetta da microcentrifuga da 2 mL, aspirare il terreno e lavare con 2 mL di PBS tre volte (10 min ciascuna).
  2. Aggiungere 2 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% al campione e incubare a 4 °C per una notte con sigillatura con film di paraffina.
  3. Rimuovere la soluzione di PFA e lavare il campione con 2 mL di PBS quattro volte (15 minuti ogni volta).
  4. Aggiungere 2 mL di tampone bloccante (Tabella 9) e incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
  5. Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere 1,5 mL di anticorpi primari (vedere la Tabella dei materiali per informazioni sugli anticorpi; gli anticorpi devono essere diluiti nel tampone bloccante). Incubare il campione con anticorpi primari a 4 °C per 2 giorni agitando delicatamente.
    NOTA: Si consiglia di diluire l'anticorpo primario (CD31, PDGFRβ ed ERG1) nel tampone bloccante con un rapporto di 1:400 (per ulteriori informazioni, vedere la Tabella dei materiali ).
  6. Rimuovere la soluzione di anticorpi primari e lavare con 2 mL di PBST per 1 ora sei volte.
  7. Aggiungere 2 mL di anticorpi secondari (vedere la Tabella dei materiali per le informazioni sugli anticorpi; gli anticorpi devono essere diluiti in PBST) al campione. Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio e incubare a 4 °C per 2 giorni agitando delicatamente.
    NOTA: Si raccomanda di diluire l'anticorpo secondario in PBST in un rapporto di 1:1000 (per ulteriori informazioni, vedere la Tabella dei materiali ). Tenere la piastra lontana dalla luce durante l'incubazione e lavare da questo passaggio successivo.
  8. Rimuovere la soluzione di anticorpi secondari e lavare con 2 mL di TBST sei volte (1 ora ogni volta). Se è necessaria la colorazione dei nuclei, aggiungere DAPI (1 μg/mL) nel tampone di lavaggio utilizzato per l'ultima fase di lavaggio.
  9. Per questi organoidi incorporati nel gel, tagliare il gel in 4 pezzi e trasferirli con cura in provette da microcentrifuga da 2 ml con una spatola. Per gli organoidi recuperati, rimuovere il tampone di lavaggio.
  10. Utilizzare salviette per assorbire la soluzione rimanente senza toccare il gel o gli organoidi.
  11. Aggiungere 2 mL di reagente idrosolubile per la pulizia dei tessuti (indice di rifrazione = 1,49) in ciascuna provetta. Incubare i campioni con il reagente chiarificante a temperatura ambiente al buio fino a quando gli organoidi non diventano limpidi (di solito durante la notte). Non agitare i campioni.
  12. Trasferire con cura gli organoidi con il reagente chiarificante al centro del piatto con fondo di vetro utilizzando una spatola.
  13. Coprire gli organoidi o il pezzo di gel con un vetrino coprioggetti da 24 mm × 24 mm.
  14. Spingere delicatamente il vetrino coprioggetti verso il basso fino a quando non si appiattisce e inserire i campioni con il fondo di vetro.
  15. Rimuovere il reagente di pulizia ridondante nel piatto e sigillare il vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie.
  16. Per l'imaging 3D, utilizzare un microscopio confocale con un obiettivo da 10×. Utilizza la scansione tile e la scansione Z-stack per ottenere immagini a montaggio intero di organoidi.

Risultati

La Figura 1A presenta lo schema di questo protocollo, compresi i componenti chiave utilizzati in ogni fase. La differenziazione è iniziata con la formazione di EB, seguita dall'induzione del mesoderma e dalla specificazione del lignaggio vascolare (Figura 1B-D). Gli aggregati sono diventati più grandi e meno sferici nel tempo. Gli organoidi hanno iniziato a mostrare spigoli vivi il giorno 5. Dopo essere state incorporate nella miscela di matrice di membrana basale di collagene I, le cellule endoteliali vascolari e i periciti sono germogliati e cresciuti fino a formare reti vascolari complesse già dal 7° giorno (Figura 1E). Poiché lo scopo principale di questo metodo modificato è quello di ridurre al minimo le variazioni tra i diversi lotti di generazione, abbiamo misurato la dimensione EB da due lotti indipendenti e sia le misurazioni dimensionali che l'analisi statistica hanno confermato la coerenza e l'uniformità con questo metodo (Figura 1F).

Per convalidare la differenziazione vascolare, gli organoidi sono stati raccolti il giorno 5 prima dell'inclusione e colorati con marcatori vascolari, tra cui CD31, ERG1 e PDGFRβ. Gli organoidi esprimevano CD31, ERG1 e PDGFRβ (Figura 2), indicando la presenza di cellule endoteliali vascolari e periciti.

Dopo la pulizia dei tessuti, le reti vascolari sono state analizzate con la microscopia a immunofluorescenza a montaggio intero (Figura 3A). Gli organoidi maturi sono stati colorati con CD31, ERG1 e PDGFRβ il giorno 17 (Figura 3B, campione nel blocco di gel) e il giorno 28 (Figura 3C, il campione è stato recuperato dal blocco di gel e dalla coltura singolarmente in una piastra a 96 pozzetti; si noti che la rete vascolare ai bordi ha avvolto gli sferoidi invece di espandersi radialmente dopo essere stati recuperati dal blocco di gel).

figure-results-1
Figura 1: Generazione di organoidi vascolari. (A) Schema delle fasi e cronologia per la generazione di organoidi vascolari. (B-E) Immagini rappresentative in campo chiaro di organoidi vascolari in diversi stadi. Barre di scala: 100 μm. (F) Analisi statistica in dimensioni EB da due diversi lotti di generazione EB utilizzando il metodo dei micropozzetti presentato in questo lavoro. Per la generazione di EB sono state utilizzate 1.000 celle per micropozzetto e per i lotti 1 e 2, rispettivamente n = 42 e n = 40. La significatività è presentata come ns, non significativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Immunocolorazione di organoidi vascolari prima dell'inclusione del gel. Immagini fluorescenti rappresentative di organoidi colorati rispettivamente con i marcatori endoteliali (A) CD31 (verde) e (B) ERG1 (verde) e (C) con il marcatore pericitario, PDGFRβ (verde). I nuclei sono stati controcolorati con DAPI (blu). Barre della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Caratterizzazioni in immunofluorescenza della rete vascolare in organoidi vascolari. (A) Un'immagine rappresentativa mostra organoidi vascolari incorporati in gel nella capsula di vetro dopo la pulizia dei tessuti. Gli organoidi erano trasparenti ma visibili sotto una luce UV a 385 nm. (B) Un'immagine 3D rappresentativa a montaggio intero dell'organoide vascolare il giorno 17. L'organoide vascolare è stato colorato con DAPI (blu), il marcatore delle cellule endoteliali vascolari, CD31 (verde) e il marcatore pericitario, PDGFRβ (magenta). (C) Un imaging 3D rappresentativo a montaggio intero di un organoide vascolare recuperato il giorno 28, colorato con i marcatori endoteliali CD31 (rosso) e ERG1 (verde). Barre di scala: 150 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Mezzo di espansione hiPSC500 ml
Terreno basale mTeSR Plus400 ml
Supplemento mTeSR Plus100 ml
Gentamicina (50 mg/mL)1 ml

Tabella 1: Composizione del mezzo di espansione hiPSC.

substrato di semina hiPSC20 ml
Mezzo di espansione PSC20 ml
Cromato 1 (100 μM)10 μl
Emricasan (1 mM)30 μl
Integratore di poliammine (1000x)20 μl
trans-ISRIB (1 mM)14 μl

Tabella 2: Composizione del terreno di semina hiPSC.

N2B27 medio100 ml
DMEM/F-12, supplemento GlutaMAX48,6 ml
Terreno neurobasale48,6 ml
Integratore GlutaMAX (100x)0,5 ml
Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (NEAA, 100x)0,5 ml
2-Mercaptoetanolo (1000x)0,1 ml
Gentamicina (50 mg/mL)0,1 ml
Integratore N2 (100x)0,5 ml
Integratore di B27 meno vitamina A (50x)1 ml
Eparina, 4 kU/mL0,1 ml

Tabella 3: Composizione del terreno N2B27.

Mezzo di induzione del mesoderma (MIM)3 ml
N2B27 medio3 ml
BMP4 (100 ng/μL)0,9 μl
CHIR99021 (12 mM)3 μl

Tabella 4: Composizione del mezzo di induzione del mesoderma (MIM).

Mezzo di differenziazione vascolare 1 (VDM1)3 ml
N2B27 medio3 ml
Forsklin (12 mM)0,5 μl
VEGFA (100 ng/μL)3 μl

Tabella 5: Composizione del mezzo di differenziazione vascolare 1 (VDM1).

Miscela di collagene I5 ml
Collagene I (3,61 g/mL)2,77 ml
10x DMEM/F12 medio0,5 ml
Bicarbonato di sodio, 7,5%0,5 ml
HEPES, 1 M0,5 ml
H2O0,73 ml
NaOH, 1M75 μl

Tabella 6: Composizione della miscela di collagene I.

Collagene I - miscela di matrici della membrana basale6,5 ml
Collage I miscela5 ml
Matrigel (10 mg/mL)1,5 ml

Tabella 7: Composizione della miscela di matrice di collagene I-membrana basale.

Mezzo di differenziazione vascolare 2 (VDM2)5 ml
DMEM/F-12, supplemento GlutaMAX™3,67 ml
Gentamicina (50 mg/mL)5 μl
MEM Soluzione di Aminoacidi Non Essenziali (NEAA, 100X)50 μl
2-Mercaptoetanolo (1000x)5 μl
Eparina, 4 kU/mL5 μl
Sostituzione del siero knockout0,75 ml
FBS0,5 ml
VEGFA (100 ng/μL)5 μl
FGF2 (100 ng/μL)5 μl

Tabella 8: Composizione del mezzo di differenziazione vascolare 2 (VDM2).

Buffer di blocco50 ml
Siero d'asino2,5 ml
Interpolazione 200,25 ml
Triton X-1000,25 ml
Soluzione di desossicolato di sodio (1%, in peso/v)0,5 ml
PBS46,5 ml

Tabella 9: Composizione del tampone bloccante per l'immunocolorazione.

Discussione

Il protocollo descritto include due modifiche chiave per la generazione omogenea e riproducibile di organoidi vascolari di alta qualità. La prima modifica è l'uso di una piastra a micropozzetti per consentire un migliore controllo dell'uniformità EB. Come punto di partenza della differenziazione vascolare, la dimensione degli EB è fondamentale in quanto regola il destino delle cellule staminali e l'efficacia della differenziazione verso diversi lignaggi. Le variazioni nelle dimensioni dell'EB di solito portano a organoidi eterogenei con struttura e organizzazione incoerenti16,17. Il metodo convenzionale di generazione di EB mediante il sollevamento di colonie di hiPSC11,12 rende difficile il controllo del numero di cellule per i singoli EB e di solito provoca la formazione di EB eterogenea. In questo protocollo, le hiPSC sono dissociate in sospensione a singola cellula e riaggregate in micropozzetti16,18. Regolando il numero di cellule di semina, la dimensione degli EB può essere ottimizzata per garantire una differenziazione mesodermica coerente ed efficace. Per la semina di micropozzetti, vengono utilizzate 500-1.000 cellule, che possono produrre EB relativamente piccoli (con un diametro di 100-200 μm). Questo metodo potrebbe generare in modo riproducibile EB uniformi con le dimensioni desiderate da un lotto all'altro (Figura 1F) e tra varie linee cellulari13. Dal giorno 0, la morfologia dell'EB è cambiata nel tempo durante la differenziazione: la forma diventa meno sferica e la superficie diventa più ruvida (Figura 1), ma il volume non aumenta in modo significativo. La morfologia della vascolarizzazione 3D dipende dalla densità di inclusione e dalle dimensioni degli organoidi incorporati. Gli organoidi troppo grandi (>500 μm) di solito provocano una differenziazione delle cellule vascolari insufficiente, mentre gli organoidi troppo piccoli tendono ad avere una vascolarizzazione sottosviluppata.

La seconda modifica consiste nell'incorporare il cocktail CEPT per migliorare la vitalità di hiPSC durante la formazione di EB. La vitalità cellulare è fondamentale in aggiunta alla qualità delle colonie di hiPSC durante questo processo. Quando le hiPSC sono dissociate in una sospensione a singola cellula, l'inibitore ROCK Y27632 viene solitamente aggiunto per migliorare la vitalità cellulare. Tuttavia, Y27632 si è dimostrato non ottimale per le hiPSC a bassa densità e può causare stress indesiderato di membrana, mentre il cocktail CEPT (composto da chroman 1, emricasan, poliammine e trans-ISRIB) potrebbe ridurre significativamente lo stress cellulare e migliorare la vitalità durante questo processo di formazione di EB con hiPSC a densità inferiore15.

Prima dell'incorporazione degli organoidi nel gel, gli organoidi vengono mantenuti nella piastra a micropozzetti e il cambio del terreno deve essere delicato per evitare possibili interruzioni. Sarebbe meglio utilizzare una pipetta da 200 μl per cambiare il terreno per i primi 5 giorni. Tutti i terreni utilizzati per la generazione di organoidi vascolari devono essere preriscaldati prima dell'uso. Soprattutto dopo l'inclusione del gel, l'uso di terreni freddi potrebbe liquefare parzialmente la matrice della membrana basale e influenzare la nicchia dell'idrogel 3D per la formazione della rete vascolare. Anche l'inclusione, la densità e la distribuzione uniforme degli organoidi sono fattori critici per la formazione della rete vascolare. L'inclusione densa di organoidi potrebbe potenzialmente portare a un'eccessiva fusione delle reti vascolari, mentre una bassa densità di inclusione potrebbe portare a una formazione di rete insufficiente. Seminare 60-80 organoidi per pozzetto e muovere delicatamente la piastra avanti e indietro subito dopo averli aggiunti al primo strato del gel 3D può distribuire meglio questi organoidi.

Questo protocollo può essere ulteriormente modificato per diverse applicazioni. Ad esempio, i segnali della barriera emato-encefalica (BBB) possono essere applicati per frenare ulteriormente le cellule endoteliali vascolari dalla formazione dell'interfaccia BBB 19,20,21,22,23,24,25. Anche la composizione dell'idrogel 3D può essere regolata. Ad esempio, la fibrina e la vitronectina sono comunemente usate per la formazione di reti vascolari in vitro 25,26,27,28,29,30,31,32. La matrice della membrana basale senza collagene I può essere utilizzata per l'inclusione, il che può semplificare il processo di inclusione e fornire diversi stimoli meccanici.

Sebbene gli organoidi vascolari generati da questo protocollo possano essere potenzialmente utilizzati per applicazioni di modellazione della malattia o di screening farmacologico, una limitazione è che questi organoidi ricapitolano solo la maggior parte della vascolarizzazione capillare con pochi vasi più grandi. Per la ricerca incentrata su recipienti più grandi, la generazione di organoidi può richiedere ulteriori stimoli meccanici 24,31,32,33. Il collegamento degli organoidi vascolari con il ricircolo, come il trapianto su animali34 o i dispositivi micro/macrofluidici con pompe di perfusione33, potrebbe potenzialmente risolvere questo problema.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Ringraziamenti

Ringraziamo il supporto tecnico della Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource dell'Herbert Irving Comprehensive Cancer Center della Columbia University, finanziato in parte attraverso il NIH Center Grant (P30CA013696). Questo lavoro è sostenuto da NIH (R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). La Figura 1A è stata creata utilizzando BioRender.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-Mercaptoetanolo (1000x)Gibco21985023
AccutaseSigma-AldrichA6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Frammento Asino Anti-Coniglio IgG (H+L)Jackson Immuno Research Labs711-546-152ricostituire con 0,25 mL 50% di glicerolo,  conservare a -20 ° C per un massimo di 1 anno, rapporto di diluizione per l'uso: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Frammento Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs705-606-147ricostituisce con 0,25 mL di glicerolo al 50%,  conservare a -20 gradi C fino a 1 anno, rapporto di diluizione per l'uso: 1:1000
integratore di B27 meno vitamina A (50x)Gibco12587010scongelare a 4 gradi; C, aliquotare e conservare a -20 gradi C, evitare il ciclo di gelo-disgelo
BMP4ProSpecCYT-081ricostituire con ddH2O sterile a una concentrazione di 100 ng/µ L, aliquotare e conservare a -20 gradi
C Anticorpo CD31 abcamab28364rapporto di diluizione: 1:400
CentrifugaEppendorf022626001
CHIR99021Tocris Bioscience4423/10fare la soluzione madre a 12 mM con DMSO e conservare a -20 ° C per un massimo di 1 anno.
Chroman 1Tocris7163/10rende la soluzione stock a 100 µ M con DMSO e conservare a -20 ° C per un massimo di 1 anno.
Collagene ICorning40236
Microscopio confocaleNikonAXRMP/Ti2
Corning Piastre per elplasia Corning4441
Countess II FL contatore di cellule automatizzatoThermo FisherAMQAF1000
DMEM/F-12, integratore GlutaMAXGibco10565018
DMEM/F-12, polvereGibco12500062preparare 10 soluzioni madre con ddH2O biogrado e sterilizzarla con un 0,2 µ m filtro. Conservare a 4 °C.
Edi042ACedars Sinai
EmricasanMedchemexpress LLCHY1039610MGrealizzare la soluzione stock a 1 mM con DMSO e immagazzinare a -20 ° C per un massimo di 1 anno.
97249dell'anticorpo ERGCell Singali Technology: 1:400
Siero fetale bovino - PremiumAtlanta BiologicalsS11150scongelamento a 4 gradi; C  e aliquota, conservare a -20 ° C per un massimo di cinque anni, o conservare a 4 gradi C per un massimo di un mese
FGF2ProSpecCYT557ricostituire con ddH2O sterile a una concentrazione di 100 ng/µ L, aliquotare e conservare a -20 gradi C
Fluorodish Cell Culture Dish WorldPrecision InstrumentsFD35-100
ForskolinTocris Bioscience1099ricostituire con DMSO a una concentrazione di 12 mM, aliquotare e conservare a -20 ° C
Gentamicina (50 mg/mL)Gibco15710064
GlutaMAX integratore (100x)Gibco35050061
Eparina, 100kU MilliporeSigma375095100KUricostituire con ddH2O sterile a una concentrazione di 4 kU/mL
HEPES (1 M)Gibco15630080
IncubatoreThermo Scientific13998123
Siero Knockout di RicambioGibco10828028scongelare a 4 gradi C, aliquotare e conservare a -20 gradi C, evitare il ciclo di gelo-disgelo
Matrigel, GFR Basement Membrane MatrixCorning356230scongelare a 4 ° C, aliquotare e conservare a -80 gradi C, evitare il ciclo di congelamento-scongelamento
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (NEAA, 100x)Gibco11140050
Grado di biologia molecolareAcqua Corning46000CV
mTeSR plus kitSTEMCELL Technologies1001130scongelare a 4 gradi C, aliquotare e conservare a -20 gradi C, evitare il ciclo di gelo-disgelo
integratore N2 (100x)Gibco17502048scongelare a 4 gradi C, aliquotare e conservare a -20 gradi C, evitare il ciclo di congelamento-disgelo
Soluzione NaOH (1 M)Cytiva  HyCloneSH31088.01
NeuroBasal mediumGibco21103049
NIS-Elements, ver 5.42Nikon
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research Labs17000121ricostituire con 10 mL di ddH2O sterile, conservare a 4 ° C per un massimo di due settimane
paraformaldeide, 20%Microscopia elettronica Sciences15713Sdiluito con PBS
PBST, 20xThermofisher28352
PDGFRβ anticorpoR& RapportoAF385: 1:400
integratore di poliammine (1000x)Sigma-AldrichP8483
Reagente chiarificante Rapiclear, 1,49SUNJIN LABRC149001
Bicarbonato di sodio (7,5%)Gibco25080094
Sodio desossicolato monoidratoThermofisherJ6228822sciogliere con ddH2O per soluzione madre all'1% (wt/v)
TBST, 20xThermofisher28360
trans-ISRIBTocris Bioscience5284/10rendono la soluzione madre a 1 mM con DMSO e conservano a -20 gradi; C per un massimo di 1 anno.
Tritin X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0,4%)Thermo Fisher15250061
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
VEGF-AProSpecCYT-116ricostituire con ddH2O sterile a una concentrazione di 100 ng/µ L, aliquotare e conservare a -20 gradi E
Rapporto di diluizione di diluizione D

Riferimenti

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