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Articolo metodologico

Svelare il trasporto e gli effetti degli xenobiotici nei mitocondri isolati: approfondimenti da saggi respirometrici ed enzimatici

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DOI:

10.3791/67146

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7 marzo 2025

 ,  , 
1Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología (GIBIM), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, 2Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales - Cintrop. Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Parque Tecnológico y de Investigaciones Guatiguará Km 2 El Refugio Piedecuesta

In questo articolo

Sommario

Questo studio introduce una metodologia per lo studio degli effetti degli xenobiotici sulla funzione mitocondriale tramite saggi respirometrici ed enzimatici. Esamina la modulazione della catena di trasporto degli elettroni in varie specie, offrendo approfondimenti per lo sviluppo mirato di biopesticidi contro le malattie trasmesse da insetti vettori.

Abstract

I mitocondri sono spesso indicati come la centrale elettrica della cellula a causa del loro ruolo cruciale nella produzione di energia attraverso la catena di trasporto degli elettroni (ETC). Tuttavia, la loro importanza va ben oltre la produzione di energia. La disregolazione della bioenergetica mitocondriale può innescare cascate intracellulari che influiscono sulla salute e sulla funzione cellulare. Data la loro importanza fisiologica, c'è un crescente interesse nell'esplorare il potenziale farmacologico della funzione mitocondriale per lo sviluppo di nuove terapie e bioprodotti. La modulazione della bioenergetica mitocondriale potrebbe fornire approcci innovativi per affrontare sfide quali i disturbi neurodegenerativi, le malattie metaboliche e il cancro, nonché per sviluppare bioprodotti per il controllo dei parassiti e delle malattie trasmesse da vettori.

Questo lavoro presenta un metodo per valutare gli effetti degli xenobiotici sulla catena di trasporto degli elettroni (ETC) utilizzando vari substrati, tra cui glutammato e NADH per il complesso I, succinato per il complesso II e citocromo c (sia ossidato che ridotto) per i complessi III e IV. Questa metodologia consente di valutare l'attivazione o l'inibizione del trasporto di elettroni attraverso complessi mitocondriali utilizzando un respirometro e uno spettrofotometro. I mitocondri possono provenire da mitocondri isolati, cellule frammentate o tessuti omogeneizzati di varie specie.

In laboratorio, la funzione mitocondriale è stata analizzata nei ratti Aedes aegypti e Wistar, ma questo metodo è applicabile anche ad altre specie, come Rhipicephalus microplus e Rhodnius prolixus. Questo approccio fornisce le basi per teorizzare l'esistenza di proteine disaccoppiatrici e le preferenze specie-specifiche del substrato ossidabile influenzate dalle loro esigenze energetiche uniche. Le recenti scoperte offrono preziose informazioni su strategie innovative di progettazione di bioinsetticidi che mirano alla funzione mitocondriale, con un potenziale significativo per il controllo efficace delle malattie trasmesse da vettori e delle infestazioni da parassiti.

Introduzione

I mitocondri sono sempre stati chiamati la centrale elettrica delle cellule a causa della loro generazione chimica di energia durante il processo di fosforilazione ossidativa 1,2. Oltre alle loro principali funzioni metaboliche fondamentali, i mitocondri sono anche implicati in molti altri processi cellulari, che vanno dai livelli di regolazione intracellulare del Ca2+, ai processi infiammatori e alla produzione di specie reattive dell'ossigeno ai processi di induzione della morte cellulare3. La bioenergetica mitocondriale e la loro disregolazione sono state associate a processi intracellulari che influenzano la funzione cellulare e la salute generale. Ciò ha suscitato un crescente interesse nella ricerca del potenziale farmaceutico del targeting della funzione mitocondriale per sviluppare terapie innovative e bioprodotti sicuri 4,5,6. Inoltre, comprendere l'intricata interazione dei processi mitocondriali e il loro impatto sulla funzione cellulare è fondamentale per lo sviluppo di terapie mirate e per la presentazione di opportunità per la progettazione di bioprodotti per il controllo delle malattie trasmesse da vettori e delle infestazioni da parassiti 7,8.

Il targeting di componenti specifici della catena di trasporto degli elettroni con xenobiotici è emerso come strategia per modulare la funzione mitocondriale per la generazione di biopesticidi. È stato dimostrato che i composti naturali e sintetici inclusi nelle formulazioni di pesticidi, come i pesticidi mirati ai mitocondri a base di nanoparticelle, influenzano la funzione mitocondriale diminuendo il potenziale mitocondriale e la sintesi di ATP in S. frugiperda9.

Inoltre, la maggior parte dei carbammati e dei prodotti a base di piretroidi sono stati segnalati come inibitori del complesso I nelle zanzare; tuttavia, la loro esposizione prolungata ha creato alcune popolazioni resistenti ai piretroidi in Anopheles gambiae, spesso correlate a livelli elevati di P450 che possono metabolizzare questi substrati10,11. Allo stesso modo, le piante e i loro oli essenziali, estratti e metaboliti secondari sono stati documentati come potenziali insetticidi con un'ampia gamma di mortalità in diversi stadi di insetti12,13. L'attività insetticida di questi composti naturali può essere correlata all'inibizione del trasporto di elettroni in un punto specifico della catena respiratoria mitocondriale modulando la produzione di specie reattive dell'ossigeno, il potenziale mitocondriale ΔΨm e la sintesi di ATP che possono innescare processi di morte cellulare 6,8.

I composti naturali, come fonti per la formulazione di pesticidi, e i loro effetti sui mitocondri svolgono un ruolo cruciale nella progettazione di biopesticidi nuovi e sicuri. In questo contesto, questo manoscritto descrive una metodologia per identificare la capacità degli xenobiotici di attivare o inibire il trasporto di elettroni attraverso complessi mitocondriali. Questo approccio completo consente di misurare con precisione gli effetti degli xenobiotici sulla funzione mitocondriale utilizzando una varietà di substrati, impiegando metodi sia di respirometria che di spettrofotometria. Questa metodologia è stata applicata per analizzare la funzione mitocondriale di specie vettori chiave, tra cui Aedes aegypti, portando a teorizzare la presenza di proteine disaccoppiatrici e distinte preferenze di substrato ossidabile specifiche per ciascuna specie.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato Etico "Comité de ética en investigación científica CEINCI": Comitato Etico per la Ricerca Scientifica dell'Università Industriale di Santander. Inoltre, questi test erano conformi alle linee guida Arrive e seguivano la legge colombiana 84 del 1989 (capitolo IV, art. 23-26) e la risoluzione 8430 (1993, titolo IV, art. 83-93) che regola la ricerca sugli animali in Colombia.

NOTA: Si consiglia vivamente di leggere il capitolo sulla fosforilazione ossidativa di qualsiasi libro di biochimica prima di iniziare questo protocollo.

1. Reagenti e soluzioni

  1. Per isolare i mitocondri epatici di ratto, preparare 250 mL di tampone di isolamento dei mitocondri: 250 mM di D-mannitolo, 10 mM di HEPES pH 7,2 e 1 mM di EGTA. Prelevare 50 mL di tampone di isolamento (questo sarà chiamato tampone di isolamento senza BSA) e quindi aggiungere 0,2 g di BSA agli altri 200 mL (questo sarà chiamato tampone di isolamento con BSA).
  2. Per omogeneizzare le larve di Aedes aegypti , preparare 100 mL di tampone: 250 mM di saccarosio, 10 mM di HEPES, 1 mM di EGTA pH 7,2.
  3. Preparare il tampone di reazione: soluzione tampone fosfato di sodio 80 mM, pH 7,4, EDTA 50 μM.
  4. Preparare una scorta di reagenti utilizzati per le attività enzimatiche a pH 7,2 come descritto di seguito: 25 mM di NADH (appena preparato per ogni saggio), 2 M di succinato di sodio, 4 mM di citocromo c (appena preparato per ogni saggio), 200 μM di rotenone, 0,5 mM di KCN, 6 mM di 2,6-diclorofenolindofenolo (DCPIP), 100 mM di fenazina metosolfato (PMS) e 60 mM di ferricianuro di potassio.
    NOTA: Per tutti gli esperimenti e la preparazione dei reagenti è stata utilizzata acqua ultrapura con una resistività di 18,2 MΩ·cm a 25 °C. Quest'acqua è stata generata utilizzando un sistema di purificazione Milli-Q, che garantisce la rimozione di contaminanti organici, inorganici e microbici a livelli inferiori ai limiti rilevabili, rendendola adatta per applicazioni biochimiche e di biologia molecolare ad alta sensibilità.

2. Dissezione epatica, omogeneizzazione e isolamento dei mitocondri dal fegato di ratto

  1. Prima di iniziare, posizionare tutti i materiali e i tamponi sul ghiaccio, assicurandosi che tutti i materiali siano ghiacciati durante l'intero test per evitare danni mitocondriali.
  2. Mettere 10 mL di tampone di isolamento dei mitocondri in una provetta conica ghiacciata.
  3. Sopprimere il ratto Wistar maschio mediante decapitazione cervicale, evitando l'uso di CO2 che può interferire con i test respiratori. Per questo, il Comitato per l'Etica nella Ricerca Scientifica dell'Università Industriale di Santander (CEINCI) ha approvato i metodi sulla risoluzione 13 del 2022.
    NOTA: I ratti non devono pesare più di 170 g; Anche il grasso può influenzare le analisi respiratorie.
  4. Praticare un'incisione (circa 4-5 cm) con un bisturi sterile attraverso la sezione addominale del ratto.
  5. Sezionare completamente il fegato una volta che la zona addominale è visibile. Il fegato di ratto è un organo multilobato, rosso scuro di circa 10 cm x 5 cm.
  6. Metti con cura il fegato all'interno del tampone isolante ghiacciato e risciacqua due volte con questo mezzo.
  7. Tritare finemente il fegato (dimensione inferiore a 1 cm) con forbici affilate in una capsula di Petri con 10 ml di terreno isolante.
  8. Mettere la soluzione nel tubo dell'omogeneizzatore tissutale Potter Elvehjem e omogeneizzare accuratamente almeno dieci volte, a bassa velocità (~390 giri/min).
  9. Trasferire la soluzione in una provetta conica e centrifugare a 600 x g per 10 min a 4 °C.
  10. Dopo la centrifugazione, versare con cura il surnatante in una nuova provetta conica. Scartare il pellet con parte del tessuto, del sangue e dei componenti cellulari intatti.
  11. Riempire la provetta con altro tampone isolante (~35 mL) e centrifugare a 6000 x g per 10 minuti a 4 °C.
  12. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere con cura il pellet (mitocondri) in un nuovo tampone di isolamento senza BSA.
    NOTA: Per la risospensione mitocondriale, si consiglia di utilizzare una spazzola morbida.
  13. Quindi, centrifugare a 7000 x g per 10 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere i mitocondri isolati in 2 mL di tampone di isolamento senza BSA.
  14. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il metodo Bradford o simile14.

3. Colonia di Aedes aegypti e omogeneizzazione delle larve.

NOTA: Per questa procedura la colonia di Ae. aegypti è stata tenuta all'interno di gabbie da riproduzione (40 cm × 40 cm × 40 cm) in condizioni di umidità (70% ± 5%), fotoperiodo (12:12) e temperatura (27 ± 5 °C). Le uova sono state raccolte su carta da filtro.

  1. Assicurarsi che le uova vengano covate in vassoi con acqua filtrata e declorata una settimana prima dell'esperimento. Identificare lo stadio in base al processo di muta nel ciclo delle larve. Osservare ogni processo di muta per verificarne lo stato L1, L2 e L3. Quando la larva entra in L3, attendere un massimo di 12 ore per raccogliere il materiale.
  2. Raccogliere almeno 100 larve di Ae. aegypti allo stadio L3-L4 in acqua priva di cloro (~30 ml di acqua). Prendi le larve con una pipetta Pasteur.
  3. Filtrare le larve con carta da filtro, sciacquare le larve raccolte e risospenderle nel tampone di omogeneizzazione Aedes aegypti (~2 mL).
  4. Trasferire la soluzione con le larve nella provetta dell'omogeneizzatore tissutale Potter Elvehjem e omogeneizzare accuratamente almeno dieci volte a ~390 giri/min.
  5. Trasferire il tessuto omogeneizzato e filtrarlo attraverso una siringa di lana di vetro per rimuovere i residui di esoscheletro di grandi dimensioni.
  6. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il metodo Bradford o simile15.
    NOTA: Non è necessario isolare i mitocondri dalle larve di zanzara; È possibile valutare l'effetto degli xenobiotici utilizzando l'estratto proteico ottenuto in questa fase.

4. Determinazione degli effetti degli xenobiotici sulla catena di trasporto degli elettroni mitocondriali

NOTA: Questo protocollo è stato progettato per valutare l'effetto degli xenobiotici sulla bioenergetica mitocondriale su mitocondri isolati da fegato di ratto e tessuto di insetti omogeneizzati.

I saggi si dividono in due: polarografici (NADH e Succinato ossidasi) e spettrofotometrici (NADH deidrogenasi - complesso I, succinato deidrogenasi - complesso II, citocromo c reduttasi - complesso III e citocromo c ossidasi - complesso IV).

  1. Saggi polarografici: a tal fine, utilizzare la respirometria ad alta risoluzione per misurare l'ossidazione completa di NADH e succinato mediante il consumo di O2 e riportare i risultati come NADH e succinato ossidasi.
    1. Calibrare lo strumento ogni giorno prima di iniziare i saggi. Questo passaggio può variare a seconda dell'ossigrafo utilizzato. Seguire le istruzioni del produttore.
      1. Per la calibrazione di Oroboro, aggiungere il terreno di reazione nelle camere con un eccesso di almeno 0,2 mL al di sopra del volume della camera sperimentale (2 mL), per riempire la camera e il capillare di iniezione con il terreno.
    2. Accendere gli agitatori dopo l'aggiunta media.
    3. Attendere che il segnale della concentrazione di ossigeno si stabilizzi e registrarlo.
    4. Per la calibrazione dell'ossigeno zero, aggiungere mitocondri, sospensioni cellulari, lievito di birra o ditionite (si consiglia il lievito di birra) che consentono l'esaurimento dell'ossigeno e registrarlo. Attendere che il segnale raggiunga i livelli di fondo (tipicamente ± 2 pmol/mL/s per il sistema O2k).
    5. Eseguire le attività di NADH e succinato ossidasi monitorando il consumo di ossigeno quando si aggiunge alla camera un tampone di reazione, 0,1 mg di proteine (mitocondriali o larve omogeneizzate) e il substrato (0,17 mM di NADH o 10 mM di sodio succinato).
    6. Utilizzare inibitori delle proteine di trasporto degli elettroni per confermare che il consumo di ossigeno osservato è dovuto alla catena respiratoria mitocondriale. Quelli comuni sono rotenone 1 μM e KCN 1mM16. Nella cella dell'ossigrafo, aggiungere i reagenti secondo la Tabella 1 (la sequenza è importante).
  2. Saggi spettrofotometrici
    NOTA: Per valutare il trasporto di elettroni attraverso i complessi mitocondriali, sono stati condotti saggi enzimatici e misurati utilizzando uno spettrofotometro e accettori di elettroni artificiali come PMS, DCPIP e citocromo c. Si consiglia di misurare un enzima al giorno. Preparare tamponi e reagenti almeno un giorno prima dei test. Alcuni composti sono fotosensibili; vedere Tabella 2 per ulteriori consigli.
    1. Per l'attività della NADH deidrogenasi, i sistemi di reazione contengono 50 mM di soluzione tampone fosfato pH 7,4, 2 mM EDTA, 0,1 mg/mL di proteina mitocondriale, 1 μM di rotenone e 1 mM di KCN. Nella cella dello spettrofotometro, aggiungere i reagenti secondo la Tabella 2 (la sequenza è importante)17. I passaggi consigliati sono i seguenti:
      1. Preparare 100 mL di fosfato tampone miscelato con l'EDTA e ricontrollare che il pH non cambi. Conservare il tampone in frigorifero, ma è obbligatorio mantenerlo a temperatura ambiente (RT; circa 25 °C) durante i saggi.
      2. Preparare soluzioni madre fresche di rotenone, KCN, NADH e ferricianuro di potassio (stabili fino a 4 ore). Il volume suggerito è di 1 mL di soluzioni concentrate (vedere la prima colonna della tabella).
      3. Se il composto testato ha una bassa solubilità in acqua, includere un ulteriore controllo dell'attività enzimatica nel disegno sperimentale utilizzando solo il solvente del composto.
      4. In primo luogo, monitorare l'attività della NADH deidrogenasi mediante la riduzione del ferricianuro di potassio a 420 nm. Calcola la sua concentrazione in base al suo coefficiente di estinzione molare di 1,04 mM-1·cm-1. Lo spettrofotometro ha un'opzione per calcolare l'attività massima in una reazione; Controllare il manuale utente. Successivamente, dividere l'attività riportata per la concentrazione di proteina utilizzata per ottenere l'attività specifica dell'enzima.
    2. Valutare l'attività della succinato deidrogenasi aggiungendo 20 mM di succinato di sodio e 1 mM di fenazina metosolfato (PMS) con 60 μM di 2,6-diclorofenolindofenolo (DCPIP) come accettori di elettroni artificiali. Nella cella dello spettrofotometro, aggiungere i reagenti secondo la Tabella 3 (la sequenza è importante)17. Le raccomandazioni sono le seguenti:
      1. Preparare lo stesso tampone utilizzato per la NADH deidrogenasi. Mantienilo nelle stesse condizioni.
      2. Preparare soluzioni stock fresche di succinato, PMS e DCPIP. Il volume suggerito è di 1 mL di soluzioni concentrate. Preparare le soluzioni PMS e DCPIP lo stesso giorno del test.
      3. Se il composto testato ha una bassa solubilità in acqua, includere un ulteriore controllo dell'attività enzimatica nel disegno sperimentale.
      4. Monitorare l'ossidazione del succinato mediante la riduzione di DCPIP a 600 nm. Calcola la sua concentrazione in base al suo coefficiente di estinzione molare di 21,0 mM−1·cm−1, applicando la legge di Beer. Successivamente, dividere l'attività riportata per la concentrazione di proteina utilizzata per ottenere l'attività specifica dell'enzima.
    3. Misurare l'attività della citocromo c reduttasi (complesso III) utilizzando NADH o succinato come substrati ossidabili. Con questo enzima, il trasporto di elettroni dal complesso I (usando NADH) o dal complesso II (usando il succinato) passa all'ubichinone e poi al complesso III, che passa gli elettroni al citocromo c. Questa reazione è seguita dalla riduzione del citocromo c. Preparare il sistema di reazione contenente 50 mM di soluzione tampone fosfato pH 7,4, 2 mM EDTA, 0,1 mg di proteina mitocondriale, 50 μM di NADH e 0,1 mM di KCN. Nella cella dello spettrofotometro, aggiungere i reagenti secondo la Tabella 4 (la sequenza è importante)18. Le raccomandazioni sono le seguenti:
      1. Preparare lo stesso tampone utilizzato per la NADH deidrogenasi. Mantienilo nelle stesse condizioni.
      2. Utilizzare gli stessi NADH e KCN della NADH deidrogenasi.
      3. Se il composto testato ha una bassa solubilità in acqua, includere un ulteriore controllo dell'attività enzimatica nel disegno sperimentale.
      4. Monitorare la riduzione del citocromo c a 550 nm e calcolare la sua concentrazione in base al coefficiente di estinzione molare di 19,8 mM−1,cm−1, applicando la legge di Beer. Successivamente, dividere l'attività riportata per la concentrazione di proteina utilizzata per ottenere l'attività specifica dell'enzima.
    4. Misurare la citocromo c ossidasi (complesso IV) espressa come attività della citocromo c ossidasi. Per questo, preparare una reazione di sistema contenente 50 mM di soluzione tampone fosfato, pH 7,4, 2 mM EDTA e 0,1 mg di proteina mitocondriale (Tabella 5). Per questi saggi enzimatici, ridurre il citocromo c mescolando quantità equimolari di citocromo c e ditionito di sodio, garantendo una riduzione completa del citocromo c.
    5. Quindi, passare la miscela risultante attraverso una colonna di gel di destrano reticolato utilizzando la stessa soluzione tamponata con fosfato della fase mobile. Successivamente, quantificare le frazioni raccolte utilizzando uno spettrofotometro a 550 nm19. Le raccomandazioni sono le seguenti:
      1. Utilizzare lo stesso tampone utilizzato per la NADH deidrogenasi. Mantienilo nelle stesse condizioni.
      2. Se il composto testato ha una bassa solubilità in acqua, nel disegno sperimentale deve essere incluso un ulteriore controllo dell'attività enzimatica.
      3. Monitorare l'ossidazione del citocromo c a 550 nm e calcolare la sua concentrazione in base al suo coefficiente di estinzione molare di 19,8 mM−1·cm−1, applicando la legge di Beer. Successivamente, dividere l'attività riportata per la concentrazione di proteina utilizzata per ottenere l'attività specifica dell'enzima.
        NOTA: Un foglio di calcolo che mostra il processo di calcolo dell'attività specifica degli enzimi, misurata dal consumo di ossigeno e dalla spettrofotometria, è incluso come file supplementare 1.

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Risultati

Prima di analizzare i risultati ottenuti con questo protocollo, è fondamentale ricordare un po' la biochimica della catena di trasporto degli elettroni nei mitocondri. In primo luogo, il NADH fornisce una coppia di elettroni ai centri di ossidoriduzione situati nel complesso I. Lì inizia il trasporto di elettroni che passano dal complesso I all'ubichinone, successivamente al complesso III, che li dona al citocromo c, e infine al complesso IV, dove l'ossigeno è l'accettore finale di elettroni, riducendolo ad acqua. D'altr...

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Discussione

Un metodo spettrofotometrico e polarografico con O2 ad alta risoluzione è stato impiegato per studiare gli effetti degli xenobiotici sulla funzione mitocondriale. Lo studio ha valutato in particolare l'impatto dell'olio essenziale di Cymbopogon flexuosus e del carvacrolo sull'ossidazione del NADH e del succinato, nonché il trasporto di elettroni attraverso la catena di trasporto degli elettroni mitocondriali, utilizzando due diversi modelli biologici: mitocondri isola...

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Dichiarazioni

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano la "Vicerrectoría de Investigación y Extensión VIE" dell'Universidad Industrial de Santander per aver finanziato la sovvenzione numero 3739 corrispondente al progetto "Formulazione di un ixodicide e ixorepellente progettato in laboratorio e convalidato sul campo per prevenire l'infestazione da zecche nei bovini".

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2,6-diclorofenolindondoloMerck119814Preparare il giorno stesso dell'uso.
Reagente BradfordMerckB6916
BSAMerckA7030
Carvacrol,MerckW224511
Citocromo cMerckC2506Converter fotosensibile coprirlo con un foglio di alluminio. In soluzione va conservato in freezer.
D-mannitoloMerckM4125
EGTAMerck>E3889
Acido etilendiamminotetraacetico sale tetrasodico diidratoMerckE6511
HEPESMerckH3375
KCNMerck60178In soluzione funziona bene per 2 settimane.
KH2PO4MerckP5655
Multiskan FC Fotometro per micropiastreThermo Scientific 
Na2HPO4Merck567550
Oroboros O2k Oroboros Instruments10203-03https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/
Fenazina metosolfato MerckP9625Preparare lo stesso giorno di utilizzo.
Ferrianuro di potassio Merck244023Preparare lo stesso giorno di utilizzo.
Potter Elvehjem provetta
RotenoneMerck557368solubile in etanolo. Contorno fotosensibile coprirlo con un foglio di alluminio. In soluzione va conservato in freezer.
Succinato di sodioMerckS9637In soluzione va conservato in freezer.
SaccarosioMerckS0389
β-Nicotinamide adenina dinucleotide, sale disodico ridotto idratoMerckN8129Convoglio fotosensibile coprirlo con un foglio di alluminio. In soluzione va conservato in freezer.
51119100omogeneizzatore tissutale

Riferimenti

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