Articolo metodologico

Isolamento di condrociti e condroprogenitori mediante adesione della fibronectina e saggio migratorio

DOI:

10.3791/67160

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4 ottobre 2024

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1Department of Physiology, Christian Medical College, 2Centre for Stem Cell Research (A unit of InStem, Bengaluru), Christian Medical College, 3Department of Orthopedics, Christian Medical College, 4Faculty of Health and Medical Sciences, The University of Adelaide, 5Department of Orthopedics and Trauma, Royal Adelaide Hospital

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento dei condrociti, dei condroprogenitori derivati dal dosaggio di adesione della fibronectina (FAA-CP) e dei condroprogenitori migratori (MCP) dalla cartilagine articolare umana. Copre la digestione enzimatica, l'adesione della fibronectina e i saggi basati sulla migrazione per isolare e caratterizzare queste cellule.

Abstract

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Le cellule condroprogenitrici (CPC), recentemente identificate come una sottopopolazione distinta, mostrano risultati promettenti grazie alle loro proprietà mesenchimali, all'aumento della condrogenesi e ai limitati tratti ipertrofici. L'arricchimento dei progenitori si ottiene attraverso l'adesione differenziale della fibronectina e i saggi di espiantazione basati sulla migrazione, con i condroprogenitori derivati dal saggio di adesione della fibronectina (FAA-CP) e i condroprogenitori migratori (MCP) che dimostrano un potenziale superiore rispetto ai condrociti. Questo articolo approfondisce i dettagli dell'isolamento delle cellule derivate dalla cartilagine residenti, vale a dire condrociti e condroprogenitori. Mentre le preziose intuizioni della ricerca sui condrociti contribuiscono alla nostra comprensione della riparazione della cartilagine, gli sforzi in corso sono diretti verso l'uso dei condroprogenitori e l'esplorazione del loro potenziale come approccio terapeutico alternativo. Inoltre, questo articolo sulla metodologia fornisce un protocollo dettagliato passo dopo passo per isolare tre tipi di cellule specifiche dalla cartilagine: condrociti, FAA-CP e MCP. Seguendo procedure standardizzate, questo protocollo facilita l'estrazione di successo di questi sottotipi di cellule. Basato su un'ampia ricerca, l'articolo si concentra sulle intricate tecniche utilizzate per isolare i diversi sottoinsiemi e sulle condizioni di coltura ottimizzate necessarie per espandere e mantenere le loro colture. La metodologia comprende l'isolamento enzimatico di condrociti umani derivati dalla cartilagine articolare, l'adesione differenziale della fibronectina dopo digestione enzimatica sequenziale e saggi di espianti basati sulla migrazione per ottenere cellule residenti nella cartilagine.

Introduzione

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L'emergere della terapia rigenerativa cellulare rappresenta un approccio significativo al trattamento dei disturbi legati alla cartilagine, come l'osteoartrite (OA)e i difetti condrali. Questi disturbi, caratterizzati dalla rottura o dalla lesione della cartilagine all'interno delle articolazioni, presentano sfide sostanziali durante il trattamento. L'autoriparazione della cartilagine articolare è limitata a causa della sua architettura aneurale, dell'avascolarità e della bassa attività mitotica2.

Le cellule più utilizzate per la rigenerazione del tessuto cartilagineo sono le cellule staminali mesenchimali (MSC) e i condrociti3. Tuttavia, diversi studi hanno riportato limitazioni nell'uso di queste cellule per la rigenerazione4. Queste limitazioni includono la differenziazione terminale dei condrociti durante l'espansione estesa in vitro per ottenere la conta cellulare richiesta e la tendenza ipertrofica delle MSC. Questi fattori possono portare alla formazione di tessuto di riparazione con una combinazione non ottimale di fibrocartilagine e ialina 5,6,7,8.

La scoperta delle cellule condroprogenitrici (CPC) è nata dalla ricerca di cellule alternative nella cartilagine articolare9. Hanno suscitato un immenso interesse a causa della loro somiglianza con le MSC e del loro potenziale condrogenico superiore, il tutto mentre esibivano una ridotta ipertrofia, una combinazione indispensabile ricercata10,11. A differenza dei condrociti, è stato riportato che queste popolazioni progenitrici mostrano un'aumentata attività replicativa e telomerasi, nonché un'aumentata espressione della proteina 1 dell'omologo del locus notch neurogenico (NOTCH-1) e del fattore di trascrizione SRY-box 9 (SOX-9)12,13,14,15. Esistono due metodi standard per isolare le CPC riportate sia dalla cartilagine che dal menisco, tra cui uno basato sulla loro espressione del recettore delle integrine (CD49e/CD29), isolato attraverso un saggio di adesione della fibronectina - Fibronectin Adhesion Assay-derived Chondroprogenitors (FAA-CPs), e l'altro basato sul loro accresciuto potenziale migratorio da espianti di cartilagine - Migratory Chondroprogenitors (MCPs)11,13,16,17,18,19. Numerosi studi in vitro dimostrano la superiorità condrogenica e la ridotta ipertrofia sia di FAA-CPCs che di MCPs rispetto ai condrociti e alle MSC del midollo osseo (BM)-20,21,22,23.

Recenti indagini in vitro che hanno confrontato FAA-CPC con MCP hanno dimostrato l'aumentata capacità di rigenerazione della cartilagine di quest'ultima popolazione progenitrice in condizioni normali di ossigeno24. Questi risultati ottimistici in vitro mostrano una rigenerazione di tipo ialino, incoraggiando ulteriori esperimenti in vivo. Tuttavia, è stato riportato che entrambe le popolazioni di CPC riparano e rigenerano efficacemente la cartilagine nell'OA e in altri disturbi osteocondrali in modelli animali 25,26,27,28,29.

Il nostro laboratorio ha contribuito attivamente alla standardizzazione delle tecniche di isolamento delle CPC e al confronto delle loro caratteristiche fenotipiche con i condrociti e le MSC. Questo articolo fornirà un protocollo dettagliato che spiega i passaggi necessari per isolare e coltivare le cellule residenti della cartilagine, vale a dire condrociti, FAA-CPC e MCP.

Protocollo

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Il protocollo è stato approvato ed è conforme alle norme e alle linee guida in materia dell'Institutional Review Board (Comitato per la Ricerca e l'Etica). Dopo aver ottenuto il consenso informato scritto, le articolazioni tibio-femorali umane vengono prelevate da pazienti affetti da osteoartrite (OA) (punteggio radiologico Kellgren-Lawrence 4)30 che richiedono la sostituzione totale del ginocchio come parte del loro trattamento. Le articolazioni dei pazienti con segni di tumori, infezioni o artrite infiammatoria (come l'artrite reumatoide o la gotta) sono state escluse dallo studio. Si garantisce che tutte le procedure siano condotte in condizioni sterili, aderendo ai protocolli di laboratorio standard durante tutto il processo sperimentale.

1. Ottenere articolazioni tibio-femorali

  1. Ottenere articolazioni del ginocchio (articolazioni tibiofemorali) da donatori umani che richiedono l'amputazione sopra il ginocchio come parte del trattamento o da quelli con osteoartrite di gradoIV 30 (evidenza radiologica che mostra una marcata riduzione dello spazio articolare con sclerosi condrale) sottoposti a sostituzione totale del ginocchio.
    NOTA: Assicurarsi che il consenso informato sia ottenuto dai pazienti seguendo i principi della Dichiarazione di Helsinki. Garantire il rispetto delle regole del Comitato Etico e dell'Institutional Review Board.
  2. Escludere le articolazioni che mostrano sintomi di infezione o infiammazione.

2. Lavorazione delle articolazioni raccolte

  1. Posizionare le articolazioni tibiofemorali prelevate in 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in condizioni sterili.
  2. Preparare un'area sterile sotto il cofano posizionando un sottopiede sterile. Trasferire le canne raccolte sul sottopad.
  3. Stabilizzare le articolazioni tibiofemorali sezionate tenendo l'osso subcondrale con la cartilagine rivolta verso l'alto.
  4. Utilizzando una lama di bisturi (n. 22), prelevare trucioli di cartilagine di forma rettangolare dalle aree non portanti per i pazienti con OA entro 1-2 ore dall'ottenimento dell'articolazione.
  5. Raccogliere le sezioni di cartilagine di 8 mm x 10 mm dallo strato superficiale allo strato più profondo.
  6. Lavare le fette di cartilagine con 1 soluzione di PBS e metterle in una capsula di Petri contenente 1-2 ml di terreno DMEM semplice.
  7. Tritare bene le fette di cartilagine fino a una dimensione inferiore a 1 mm x 1 mm x 1 mm con una lama di bisturi (n. 22).
    NOTA: Assicurarsi che le fette di cartilagine o la cartilagine tritata non si secchino; metterli in un terreno di coltura o PBS privo di siero.

3. Isolamento dei condrociti

  1. Porre la cartilagine tritata in un pallone verticale T-25 contenente 10 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM-F12) con lo 0,15% di collagenasi di tipo II per la digestione enzimatica. Lasciare il matraccio indisturbato per 12-14 ore in un incubatore a CO2 , garantendo le condizioni di coltura standard31.
    NOTA: Deve essere utilizzato un terreno DMEM-F12 semplice senza tracce di siero, poiché il siero inattiva l'azione enzimatica.
  2. Dopo la digestione notturna, trasferire il terreno contenente le cellule rilasciate in una provetta da centrifuga fresca e sterile contenente un volume uguale di DMEM-F12 + 10% di siero fetale bovino (FBS), utilizzando un colino cellulare per separare le cellule dai detriti. Le cellule rilasciate sono i "condrociti".
  3. Centrifugare le celle filtrate alla velocità di 1200 x g per 5 minuti a 37 °C.
  4. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet. Ricostituire il pellet ottenuto in 1 mL di terreno e contare le cellule vitali rilasciate utilizzando un saggio di esclusione del blu di tripano.
  5. Caricare i condrociti in un pallone T-25 a una concentrazione di 10.000 cellule/cm² ed espanderli fino al numero di passaggio richiesto utilizzando DMEM-F12 contenente il 10% di FBS. Ulteriori componenti del terreno includono acido ascorbico (62 μg/mL), L-glutammina (2,5 mM/L), penicillina-streptomicina (100 UI/mL) e amfotericina-B (2 μg/mL).
  6. Rinfrescare il terreno ogni 3 giorni e raccogliere le cellule alla sub-confluenza utilizzando lo 0,125% di tripsina contenente acido etilendiammine tetraacetico (EDTA).

4. Isolamento di condroprogenitori derivati dal saggio di adesione della fibronectina (FAA-CP)

  1. 12 ore prima del rilascio dei condrociti, preparare 10 mL di 1x PBS contenente 1 mM di MgCl2 (10 μL) e 1 mM di CaCl2 (10 μL) e 100 μL di Fibronectina (10 μL/mL)32.
  2. Rivestire il numero richiesto di pozzetti di una piastra a 6 pozzetti (1,5 mL/9,3 cm2) utilizzando la soluzione preparata.
  3. Sigillare bene la piastra e conservare in frigorifero per una notte a 4 °C.
  4. Inoltre, ottenere trucioli di cartilagine in modo simile a quello spiegato per l'isolamento dei condrociti (passaggi 2.1-2.5).
  5. Sottoporre i trucioli di cartilagine a digestione enzimatica sequenziale notturna (pronasi 0,2% per 3 ore; seguita da collagenasi 0,04% tipo II per 12 ore) in un bagno d'acqua agitante mantenuto a 37 °C per ottenere singoli condrociti.
  6. Il giorno seguente, rimuovere la piastra a 6 pozzetti rivestita di fibronectina dal frigorifero e rimuovere la fibronectina in eccesso.
    NOTA: L'eccesso di fibronectina deve essere rimosso lentamente e delicatamente senza disturbare il rivestimento sul fondo del pozzetto. La presenza di MgCl2 (10 μL) e 1 mM di CaCl2 è fondamentale per garantire l'adesione delle cellule.
  7. Aggiungere 2-3 mL di terreno DMEM-F12 semplice nei pozzetti rivestiti.
  8. Seminare i condrociti rilasciati sui pozzetti rivestiti ad una densità di carico di 4000 cellule/pozzetto e lasciare la piastra indisturbata per un periodo di 20 minuti.
  9. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno in eccesso e le cellule non aderenti. Aggiungere 2-3 mL di terreno di coltura standard come quello utilizzato per i condrociti (DMEM-F12 + 10% FBS).
  10. Mantenere le cellule aderenti in condizioni di coltura standard per 10-12 giorni per ottenere cloni CPC (colonie di >32 cellule).
  11. Isolare utilizzando tripsina-EDTA allo 0,125% per 180 s, ri-placcare i cloni con un rapporto di 1 clone/5 cm² ed espandere i CP policlonali arricchiti fino alla confluenza richiesta. Queste cellule ottenute sono denominate "FAA-CPC".
  12. Coltura ulteriore delle cellule in terreno DMEM-F12 + 10% FBS + fattore di crescita trasformante beta 2 (TGFβ2: 1 ng/mL) + fattore di crescita dei fibroblasti (FGF2: 5 ng/mL).
    NOTA: L'incubazione delle cellule su piastre rivestite di fibronectina non deve superare i 20 minuti, poiché anche i condrociti possono iniziare ad aderire. Durante il periodo di adesione di 20 minuti, il terreno deve essere privo di siero. Successivamente, le cellule che aderiscono per formare i cloni devono essere coltivate in un terreno contenente anche FBS. I cloni devono essere isolati solo dopo essersi assicurati che ogni clone abbia più di 32 cellule; Questo per evitare amplificatori di transito. Un'ulteriore espansione dei cloni dopo la tripsinizzazione dovrebbe includere i fattori di crescita aggiuntivi menzionati. Una densità di carico di 4000 condrociti/9,3cm2 di una piastra rivestita di fibronectina, dopo un'incubazione di 20 minuti seguita da un lavaggio, determina l'adesione di 80-100 cellule in totale. Di questi, circa 20 cloni progrediranno per crescere e raggiungere un raddoppio della popolazione di 5 entro 10-12 giorni.

5. Isolamento dei condroprogenitori migratori

  1. Rasare gli espianti di cartilagine (10 mm x 5 mm x 1 mm) dall'articolazione prelevata e posizionarli in una piastra sterile a 6 pozzetti contenente terreno DMEM-F12 con il 10% di FBS e 10 mM di Glutamax (2-3 espianti/pozzetto)33.
  2. Lasciare la piastra con gli espianti indisturbata per 48 ore in un'incubatrice a CO2 mantenuta a 37 °C.
  3. Dopo 2 giorni, trasferire gli espianti in una provetta da centrifuga contenente 10 mL di soluzione di collagenasi allo 0,1% per la digestione enzimatica. Incubare la provetta a 37 °C per 2 ore.
    NOTA: Gli espianti devono essere risciacquati con 1x PBS prima della digestione enzimatica, poiché tracce di siero possono inattivare l'azione enzimatica. Per il lavaggio, immergere gli espianti in una capsula di Petri riempita con 2-3 mL di 1x PBS; Questo anche per garantire la non contaminazione con i condrociti rilasciati. La manipolazione degli espianti deve essere ridotta al minimo, e questo per evitare di stressare i progenitori che hanno iniziato a migrare.
  4. Dopo la digestione, sciacquare gli espianti con 1x PBS e rimetterli negli stessi pozzetti della piastra contenente terreno DMEM-F12 fresco con il 10% di FBS e 10 mM di terreno Glutamax.
  5. Mantenere la piastra in condizioni di coltura standard nell'incubatore. Osservare la migrazione dei condroprogenitori nei giorni successivi.
  6. Al raggiungimento della subconfluenza, raccogliere gli MCP utilizzando lo 0,125% di tripsina contenente EDTA.
  7. Espandere gli MCP utilizzando il mezzo di espansione standard, che include DMEM-F12, che contiene il 10% di FBS e 10 mM di Glutamax.

6. Caratterizzazione fenotipica di condrociti, FAA-CPs e MCPs

  1. Analisi citofluorimetrica (FACS)
    NOTA: Per l'analisi FACS dei gruppi cellulari raccolti, vengono seguiti i seguenti passaggi.
    1. Tripsinizzare le celle come da protocollo standard utilizzando tripsina allo 0,125% e centrifugare a 1200 x g, 5 min, temperatura ambiente per ottenere il pellet della cella.
    2. Scartare il surnatante, lavare e risospendere il pellet con 1x PBS.
    3. Trasferire la sospensione in tubi etichettati per FACS.
    4. Dividere equamente la sospensione in due tubi: un tubo "non colorato" che funge da controllo (sospensione cellulare senza anticorpi) e tubi "colorati" che fungono da test (sospensione cellulare con anticorpi).
    5. Seguire la scheda tecnica dei singoli anticorpi/marcatori Cluster of differentiation (CD) per la colorazione. Gli anticorpi per il confronto includono CD105-FITC, CD73-PE, CD90-PE, CD106-APC (marcatori di espressione positivi); CD34-PE, CD45-FITC e CD14-FITC (marcatori di espressione negativa)34,35; CD166-BB515 e CD146-PE (potenziali marcatori condrogenici)36,37.
      NOTA: I marcatori CD sono sensibili alla luce. Per garantire che i passaggi vengano eseguiti al buio.
    6. Incubare la sospensione cellulare con anticorpo per 30 minuti al buio.
    7. Dopo la colorazione, aggiungere 1 mL di 1x PBS alle provette e centrifugare a 1200 x g, 5 min, a temperatura ambiente per ottenere il pellet cellulare.
    8. Scartare tre quarti del surnatante. Risospendere il pellet nel contenuto di surnatante rimanente mediante triturazione delicata.
    9. Procedere con l'analisi FACS.

7. qRT-PCR

NOTA: l'analisi qRT-PCR dell'espressione genica comporta la valutazione del collagene di tipo I (COL1A1), del collagene di tipo X (COL10A1) e del fattore di trascrizione correlato a Runt (RUNX2) per l'espressione ipertrofica e di SOX-9, Aggrecan (ACAN) e collagene di tipo II (COL2A1) per la condrogenesi.

  1. Estrarre l'RNA dai gruppi cellulari utilizzando i kit disponibili in commercio secondo le istruzioni del produttore.
  2. Dopo l'estrazione, valutare il rapporto A260/A280 e la concentrazione di RNA.
  3. Utilizzare 280 ng dell'RNA estratto per costruire il DNA complementare (cDNA).
  4. Avviare la qRT-PCR utilizzando Sybr Green, ogni reazione contiene una concentrazione finale di 7 ng di cDNA su un termociclatore.
  5. Normalizzare l'espressione relativa dell'mRNA di ciascun gene al gene di riferimento GAPDH (ΔCt).
  6. Calcola l'espressione relativa di ciascun gene utilizzando la tecnica 2-ΔΔCt confrontando il valore di ΔCt di ogni singolo gene con quello dei FAA-CP (ΔΔCt)37.

8. Differenziazione multilineage

NOTA: I mezzi differenziali disponibili in commercio inducono la differenziazione trilineare in linee adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche.

  1. Per la differenziazione adipogenica, seminare cellule con una densità di carico di 1000 cellule/cm2 in una piastra di coltura cellulare e coltivare utilizzando un terreno di differenziazione adipogenico (cambio del mezzo - una volta ogni 3 giorni) fino a una subconfluenza dell'80% per 3 settimane.
  2. Per la differenziazione osteogenica e condrogenica, seguire il sistema di coltura a pellet di 28 giorni38.
  3. Centrifugare 0,5 x 106 celle a 400 x g per 12 minuti a 37 °C per formare pellet e avviare la differenziazione utilizzando un mezzo di differenziazione osteogenico e condrogenico.
  4. Fissare, incorporare e sezionare i pellet per la colorazione di conferma (passaggio 9).

9. Colorazione di conferma

  1. Nel caso di cellule di linea adipogenica, fissare le cellule con formalina tamponata, lavare e colorare con Oil Red O (0,5%). Macchiare anche i controlli (coltivati su un terreno DMEM standard con il 10% di FBS).
  2. Osservare al microscopio e acquisire le immagini.
  3. Per le cellule di lignaggio osteogenico differenziato, colorare con Rosso Alizarina (2%).
    NOTA: Per le cellule differenziate condrogeniche sono applicabili più protocolli di colorazione di conferma.
  4. Colorazione Alcian Blue: Colorare le celle fissate con Alcian blue per 5 minuti e controcolorare con Rosso Neutro.
  5. Per valutare il contenuto di glicosaminoglicani (GAG), eseguire la colorazione con Safranin O: colorare i vetrini con Iron Hematoxylin di Wiegert, seguita da una successiva incubazione con alcol acido (1%), soluzione fast green (0,05%), acido acetico (1%) e soluzione di Safranin O (1%).
  6. Colorazione blu di toluidina: colorare i vetrini con blu di toluidina (0,1%) per 5 minuti.
  7. Colorazione PicroSirius Red: Colorare i vetrini con Picrosirius Red (0,1%) e controcolorare con il colorante Hematoxylin.
    NOTA: Dopo la colorazione, disidratare i vetrini con alcol graduato e chiarirli con xilene. Montare i vetrini utilizzando il montante in polistirene xilene dibutilftalato (DPX), osservarli al microscopio e acquisire immagini.
  8. Per la colorazione immunoistochimica (collagene di tipo II) del pellet differenziato condrogenico, sottoporre le sezioni del pellet al recupero enzimatico dell'antigene utilizzando gli enzimi pronasi (1 mg/mL) e ialuronidasi (2,5 mg/mL).
  9. Incubare le sezioni con un anticorpo monoclonale primario di topo anti-collagene di tipo II, seguito da un anticorpo secondario di capra marcato con HRP 1:250.
  10. Colorare i vetrini con il cromogeno 3,3'-diaminobenzidina (DAB) e contrastarli con ematossilina.
  11. Osserva al microscopio e cattura le immagini.

10. Determinazione del contenuto di GAG/DNA

  1. Digerire i pellet differenziati condrogenici utilizzando una soluzione di papaina-cisteina a 65 °C per 16 h.
  2. Stimare la concentrazione di DNA utilizzando il reagente Picrogreen38 e acquisire l'intensità della fluorescenza a lunghezze d'onda - eccitazione: 480 nm, emissione: 520 nm utilizzando un lettore di piastre ELISA.
  3. Valutare il contenuto totale di GAG utilizzando il metodo del colorante dimetilmetilene blu38.
  4. Misura la densità ottica a 525 nm utilizzando un lettore di piastre ELISA.
  5. Normalizzare i valori GAG con i valori del DNA e calcolare il rapporto GAG/DNA totale.

Risultati

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Da 86,9 mg di fette di cartilagine, è stata notata una resa di cellule condrocitarie di 1,72 x 105 cellule. Al momento del caricamento, i condrociti aderiscono prontamente, presentando un aspetto iniziale arrotondato di ciottoli e trasformandosi in uno stato fibroblastico dopo un'ulteriore espansione (Figura 1 A, B). La semina di questi condrociti su piastre di fibronectina si traduce tipicamente in un'adesione del 2%, con ogni cellula che subisce una crescita clonale (Figura 2 C, D), raggiungendo un raddoppio della popolazione di 5 entro i giorni 10-12 (32 cellule/clone). I cloni all'interno dell'area di 10 cm² vengono combinati ed espansi fino al passaggio necessario per produrre FAA-CP. Gli espianti di cartilagine, sostenuti in coltura dopo l'incubazione della collagenasi, mostrano un allentamento della matrice extracellulare e la migrazione si osserva generalmente già al 7° giorno (Figura 2E). Sia i FAA-CP che gli MCP mostrano una struttura a forma di fuso, una caratteristica comunemente associata alle BM-MSC, che acquisisce una struttura a nido d'ape prima della confluenza (Figura 1E, F).

I tre tipi di cellule isolate, vale a dire condrociti, FAA-CP e MCP, sono attentamente monitorati utilizzando l'imaging a contrasto di fase. I FAA-CP vengono trasferiti solo dopo la conferma di cinque raddoppi della popolazione.

La caratterizzazione fenotipica delle cellule isolate ed espanse include tipicamente l'analisi citofluorimetrica per i marcatori putativi di condrogenesi, vale a dire CD146 e CD166, nonché l'analisi dell'espressione genica per i marcatori di condrogenesi (SOX-9, ACAN, COL2A1), il marcatore della fibrocartilagine COL1A1 e i marcatori di ipertrofia (RUNX2 e COL10A1). Tutti e tre i gruppi cellulari mostrano un'elevata espressione (>95%) di CD105, CD73 e CD90; espressione da bassa a negativa di CD34 e CD45; e un'elevata espressione (>98%) di CD166, con un'espressione moderata e dipendente dal donatore di CD146 (40%-75%)(Figura 2A).

I risultati della qRT-PCR mostrano un'espressione comparabile ed elevata di SOX-9, ACAN e anche COL1A1, un marcatore della fibrocartilagine, poiché le cellule vengono coltivate prima della valutazione (Figura 2B). Per la conferma della condrogenesi, in tutti i gruppi cellulari si osserva un assorbimento positivo di complessi rosso-arancio nelle aree contenenti GAG dopo la safranina O e di complessi bluastri-violacei dopo il blu di Alciano e il blu di toluidina, con una percentuale più elevata nei gruppi FAA-CP e MCP. L'analisi immunoistochimica dei pellet differenziati condrogenici per il collagene di tipo II mostra una captazione fibrillare brunastra in tutti e tre i gruppi (Figura 3). Inoltre, l'analisi GAG/DNA ha anche mostrato la conferma della differenziazione condrogenica con i gruppi FAA-CP che mostrano un'espressione più elevata (Figura 2C).

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Figura 1: Isolamento e caratterizzazione di condrociti e condroprogenitori. L'algoritmo di studio descrive l'isolamento di tre gruppi cellulari e le loro caratteristiche morfologiche al microscopio a contrasto di fase subito dopo l'isolamento e dopo alcuni giorni di espansione. (A) I condrociti appena isolati si attaccano alle colture aderenti durante i primi giorni di coltura, acquisendo un aspetto fibroblastico con ulteriore espansione (B). (C) I condrociti sottoposti a un saggio di adesione alla fibronectina mostrano una crescita clonale, raggiungendo un raddoppio della popolazione di 5 entro il giorno 10 (D). (E) I condroprogenitori migrano dal bordo dell'espiante entro il decimo giorno di coltura e mostrano un modello di crescita a forma di fuso con ulteriore espansione (F). Ingrandimento dell'immagine a contrasto di fase: 10x; Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Dati di caratterizzazione molecolare. (A) Analisi citofluorimetrica per marcatori MSC positivi e negativi e potenziali marcatori di condrogenesi. (B) Dati di espressione RT-PCR per i tre gruppi cellulari per l'analisi dell'espressione genica di marcatori condrogenici e ipertrofici. (C) Analisi GAG/DNA totale dei pellet differenziati condrogenici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Colorazione di conferma dopo differenziazione condrogenica. Safranina O e analisi immunoistochimica per il collagene di tipo II tra i tre gruppi cellulari. Barre della scala: per ingrandimento 10x, 50 μm; Ingrandimento 40x, 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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La potenziale rigenerazione della cartilagine articolare, contenente tessuto ialino, può essere ottenuta attraverso l'ottimizzazione dei suoi due tipi cellulari nativi: condrociti e condroprogenitori. Mentre un'ampia ricerca sui condrociti ha fornito preziose informazioni sul loro ruolo nella riparazione della cartilagine, le domande sulla natura del tessuto rigenerato hanno spinto gli sforzi per migliorare il loro fenotipo ed esplorare terapie alternative3. I condroprogenitori, identificati come una sottopopolazione cellulare relativamente recente, mostrano risultati promettenti grazie alle loro proprietà mesenchimali intrinseche, all'aumento della condrogenesi e ai limitati tratti ipertrofici12. Le due tecniche primarie per la raccolta e il potenziamento dei progenitori coinvolgono l'adesione differenziale della fibronectina e il saggio di espiantazione basato sulla migrazione18,32. L'isolamento di FAA-CP umani è stato descritto anche utilizzando tessuto meniscale, riportando un elevato potenziale proliferativo e multipotente16,17. Studi di caratterizzazione in vitro che confrontano FAA-CP e MCP con condrociti indicano un potenziale superiore per FAA-CP e MCP di mostrare fenotipi condrogenici più elevati e ipertrofici più bassi, riflettendo un profilo favorevole con un aumento dell'accumulo e della produzione di GAG 15,24,31,39. Studi in vivo limitati suggeriscono che i condroprogenitori possono attenuare la progressione dell'osteoartrite e dimostrare risultati benefici nella riparazione dei difetti osteocondrali se usati in combinazione con bioscaffold. Negli ultimi anni, sono stati compiuti notevoli sforzi di ricerca per migliorare e scoprire il pieno potenziale dei condroprogenitori.

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule residenti nella cartilagine. Le cellule primarie e più comuni rilasciate dalla cartilagine sono i condrociti. Tuttavia, la cartilagine digerita enzimaticamente è una popolazione eterogenea di cellule che non contiene solo condrociti ma anche progenitori a una concentrazione molto bassa, che richiede un arricchimento in condizioni in vitro .

Osservando prove circostanziali che indicavano il coinvolgimento di queste cellule nel guidare la crescita apposizionale, Dowthwaite et al. hanno intrapreso l'isolamento e la caratterizzazione dei condroprogenitori. Questi progenitori sono stati derivati dallo strato superficiale della cartilagine articolare attraverso l'utilizzo di un saggio di adesione alla fibronectina10. Questa popolazione distinta è stata estratta dai vitelli fetali attraverso un processo che coinvolge l'adesione selettiva alla fibronectina. È stato dimostrato che possiede una flessibilità fenotipica e un'elevata capacità di formare colonie, insieme all'espressione del gene selettore del destino cellulare Notch-1. Oltre a queste indagini iniziali, la caratterizzazione dei progenitori della cartilagine articolare umana ha rivelato elevati livelli di espressione di SOX9 e Notch1, una preferenza per CD49e/CD29 e un aumento dell'attività della telomerasi rispetto ai condrociti maturi12,32. Questo protocollo è stato stabilito anche nel tessuto cartilagineo umano osteoartritico, con rapporti che mostrano la sua presenza non solo nella cartilagine superficiale ma anche negli strati più profondi della cartilagine, con molti gruppi che impiegano colture policlonali a colture monoclonali11,12.

D'altra parte, Koelling et al. hanno studiato il potenziale coinvolgimento dei condroprogenitori nell'homing e nella migrazione in risposta a lesioni cartilaginee, contribuendo così alla riparazione dei tessuti18. Inoltre, Seol et al. hanno dimostrato che, in risposta al danno della cartilagine, i progenitori hanno mostrato un aumento della migrazione attraverso la High Mobility Group Box 1 Protein (HMGB1) e la chemiotassi mediata da RAGE19. Elsaesser et al. hanno anche osservato la superiore capacità migratoria dei condroprogenitori nasali rispetto ai condrociti e alle BM-MSC22. Uno studio condotto da Joos et al. ha scoperto che il rilascio del Plainlet-Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) e dell'Insulin-Like Growth Factor 1 (IGF-1) ha aumentato la migrazione dei condroprogenitori, mentre l'interleuchina 1 beta (IL-1β) e il Tumor Necrosis Factor-alfa (TNFα) hanno inibito il movimento dei progenitori dopo la lesione40. È stato condotto un recente rapporto che confronta quattro diversi metodi di isolamento MCP in termini di metodi di isolamento e condizioni di coltura, e il metodo raccomandato è spiegato in questo articolo33. L'approccio di isolare i progenitori in base alle loro capacità migratorie ha portato a cellule che non solo mostravano un alto potenziale condrogenico, ma mostravano anche caratteristiche simili alle cellule staminali mesenchimali.

In laboratorio, seguendo protocolli standardizzati, è stato raggiunto con successo l'isolamento di tutti e tre i sottotipi. Inoltre, studi comparativi pionieristici hanno dimostrato le caratteristiche superiori dei FAA-CP rispetto ai condrociti 12,15,41. Sono stati anche esplorati confronti tra condroprogenitori, rivelando che gli MCP mostrano un potenziale più elevato24. Bisogna tenere presente che, poiché i tre sottotipi sono isolati dallo stesso tessuto e il progenitore nella sua forma nativa è molto basso nella sua presenza al momento del rilascio iniziale dalla cartilagine articolare - che contiene principalmente condrociti - c'è la necessità di arricchirli utilizzando colture in vitro.

I metodi di valutazione completi comprendevano la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR), l'analisi al microscopio elettronico, gli studi di titolazione dei fattori di crescita, le tecniche di marcatura cellulare, l'immunoprofilazione e la valutazione del loro potenziale terapeutico per il trattamento dell'osteoartrite e dei difetti condrali utilizzando modelli in vivo 12,24,42.

I risultati attuali indicano che l'isolamento di tutti e tre i sottotipi è fattibile anche dalle articolazioni osteoartritiche, sebbene richieda una durata di espansione prolungata. In particolare, sottolineiamo l'importanza di evitare l'aggiunta di fattori di crescita durante la crescita clonale, evidenziando la necessità cruciale di introdurre fattori aggiuntivi durante l'espansione di queste cellule. Passaggi cruciali, come i tempi di incubazione su piastre rivestite di fibronectina, l'aggiunta di fattori di crescita in diversi punti temporali e la gestione minima degli espianti, tra gli altri elementi essenziali menzionati, svolgono un ruolo significativo nella coltura e nell'espansione delle cellule raccolte. È inoltre essenziale assicurarsi che le celle raggiungano una confluenza non superiore al 75%-80% in un dato momento.

Il potenziale dei condroprogenitori ha suscitato un notevole interesse a causa della loro superiorità rispetto alle terapie cellulari comunemente utilizzate nel campo della riparazione della cartilagine, in particolare BM-MSC e condrociti. Questi progenitori si dimostrano promettenti, con diversi esperimenti in vivo che dimostrano la loro efficienza nel sostituire l'attuale standard di cura. Essendo un sottogruppo scoperto di recente, la caratterizzazione e le informazioni sul loro fenotipo sono ancora in corso, con il primo studio clinico che utilizza FAA-CP per il trattamento dei difetti condrali previsto per il 2024. Pertanto, l'isolamento e l'espansione delle cellule derivate dalla cartilagine, in particolare i condroprogenitori, sono cruciali e promettenti per la riparazione cellulare nel campo della rigenerazione della cartilagine.

Ringraziamenti

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Ringraziamo la signora Bhavini Krishnan e la signora Merin Mary Zachariah per il loro contributo intellettuale e il Centro per la ricerca sulle cellule staminali (un'unità di inStem Bengaluru), Dipartimento di Fisiologia, Christian Medical College, Vellore, per il supporto infrastrutturale. I progetti in corso sono supportati dal Dipartimento di Biotecnologie (BT/PR32777/MED/31/415/2019), dal Governo dell'India, dal Consiglio per la ricerca scientifica e ingegneristica (CRG/2022/004277), dal Governo dell'India e dalle sovvenzioni per la ricerca sui fluidi, Christian Medical College, Vellore.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
22 lame per bisturi Piastra a
 CORNING3516
Blu AlcianoTHERMO SCIENTIFICJ6012
Rosso Alizarina SIGMA130223
Amfotericina-B (2 μ g/mL).GIBCO15240062
acido ascorbico (62 μ g/mL)Citometro a flusso SIGMA ALDRICHA4544-25G
BC CytoFLEX LX BECKMAN COULTERCYTExpert Software Versione 2.5
CaCl2SIGMA ALDRICH  C34006
CD105-FITCBD BIOSCIENCE
CD106-APCBD BIOSCIENCE
CD14-FITCBD BIOSCIENCE
CD29-APCBD BIOSCIENCE
CD34-PEBD BIOSCIENCE
CD45-FITCBD BIOSCIENCE
CD49b-FITCMILTENYL BIOTEC  MACS 130/100337
CD49e-PEBD BIOSCIENCE
CD73-PEBD BIOSCIENCE
550257 CD90-PEBD BIOSCIENCE561970
Contatore cellulareDE NOVIXCell Drop BF
Filtro cellulareHIMEDIATCP024
CentrifugaBECKMAN COULTERAllegra X-30R
Incubatore CO2 THERMO SCIENTIFICMODEL-371
Collagene di tipo X (COL10A1), fattore di trascrizione correlato a Runt (RUNX2), fattore di trascrizione SRY-Box 9 (SOX-9), Aggrecan (ACAN) e collagene di tipo II (COL2A1) EUROGENTEC, BELGIO
Collagenasi di tipo IIWORTHINGTONLS004176
DMEM F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F-12)SIGMA ALDRICHD8900-1L
ELISA PLATE READERMOLECOLARISpectraMax i3x Reader
FastGreen FISHER SIENTIFIC2353459
Siero fetale bovinoGIBCO10270106
FGF2CLOUD CLONE CORPAPA551Hu01
Fibronectina (10 &; L/mL)SIGMA ALDRICHF1141
Sistema di sintesi del primo filamentoTAKARA BIO6110A
GlutamaxGIBCO35050061
EmatossilinaQUALIGENSQ39411
MgCl2 SIGMA ALDRICHM8787
Olio Rosso OSIGMA1320065
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)GIBCO10010023
PCR termociclatore APPLIED BIOSYSTEMSTermociclatore Quantstudio 12K Flex 
Penicillina-streptomicina (100 UI/mL)GIBCO15240062
Picrosirius RedALFA AESAR2610108
Anticorpo primario (topo Collagene tipo II)DSHBDSHB II II6B3
PronasiROCHE10165913103
Quant-iT Picogreen reagente DNATHERMO SCIENTIFICP7589
FrigoriferoELANPRO
RNeasy MiniKitQIAGEN74104
Safranina OQUALIGENSQ39962
Anticorpo secondario (Anticorpo IgG anti-topo di capra, coniugato HRP)THERMO SCIENTIFIC31430
Bagno d'acqua agitante REMI
StemPro GIBCO1007201, A1007001 e A1007101
Pallone T-25CORNING430639
TakyonTM Low Rox SYBR Master Mix dTTP Blue EUROGENTECUF-LSMT-B0701
TGFβABCAMab277760
Petridish di coltura tissutaleTARSONS960010
Blu di toluidinaQUALIGENS2040
Blu di tripano GIBCO15250061
Tripsina EDTAGIBCO25200072
6 pozzetti GLASS VAN 561443 551147 555397 559883 348057 347463 555617 DISPOSITIVI Kit di differenziazione

Riferimenti

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