Articolo metodologico

Visualizzazione della risposta al danno al DNA nelle cellule di Purkinje utilizzando colture organotipiche cerebellari

DOI:

10.3791/67167

⸱

27 dicembre 2024

 ,  , 
1The David and Inez Myers Laboratory for Cancer Genetics, Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Faculty of Health and Medical Sciences, School of Medicine, Tel Aviv University

In questo articolo

Sommario

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Le cellule cerebellari di Purkinje (PC) sono particolarmente sensibili alle carenze nella risposta al danno del DNA. Viene presentato un protocollo per la valutazione visiva della dinamica della risposta del PC al danno al DNA, che prevede la colorazione di catene poli(ADP-ribosio) legate alle proteine all'interno di colture organotipiche cerebellari.

Abstract

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Le cellule cerebellari di Purkinje (PC) mostrano un'interazione unica di alti tassi metabolici, architettura specifica della cromatina e ampia attività trascrizionale, che le rendono particolarmente vulnerabili ai danni al DNA. Ciò richiede un'efficiente risposta al danno del DNA (DDR) per prevenire la degenerazione cerebellare, spesso avviata da disfunzione o perdita di PC. Un esempio notevole è la sindrome da instabilità del genoma, atassia-teleangectasia (A-T), caratterizzata da progressiva deplezione di PC e deterioramento cerebellare. Studiare i meccanismi DDR nei PC è vitale per chiarire i percorsi che portano alla loro degenerazione in tali disturbi. Tuttavia, la complessità dell'isolamento e della coltivazione dei PC in vitro ha a lungo ostacolato gli sforzi della ricerca. Le colture organotipiche cerebellari murine (fette) offrono un'alternativa fattibile, che imita fedelmente l'ambiente tissutale in vivo . Tuttavia, questo modello è limitato a indicatori DDR suscettibili di imaging microscopico. Abbiamo perfezionato il protocollo di coltura organotipica, dimostrando che l'imaging fluorescente delle catene di poli(ADP-ribosio) (PAR) legate alle proteine, un indicatore DDR rapido e precoce, rivela efficacemente le dinamiche DDR nei PC all'interno di queste colture, in risposta allo stress genotossico.

Introduzione

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L'integrità del DNA cellulare è costantemente minacciata da agenti che danneggiano il DNA, prevalentemente sottoprodotti metabolici come le specie reattive dell'ossigeno, che infliggono decine di migliaia di lesioni al DNA per cellula al giorno. Il mantenimento persistente della stabilità del genoma è essenziale per l'omeostasi cellulare 2,3. La pietra angolare di questo mantenimento è la risposta al danno del DNA (DDR), una rete di segnalazione intricata e stratificata che avvia specifici percorsi di riparazione del DNA regolando attentamente molti altri processi cellulari 4,5. I deficit nella DDR si manifestano comunemente come "sindromi da instabilità del genoma", caratterizzate da instabilità cromosomica, progressivo deterioramento dei tessuti, crescita o sviluppo alterati, predisposizione al cancro e maggiore sensibilità a particolari agenti dannosi per il DNA 6,7,8,9. In particolare, la neurodegenerazione, che spesso include l'atrofia cerebellare, è una caratteristica distintiva di molte sindromi da instabilità genomica 7,10,11,12.

La malattia autosomica recessiva, atassia-teleangectasia (A-T), è un esempio ben documentato di disturbo da instabilità genomica 13,14,15. Questa condizione deriva da mutazioni nulle nel gene ATM (A-T, mutato), responsabile della codifica della proteina chinasi cardine, ATM, che è nota principalmente come mobilizzatore DDR in risposta alle rotture del doppio filamento del DNA (DSB)16,17. L'A-T si manifesta come una malattia multisistemica, caratterizzata prevalentemente da progressiva degenerazione cerebellare, che porta a disabilità motorie acute, immunodeficienza, atrofia gonadica, predisposizione al cancro ed estrema sensibilità alle radiazioni ionizzanti. Le cellule in coltura di individui con A-T mostrano instabilità cromosomica e una maggiore sensibilità agli agenti genotossici, in particolare quelli che causano DSB 15,18,19. È importante sottolineare che l'ATM svolge anche un ruolo nella riparazione di altre lesioni del DNA, sottolineando la sua ampia importanza nel mantenimento della stabilità del genoma 20,21,22.

Nonostante la ricerca approfondita sui numerosi ruoli dell'ATM, il meccanismo specifico che porta alla degenerazione cerebellare nell'A-T rimane un argomento di dibattito attivo, con vari modelli proposti per chiarire questo processo 23,24,25,26,27,28,29,30. Il nostro modello28 suggerisce che la degenerazione cerebellare nei pazienti con A-T inizia con la disfunzione e l'eventuale perdita di cellule di Purkinje (PC). Considerando il ruolo critico dell'ATM nel preservare la stabilità del genoma di fronte a continui danni al DNA, i PC sono particolarmente vulnerabili all'assenza di ATM. Attribuiamo questa vulnerabilità alla combinazione della loro elevata attività metabolica, della caratteristica struttura della cromatina e dell'estesa attività trascrizionale. In definitiva, si suggerisce che la perdita della funzione PC, e quindi la loro degenerazione, sia dovuta all'inattivazione stocastica e funzionale dei geni, una conseguenza della produzione di trascritti difettosi28.

Lo studio della biologia del PC in laboratorio è ostacolato dalle sfide nella coltivazione di PC isolati, poiché queste cellule dipendono fortemente dal loro ambiente naturale e dalle cellule vicine per la sopravvivenza e la funzione, rendendole incompatibili con la crescita dissociata della coltura. Ciononostante, i PC possono rimanere vitali per lunghi periodi nelle colture di fette di tessuto. Le colture organotipiche cerebellari, che sono fette di tessuto tipicamente derivate dalla cerebella dei roditori, mantengono l'organizzazione strutturale del tessuto e supportano varie manipolazioni sperimentali analoghe a quelle possibili con le cellule in coltura. Pertanto, queste colture consentono studi cerebellari in un ambiente controllato 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. In particolare, nel contesto dell'A-T, le colture organotipiche cerebellari murine si sono dimostrate strumentali nell'esplorazione della DDR nei PC con deficit di Atm 40,41,42,43. Mentre i topi carenti di ATM mostrano solo un fenotipo cerebellare sottile 44,45,46,47, presumibilmente a causa delle differenze tra la fisiologia cerebellare umana e quella del topo, l'ipotesi è che i ruoli di ATM siano in gran parte conservati in queste specie. Questa nozione è supportata dalle nostre osservazioni che la risposta carente ai DSB del DNA nei PC murini Atm-/- si allinea con quella osservata in altri tipi di cellule murine e umane con deficit di ATM/Atm 40,41,42,43.

Un limite nell'analisi delle risposte del PC a vari stimoli o stress all'interno di colture organotipiche è la necessità di fare affidamento sull'imaging microscopico per le letture. La DDR viene solitamente studiata utilizzando letture biochimiche di massa, sebbene vengano utilizzati anche comuni marcatori immunofluorescenti, come seguire le dinamiche di formazione e risoluzione dei focolai nucleari dell'istone fosforilato H2AX (γH2AX) e della proteina 53BP1, che sono considerati indicatori di DSB48,49. Una misura più ampia è l'imaging fluorescente della formazione di catene di poli(ADP-ribosio) (PAR) sulle proteine, una risposta rapida e robusta al danno precoce del DNA, in particolare alle rotture del filamento 7,50. Abbiamo modificato il protocollo di Komulainen et al.51 per la colorazione PAR in colture organotipiche cerebellari. Abbiamo osservato una pronunciata risposta PAR in nuclei considerevoli di PC. Viene presentato qui il nostro protocollo perfezionato per stabilire colture organotipiche cerebellari murine e per visualizzare la risposta PAR sotto stress genotossico.

Protocollo

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Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su materiali, attrezzature e anticorpi. Le procedure per gli animali sono state impiegate secondo le linee guida etiche del Comitato Etico dell'Università di Tel Aviv dopo l'approvazione. La procedura viene eseguita su cuccioli di topo di 10 giorni, indipendentemente dal loro sesso. Se necessario, la genotipizzazione viene eseguita il giorno precedente utilizzando una biopsia della coda e metodi standard. Le soluzioni sono sterili e conservate a 4 °C, salvo diversa indicazione; vedere la Tabella 1.

1. Preparazione delle colture

NOTA: Eseguire la procedura in un ambiente sterile e disinfettare preventivamente la superficie di lavoro utilizzando etanolo al 70%.

  1. Aggiungere 1 mL di BME a ciascun pozzetto di piastre a 6 pozzetti. Utilizzando una pinza sterile, posizionare un singolo inserto di coltura cellulare in ciascun pozzetto e incubare le piastre in un incubatore a 37 °C/5% di CO2 per almeno 2 ore prima della procedura di dissezione.
  2. Allestire un'area di dissezione all'interno di una cappa biologica, contenente il tritatessuti, piastre di coltura da 30 mm, un microscopio binoculare e una fonte di luce.
  3. Immergere gli strumenti chirurgici in etanolo al 70% durante tutto il processo. Utilizzare una coppetta urinaria riempita con etanolo al 70% per l'immersione e una coppetta urinaria separata con 1x PBS per lavare via l'etanolo prima dell'uso.
  4. Per ogni dissezione (cioè per ogni cervelletto), preparare due piastre di coltura da 30 mm riempite con terreno di dissezione freddo e lasciarle in ghiaccio.
  5. Spruzzare l'animale con etanolo al 70%.
  6. Usando forbici affilate, decapita rapidamente l'animale. Per esporre il cervello, fai una piccola incisione con le forbici lontano dal cervelletto. Usando una pinzetta con le estremità arrotondate, stacca delicatamente il cranio. Rimuovere il cranio in piccoli pezzi per evitare di danneggiare il tessuto cerebellare.
  7. Trasferire immediatamente il cervello in un mezzo di dissezione a freddo o rimuovere direttamente il cervelletto dall'interno del cranio. Per fare ciò, esporre il cervelletto e separare la corteccia cerebellare dal tronco encefalico scollegando le tre paia di peduncoli, utilizzando una spatola a iride ricurva fine. Per identificare i peduncoli, vista dal rostrale alla caudale: i peduncoli cerebellari superiori accoppiati collegano il mesencefalo a ciascun lato del cervelletto; i peduncoli cerebellari medi accoppiati collegano il ponte a ciascun lato del cervelletto; e i peduncoli cerebellari inferiori accoppiati si collegano al midollo su ciascun lato del cervelletto. Una volta che il cervelletto è visibile, separalo dal cervello usando la stessa spatola: fai scorrere la spatola tra il cervelletto, il collicolo superiore e il tronco encefalico.
    NOTA: Non fare uno sforzo particolare per rimuovere le meningi poiché si staccano facilmente dopo che il cervelletto è stato tagliato.
  8. Impostare il tritatutto su uno spessore della fetta di 350 μm.
  9. Prima di posizionare il cervelletto sulla base del tritatutto, rimuovere il tampone di dissezione in eccesso dal tessuto. Ciò migliorerà l'adesione del tessuto alla base del tritatutto.
  10. Posizionare il cervelletto sulla piattaforma di taglio in orientamento verticale ed eseguire il taglio parasagittale con uno spessore della fetta di 350 μm. Separare delicatamente le fette con una spatola a iride fine e metterle in un mezzo di dissezione freddo.
  11. Trasferire il tessuto affettato in un tampone di dissezione a freddo fresco. Utilizzare un puntale da 1.000 μl per guidare delicatamente le fette di tessuto nella piastra contenente il tampone di dissezione a freddo.
  12. Sotto il binocolo utilizzare due spatole a iride curve per separare accuratamente le fette di tessuto l'una dall'altra. Per le colture, utilizzare fette derivate dal verme cerebellare situato nella zona cortico-nucleare mediale dell'organo.
  13. Trasferire ogni fetta di tessuto su un inserto di coltura utilizzando una spatola larga e spostare ogni inserto che trasporta una fetta di tessuto in un pozzetto delle piastre a 6 pozzetti contenenti il terreno preriscaldato. Lasciare le piastre nell'incubatrice.
  14. Sostituire il terreno a giorni alterni: aspirare il terreno usato utilizzando una pipetta di vetro sterile e con una pipetta sierologica da 5 mL, aggiungere 1 mL di MBE fresco con la punta della pipetta appoggiata alla parete del pozzetto. Assicurarsi di non dirigere il flusso del fluido sul tessuto.
    NOTA: La fetta di tessuto mostrerà un aspetto simile all'infiammazione per i primi 5-7 giorni in coltura e sarà pronta per gli esperimenti non appena questo fenomeno scompare e fino a 2 settimane dopo l'insediamento della coltura.

2. Trattamento con agenti dannosi per il DNA, fissazione, colorazione e imaging microscopico

  1. Aggiungere sostanze chimiche dannose per il DNA direttamente nel terreno di coltura a concentrazioni finali appropriate, per durate predeterminate. Trascorso il periodo di esposizione, rimuovere le sostanze chimiche sostituendo il terreno con un terreno di coltura fresco.
  2. Se la lettura DDR prevede la colorazione PAR, aggiungere un inibitore della poli(ADP-ribosio) glicoidrolasi (PARG) al terreno di coltura a una concentrazione finale di 10 μM, 30 minuti prima della fissazione.
    NOTA: Questo trattamento è fondamentale in quanto la modifica PAR è di breve durata e continuamente degradata da PARG.
  3. Immediatamente prima della fissazione, aspirare il terreno e sostituirlo con 1 mL di tampone fosfato 0,1 M a temperatura ambiente.
    NOTA: Il tampone freddo potrebbe causare il distacco delle fette di tessuto dall'inserto.
  4. Fissare immediatamente le fette sostituendo il tampone con una miscela di acetone/metanolo (1:1) preraffreddata (-20 °C) in modo tale che la fetta di tessuto sia immersa in questa miscela e lasciare agire per 20 minuti a -20 °C.
    NOTA: È possibile fermarsi in questa fase e procedere con l'immunocolorazione in un secondo momento. Per fare ciò, lavare i tessuti 3 volte con tampone fosfato 0,1 M preraffreddato a 4 °C, assicurandosi che il tessuto sia immerso nel tampone. I fazzoletti possono essere conservati in tampone fosfato 0,1M per un massimo di 2 settimane a 4 °C.
  5. Trasferire la fetta di tessuto in un pozzetto in una piastra a 48 pozzetti.
  6. Usa un bisturi e un tagliere per rimuovere i margini dell'inserto, tagliando intorno alla fetta di tessuto. Mettere ogni fetta in un pozzetto di una piastra da 48 pozzetti. Aggiungere 100 μl di tampone fosfato 0,1 M.
  7. Per la permeabilizzazione, aspirare il tampone, aggiungere al pozzetto 100 μl di tampone fosfato 0,1 M contenente l'1% di Triton X-100 e lasciare agire per 5 minuti a temperatura ambiente.
  8. Aspirare la soluzione e aggiungere 100 μL di soluzione bloccante (vedere Tabella 1) per pozzetto. Agitare delicatamente a temperatura ambiente per 2 ore.
  9. Durante la fase di blocco, diluire l'anticorpo primario o il reagente anti-PAR (1:800) nella soluzione bloccante.
  10. Rimuovere la soluzione bloccante (non è necessario lavarla) e aggiungere 100 μl di miscela di anticorpi primari in ciascun pozzetto. Applicare una leggera agitazione per 2 ore a temperatura ambiente.
  11. Diluire gli anticorpi secondari in tampone fosfato 0,1 M contenente Triton X-100 allo 0,2% (1:500) riducendo al minimo la loro esposizione alla luce.
  12. Aspirare la soluzione di anticorpi primari e lavare le fette 3 x 5 min con tampone fosfato 0,1 M contenente 0,2% di Triton X-100, a temperatura ambiente, agitando delicatamente.
  13. Sostituire la soluzione di lavaggio con 100 μl di soluzione di anticorpi secondari (diluizione 1:500). Continuare ad agitare delicatamente per 2 ore a temperatura ambiente al buio (coprire i piatti con un foglio di alluminio).
  14. Per preparare una soluzione DAPI, diluire la soluzione madre (2 mg/mL) a 1 μg/mL in 1x PBS.
  15. Venti minuti prima della fine delle 2 ore di incubazione con l'anticorpo secondario, aggiungere 20 μl della soluzione finale di DAPI a ciascun pozzetto e continuare ad agitare per 20 minuti. Aspirare il liquido e lavare con la soluzione di lavaggio per 3 x 5 minuti agitando delicatamente.
  16. Per il montaggio, posizionare il tessuto su un vetrino da microscopio con il fazzoletto rivolto verso l'alto, aggiungere il mezzo di montaggio e coprire con un vetro di copertura. Posizionare i vetrini su una superficie piana e lasciarli asciugare per una notte al buio, a temperatura ambiente (evitare di utilizzare supporti di montaggio contenenti DAPI per evitare sfocature).
  17. Conservare i vetrini a 4 °C in una scatola resistente alla luce.
  18. Acquisisci immagini microscopiche utilizzando un microscopio confocale e filtri appropriati.

Risultati

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La Figura 1 illustra l'aspetto generale delle colture organotipiche cerebellari. La riga superiore della Figura 1A mostra la foliazione cerebellare, che viene mantenuta in coltura, mentre la riga inferiore mostra i PC colorati per la Calbindina D-28k (verde) e i nuclei neuronali colorati per NeuN (rosso). Nella Figura 1B, gli astrociti nei PC (rosso) sono colorati per GFAP (verde), una proteina di tipo III del filamento intermedio. La Figura 2 e la Figura 3 mostrano la colorazione PAR osservata dopo aver trattato queste colture con due agenti dannosi per il DNA, entrambi fortemente ossidanti: bromato di potassio (una concentrazione finale di 10 mM per 12 ore) e paraquat. La risposta PAR è stata marcata nei PC trattati nel foglio cerebellare rispetto al controllo.

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Figura 1: Panoramica delle colture organotipiche cerebellari mure. (A) La riga superiore illustra la foliazione cerebellare, che viene mantenuta in coltura. La riga inferiore si concentra sul livello PC. I PC sono evidenziati da Calbindin D-28k (verde). La colorazione NeuN (rosso) identifica i nuclei neuronali attraverso gli strati. (B) Uno sguardo più da vicino ai PC (rosso). GFAP (verde), una proteina del filamento intermedio di tipo III, che evidenzia gli astrociti. Barre della scala = 968,8 μm (A, riga superiore), 42,1 μm (A, seconda fila), 72,7 μm (B, riga superiore), 18,2 μm (B, seconda fila). Abbreviazioni: PC = celle di Purkinje; GFAP = proteina acida fibrillare gliale; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Colorazione PAR in una fetta cerebellare trattata con bromato di potassio. La fetta cerebellare è stata trattata con bromato di potassio (KBrO3), un potente agente ossidante, a una concentrazione finale di 10 mM per 12 ore. Barre di scala = 775 μm. Abbreviazioni: PAR = poli(ADP-ribosio); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Risposta PAR in fette cerebellari esposte al paraquat, un forte produttore di anioni superossido. (A) Una visione generale di un foglio cerebellare. Si noti la robusta risposta PAR, in particolare nei PC, rispetto al controllo. (B) Un esame più attento mostra la risposta PAR nei PC e in altri tipi di cellule. Barre della scala = 193,8 μm (A), 18,2 μm (B). Abbreviazioni: PAR = poli(ADP-ribosio); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Soluzioni e tamponi
Soluzione  Ingredienti
Mezzo di dissezioneSoluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente lo 0,5% di D-glucosio. Aggiungere 0,5 mL di soluzione di D-glucosio al 50% a 50 mL di HBSS senza Mg2+ e Ca2+.
Terreno di coltura BMEMescolare 100 ml di Basal Medium Eagle (BME) contenente rosso fenolo ma non L-glutammina o HEPES, con 50 ml di HBSS con rosso fenolo, 50 ml di siero di cavallo inattivato termicamente, 2 ml di D-glucosio al 50% e 1 ml di 200 mM di L-glutammina. Miscelare e filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm in un ambiente sterile. Conservare a 4 °C
Soluzione bloccante per immunocolorazionein tampone fosfato 0,1 M: aggiungere 0,5% Triton X-100, 10% siero di capra
Tampone di diluizione anticorpale secondariotampone fosfato 0,1 M, 0,2% Triton X-100
Tampone di lavaggiotampone fosfato 0,1 M, 0,2% Triton X-100
Soluzione fissativaActenoe:metanolo (1:1 v:v)
Soluzione di permeabilizzazionetampone fosfato 0,1 M, 1% Triton X-100
Soluzione DAPISoluzione madre (2 mg/mL) diluita a 1 μg/mL in 1x PBS
Tampone fosfatoPreparare due anime A e B (vedi sotto). Miscelare le soluzioni secondo i rapporti specificati di seguito per ottenere un tampone fosfato 0,2 M. Quindi diluire la soluzione 0,2M con DDW (1:1) per ottenere un tampone fosfato 0,1 M (soluzione di lavoro).
soluzione A (per 0,2 M)12 g di Fosfato di Sodio Monobasico Anidro (Na2HPO4 FW 141.96)
500 mL di DDW
Soluzione B (per 0,2 M)14,2 g di Sodio fosfato diabasico anidro (Na2HPO4 FW 141.96)
500 mL di DDW
Soluzioni miscelate per fare 0,2 MPreparare 1 L: 230 mL di soluzione A e 770 mL di soluzione B
0,1 M di tampone fosfatoDiluire la soluzione miscelata con DDW (1:1)

Tabella 1: Soluzioni e loro composizione.

Discussione

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Osservazioni generali
Il principale vantaggio del sistema di coltura organotipica è che facilita gli studi utilizzando il tessuto della corteccia cerebellare, preservandone l'organizzazione strutturale per diverse settimane nella configurazione del piatto di coltura. Questo sistema è utile per condurre analisi morfologiche approfondite delle cellule di Purkinje (PC), compresi esami dettagliati delle spine dendritiche e delle caratteristiche ultrastrutturali 52,53,54,55,56,57,58,59. Le nostre osservazioni indicano che la risposta al danno al DNA (DDR) è notevolmente attiva nei PC all'interno di queste culture. Tuttavia, i principali limiti di questo sistema includono la durata limitata del suo utilizzo e la sua dipendenza dall'imaging microscopico per monitorare i processi cellulari, evidenziando la continua necessità di sviluppare o adattare tecniche di imaging adeguate.

Un'altra parola di cautela riguarda la parte cerebellare che viene sezionata per preparare le fette di tessuto. Abbiamo osservato che lobi cerebellari diversi possono produrre colture con un'organizzazione interna e una qualità complessiva marcatamente diverse. Pertanto, preferiamo stabilire colture da fette ottenute tramite sezioni mediosagittali del verme cerebellare. In queste fette, le foglie della corteccia cerebellare sono convenientemente visibili.

Si consiglia di utilizzare fette di tessuto ricavate dal verme cerebellare, che presentano la caratteristica foliazione della corteccia cerebellare. Queste fette mantengono la loro struttura organizzativa nella cultura per diverse settimane. Inoltre, si raccomanda di iniziare le procedure sperimentali con le colture circa 7-12 giorni dopo l'insediamento. Un tipico esperimento progettato per valutare la risposta al danno al DNA in queste colture comporta l'avvio del danno mediante irradiazione o l'aggiunta di sostanze chimiche dannose per il DNA al terreno di coltura. Successivamente, la fissazione e la colorazione dei tessuti vengono eseguite a vari intervalli di tempo. Per valutare il recupero da danni indotti da sostanze chimiche, è incluso un periodo di incubazione in terreno fresco. Si consiglia di iniziare esperimenti a lungo termine il prima possibile, idealmente intorno ai 7 giorni successivi all'insediamento della coltura.

Le colture organotipiche cerebellari sono mantenute in un terreno privo di antibiotici; Pertanto, è imperativo mantenere un ambiente sterile durante il loro stabilimento. L'età dei cuccioli da cui vengono prelevati i cervelletti è fondamentale, con un intervallo consigliato di 9-12 giorni. Questa fascia di età è ottimale in quanto la corteccia cerebellare è sufficientemente sviluppata per il sezionamento. In particolare, negli animali più anziani, i tessuti tendono ad aderire alla lama. È fondamentale mantenere il cervelletto immerso in una soluzione di dissezione fredda fino a quando non viene sezionato.

Durante i primi 5-7 giorni di coltura, le fette di tessuto possono mostrare segni che ricordano l'infiammazione, caratterizzati da gonfiore e scolorimento lattiginoso. Questi attributi possono potenzialmente influenzare la misurazione dei parametri fisiologici e l'efficacia delle tecniche di immunocolorazione.

Si consiglia vivamente di non affettare il cervelletto più sottile di 350 μm per evitare incoerenze di spessore durante l'affettatura. Tenere presente che un tessuto con fette di 350 μm diventa molto più sottile dopo 7 giorni di coltura fino a circa 90 μm (in base alla misurazione della pila Z).

Qui, introduciamo la colorazione PAR 7,50 al toolkit utilizzato per studiare la DDR nei PC. Questa lettura è rapida, sensibile e cattura la natura dinamica della DDR, dimostrandosi particolarmente utile nella nostra analisi della DDR in PC wild-type e con deficit di ATM. I protocolli qui descritti dovrebbero essere particolarmente utili per i ricercatori che studiano le sindromi da instabilità genomica che colpiscono il cervelletto.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse in relazione a questo studio.

Ringraziamenti

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Il lavoro nel nostro laboratorio è supportato dalla Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation e dall'Associazione israeliana per la lotta contro la malattia A-T.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagente e attrezzature
150 x 30 cm Piastra di PetriCorning Inc.3261
Piastra di Petri 35 x 10 mmCorning Inc.3294
AcetoneInvitrogen25030081
AcetoneSigma-Aldrich270725-1L
Vetrini adesivi per microscopioMarienfeld4818776 x 26 x 1 mm
Lame per tritatuttoTED PELLAModello TC752-1  Stile Lamette da barba
BMEGIBCO41010-026 500ml.Nessun L-Glut
Inserti per colture cellulariMilliporePICM0RG50
D-glucosiobiologico Indo.02-015-1A
HBSS senza rosso fenoloSigma-AldrichH-1138-500LNo Ca+, No Mg+
HBSS con rosso fenoloSartorius02-015-1A
Siero di cavallo GIBCO26050088inattivata a caldo
CellPathGZX-0100-00Aseghettata smussata da 130 mm
F.S.T10092-12
L-Glutammina (200 mM)Gibco41010026
MetanoloSigma-Aldrich322412-1L
Metanolo Microscopio Sigma-AldrichG5767
Olympus
Mezzo di montaggio senzaGRIGENE. Ltd, IsraeleK239320A
ParaquatSigma-Aldrich856177-250MGParaquat dicloruro (metilviologeno)
PARG- Poli(ADP-Ribosio) Inibitore della glicoidrolasiTocris Bioscience, Regno UnitoPDD 00017273sensibile alla luce 
Tampone fosfatoBiological Indo.02-018-1A
Forbici, piastre
sei pozzettiper tessuti cutanei Corning incorporatiCLS3516
dischi da taglio di ricambio TED PELLAModello 10180-01
TritatessutiMcIlwainModello TC75210180-220
Pinzette, appuntite
Coppette
Anticorpi
Alexa fluor 488 asino anti IgG di coniglio 
Invitrogen		A212061:500; secondario ab; Tampone di diluizione secondario;   Incubazione per 2 ore a temperatura ambiente
Anti protien acido fibrillare glialeMilliphoreMAB34021:1500; ab primario; bloccante; Host: mouse
Anti-calbindin-D-28KSwant CB3001:2000; ab primario; bloccante; ospite: coniglio 
Anti-calbindina-D-28KSwantCB-38a1:2000; ab primario; bloccante 
Reagente anti-pan-ADP-ribosioMilliphoreMABE10161:800; ab primario; bloccante; incubazione per 2 ore a temperatura ambiente
DAPI (4',6-Diamidina-2'-fenilindolo dicloridrato)Segnalazione cellulare40841:1000; tampone di diluizione secondario; incubazione per 20 minuti a temperatura ambiente
pinza per iride Spatola per iride a urinarie

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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