Elaborazione efficiente delle cellule helper follicolari T tonsillari e analisi funzionale attraverso la citometria a flusso ad alta dimensione

Summary

Qui presentiamo un protocollo per la raccolta e l'elaborazione di campioni di tonsilla, la fenotipizzazione utilizzando la citometria a flusso spettrale ad alta dimensionalità e l'esecuzione di analisi non supervisionate.

Abstract

Le cellule T follicolari helper (Tfh) sono un sottoinsieme di cellule T helper CD4⁺ che aiutano nella commutazione dell'isotipo delle cellule B, nella formazione del centro germinale (GC), nell'ipermutazione somatica e nella maturazione dell'affinità, aiutando così a orchestrare le risposte immunitarie umorali adattative nei tessuti linfoidi secondari durante l'infezione, l'autoimmunità e la vaccinazione. Comprendere lo sviluppo e la funzione delle cellule Tfh è fondamentale per la progettazione di vaccini efficaci e lo sviluppo di strategie di trattamento mirate per le malattie che coinvolgono questa popolazione. Le cellule tonsillari umane sono organi linfoidi mucosi accessibili. Offrono un'opportunità unica per profilare popolazioni immunitarie distinte come le cellule Tfh e GC, interrogare le interazioni cellula-cellula, valutare le funzioni cellulari dinamiche e scoprire i loro meccanismi di regolazione a livello di organo. Inoltre, le colture in vitro di cellule tonsillari sono semplici da elaborare e consentono la valutazione della biologia cellulare Tfh in varie condizioni. Qui, introduciamo un protocollo per la raccolta, l'isolamento, la conservazione e la coltura delle cellule tonsilari umane. Descriviamo anche due pannelli di citometria a flusso spettrale ottimizzati progettati per la caratterizzazione approfondita delle cellule Tfh. Infine, utilizzando come esempio un trattamento con inibitore della proteina fosfatasi 2A (PP2A), dimostriamo l'efficienza e la potenza delle analisi non supervisionate di dati di citometria a flusso ad alta dimensione, scoprendo efficacemente le differenze indotte dal trattamento su scala ad alta dimensione.

Introduction

Le cellule T follicolari helper (Tfh) sono un sottogruppo distinto di cellule T helper CD4⁺ essenziali per la formazione e la funzione dei centri germinali (GC) e per la produzione di anticorpi delle cellule B. Le cellule Tfh originano da cellule T CD4⁺ naive attraverso interazioni con cellule presentanti l'antigene e l'integrazione di fattori intrinseci ed estrinseci, tra cui la segnalazione del recettore delle cellule T, le interazioni costimolatorie con le cellule B, le citochine e le chemochine¹. Le cellule Tfh esprimono CXCR5 e PD-1, che guidano la loro posizione all'interno o vicino al GC. BCL-6 è il fattore di trascrizione principale critico per lo sviluppo, il mantenimento e la funzione ^1,2 di Tph. Le cellule Tfh sono fondamentali per l'aumento delle risposte immunitarie umorali, in particolare nelle risposte ai vaccini e nella difesa contro i patogeni batterici e virali. Le risposte anomale delle cellule Tfh sono implicate in vari disturbi, tra cui malattie autoimmuni, immunodeficienza e potenzialmente alcune forme di cancro 3,4,5,6. Comprendere la loro funzione e regolazione è, quindi, importante per lo sviluppo di strategie vaccinali e terapeutiche efficaci⁷.

A differenza di altre cellule T helper CD4⁺ come Th1, Treg e Th17, per le quali i sistemi di differenziazione in vitro sono ben consolidati⁸, le cellule Tfh sono più complesse da studiare perché il loro sviluppo coinvolge interazioni dinamiche cellula-cellula e strutture anatomiche specializzate⁷. Pertanto, gli studi sulle cellule Tfh si sono in gran parte basati sulla fenotipizzazione ex vivo di cellule Tfh circolanti periferiche umane (cTfh) e su modelli murini in vivo . Studiare la regolazione di molecole specifiche sulle cellule Tfh è quindi impegnativo, in particolare per le cellule Tfh umane⁹. Pertanto, uno studio approfondito ex vivo delle cellule Tfh derivate da tessuti linfoidi è essenziale per migliorare la nostra comprensione delle cellule Tfh umane.

Le tonsille, in quanto organi linfoidi secondari, ospitano popolazioni cellulari uniche che non sono presenti nel sangue periferico, come le cellule pre-Tfh (CXCR5^intPD-1^int CD4⁺) e GC-Tfh (CXCR5^hiPD-1^hi CD4⁺), entrambe determinanti nella formazione dei GC. Inoltre, le tonsille palatine sono alcuni dei tessuti più comunemente rimossi negli interventi chirurgici pediatrici e sono facilmente accessibili, il che le rende una preziosa fonte di tessuto umano per esplorare complessi meccanismi immunitari che coinvolgono le cellule Tfh. Poiché si trovano nelle vie aeree superiori, un sito primario per le infezioni virali respiratorie, le tonsille offrono un tessuto vantaggioso per studiare le risposte immunitarie a tali infezioni virali. Ad esempio, il nostro laboratorio ha precedentemente caratterizzato le cellule Tfh nelle tonsille e nelle adenoidi di bambini che erano stati convalescenti da COVID-19 e ha confrontato questi tessuti con quelli di controlli non infetti¹⁰. Qui, descriviamo il nostro protocollo per l'elaborazione e la conservazione delle cellule tonsillari. Utilizzando come esempio le tonsille trattate con inibitori di PP2A, descriviamo in dettaglio come caratterizzare queste cellule attraverso la citometria a flusso spettrale ad alta dimensionalità e analizziamo i dati utilizzando l'analisi non supervisionata.

Protocol

Il Codice Etico dell'Associazione Medica Mondiale (Dichiarazione di Helsinki) è stato seguito in tutta la ricerca sull'uomo in questo studio. I campioni di tonsille umane sono stati ottenuti da pazienti con ipertrofia adenotonsillare che causa disturbi respiratori del sonno o apnea ostruttiva del sonno, provenienti dalla Divisione di Otorinolaringoiatria Pediatrica, Children's National Hospital, Washington, DC, USA. Questo studio ha ricevuto l'approvazione dall'Institutional Review Board (IRB) presso il Children's National Hospital (numero di protocollo IRB 00009806). Il consenso informato è stato firmato dai genitori o dai tutori di tutti i partecipanti arruolati ed è stato ottenuto l'assenso dei partecipanti minorenni di età pari o superiore a 7 anni.

1. Raccolta delle tonsille umane e isolamento e conservazione di singole cellule

1. Isolamento di singole cellule tonsillari
   1. Raccolta di campioni chirurgici
      1. Ottenere le tonsille dai pazienti sottoposti a tonsillectomia e raccogliere i pezzi di tessuto fresco in sala operatoria in una provetta da centrifuga da 50 ml riempita con 25-35 ml di terreno tonsillare sterile ghiacciato: RPMI integrato con il 5% di siero fetale bovino inattivato a caldo (FBS), 0,05 mg/mL di gentamicina, 10 mM di glutammina e miscela antibiotico-antimicotica (100 unità/mL di streptomicina, 100 unità/mL di penicillina, e 0,25 μg/mL di amfotericina B).
         NOTA: Le tonsille nel mezzo di cui sopra possono essere conservate a 4 °C durante la notte e lavorate il giorno successivo. È stata osservata una perdita minima di vitalità cellulare con lo stoccaggio notturno rispetto all'elaborazione in giornata (Figura 1A). Le tonsille possono anche essere spedite durante la notte sul ghiaccio.
   2. Lavorazione delle tonsille
      NOTA: Tutti i terreni, i tamponi e gli strumenti chirurgici devono essere sterili e l'isolamento delle tonsille deve essere eseguito su ghiaccio in una cappa di biosicurezza.
      1. Posizionare le tonsille su una piastra di coltura cellulare di plastica da 60 mm contenente 5 ml di terreno tonsillare raffreddato. Lavora sul ghiaccio. Utilizzando pinzette e forbici sterili o un bisturi, rimuovere con cura eventuali coaguli di sangue visibili, grasso e tessuto connettivo (Figura 1B, C).
      2. Spostare le tonsille in una nuova piastra per colture cellulari da 60 mm con 5 ml di terreno tonsillare ghiacciato. Tagliare i pezzi delle tonsille in frammenti di 3-5 mm.
      3. Preparare una nuova piastra per colture cellulari da 60 mm con 10 ml di terreno tonsillare freddo e posizionare un colino cellulare da 70 μm nella piastra.
      4. Spostare i frammenti di tonsille sul colino e frantumare i frammenti di tonsille utilizzando l'estremità dello stantuffo di una siringa sterile da 3 ml attraverso il colino.
      5. Raccogliere il terreno contenente le cellule all'esterno del colino nella capsula e trasferirlo in una provetta conica da 50 mL.
      6. Aggiungere altri 10 ml di terreno tonsillare al piatto con il colino, schiacciare i frammenti di tonsille con lo stantuffo e raccogliere il terreno nella provetta conica. Per le tonsille grandi, ripetere questo passaggio 2-3 volte fino a quando non rimangono solo frammenti di tessuto connettivo nel colino. Mettere il tessuto rimanente e le piastre usate in un sacchetto per il rischio biologico e nei rifiuti sanitari.
      7. Riempire la provetta conica da 50 ml fino in cima con il terreno tonsillare.
      8. Centrifugare a 400 × g per 5 min a 4 °C.
         NOTA: Prolungare la centrifugazione a 20 minuti può aumentare la resa.
      9. Rimuovere il surnatante aspirando o pipettando con cautela e risospendere il pellet in 5 mL di tampone lisanti ammonio-cloruro-potassio (ACK) a temperatura ambiente (RT) per lisare i globuli rossi. Incubare per 5 minuti a RT, quindi aggiungere 35 ml di PBS refrigerato per prevenire un'ulteriore lisi. Centrifugare a 400 × g per 5 min a 4 °C.
      10. Lavare una volta con 50 ml di PBS refrigerato e centrifugare. Risospendere con 10 mL di PBS e filtrare le cellule attraverso un colino di plastica da 70 μm. Conta le cellule.
2. Crioconservazione delle cellule tonsillari
   1. Preparare il terreno di congelamento (90% FBS inattivato termicamente e 10% dimetilsolfossido (DMSO)).
      NOTA: Questo può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 mese.
   2. Centrifugare la sospensione cellulare (punto 1.1.2.10) a 400 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con il mezzo di congelamento.
      NOTA: Si consiglia di congelare le cellule a una densità di 10 × 10⁶ a 50 × 10⁶ cellule/mL di terreno di congelamento¹¹.
   3. Aliquotare 0,5-1 mL della sospensione cellulare in crioviali sterili. Congelare i flaconcini in contenitori di congelamento a velocità controllata in congelatore a -80 °C. Trasferire le fiale in un serbatoio contenente azoto liquido entro una settimana per la conservazione a lungo termine.
3. Scongelamento delle celle congelate
   NOTA:^{Di seguito è} descritto un approccio di scongelamento per diluizione sequenziale a cui si fa riferimento da un protocollo di preparazione del campione per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Anche altri metodi di scongelamento possono funzionare, ma abbiamo riscontrato una maggiore vitalità cellulare con questo approccio rispetto all'inserimento immediato delle cellule in un tampone di scongelamento caldo (Figura 1D). Il tampone di lavaggio può essere preparato in anticipo. Il tampone di disgelo è composto da tampone di lavaggio più 0,1 mg/mL di DNasi I (la DNasi I deve essere aggiunta appena prima di iniziare lo scongelamento). L'aumento del tempo di centrifugazione a 1 min/mL (per provette da 15 mL) è facoltativo per aumentare la resa cellulare.
   1. Scaldare a bagnomaria a 37 °C. Preriscaldare il tampone di disgelo e lavaggio nel bagnomaria a 37 °C.
      NOTA: Tutti i lavaggi delle celle vengono eseguiti presso RT.
   2. Scongelare i crioviali nel bagnomaria a 37 °C per 2-3 minuti subito dopo averli tolti dal deposito. Evitare di immergere completamente la fiala nel bagnomaria. Rimuovere la fiala dal bagnomaria mentre rimane visibile un piccolo cristallo di ghiaccio.
   3. Trasferire delicatamente le cellule scongelate in una provetta conica da 15 mL utilizzando un puntale per pipetta a foro largo in una cappa di biosicurezza. Sciacquare il crioviale con 0,5 ml di tampone di scongelamento preriscaldato e aggiungere il risciacquo goccia a goccia (1 goccia ogni 5 s) alla provetta conica da 15 mL, agitando delicatamente la provetta per mescolare.
   4. Diluire le cellule in sequenza nella provetta conica da 15 mL aggiungendo in modo incrementale 2 mL e poi 4 mL di terreno con un tempo di attesa di ~1 minuto tra le aggiunte. Aggiungere il terreno alla velocità di 1 mL ogni 3-5 s alla provetta, agitando delicatamente per mescolare.
   5. Centrifugare a 400 × g per 5 minuti a RT.
   6. Rimuovere il surnatante; risospendere il pellet di cella in 300 μL di tampone di scongelamento; e incubare a RT per 5 min.
   7. Aggiungere 10 mL di tampone di lavaggio (senza DNasi I). Centrifugare nuovamente a 400 × g per 5 minuti a RT.
   8. Lavare ancora una volta: rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di tampone di lavaggio. Centrifugare a 400 × g per 5 minuti a RT.
   9. Filtrare le celle attraverso un colino da 70 μm. Centrifugare nuovamente per 5 minuti a 400 × g a RT e contare le cellule. Risospendere nel terreno di coltura.

2. Misura dell'espressione di citochine intracellulari e fattori di trascrizione dopo trattamento ex vivo

NOTA: Qui, descriviamo in dettaglio il nostro metodo per la caratterizzazione fenotipica delle cellule Tfh tonsillari utilizzando due pannelli di citometria a flusso ad alta dimensione. Dato che l'attività di PP2A è essenziale per l'espressione ottimale della proteina BCL-6 e il differenziamento di Tfh⁴, illustriamo la nostra valutazione del mantenimento e della funzionalità delle cellule Tfh attraverso l'esame di cellule tonsiliari trattate con l'inibitore di PP2A cantaridina (CAN).

1. Colorazione citofluorimetrica
   1. Colorazione intracellulare delle citochine
      NOTA: Le incubazioni vengono eseguite al buio. I reagenti, gli anticorpi e le rispettive quantità per pozzetto utilizzati in entrambi i pannelli sono elencati nella Tabella dei materiali. Per valutare la degranulazione delle cellule T, l'anticorpo anti-CD107a viene aggiunto durante la fase di trattamento per ridurre al minimo i risultati falsi negativi causati dalla sua internalizzazione¹³.
      1. La piastra 2 × 10 cellule tonsilari da⁶ con 200 μL di terreno di coltura (1 × 10⁷ cellule/mL) in un pozzetto di fondo a 96 pozzetti con le seguenti quantità di inibitore PP2A CAN per 16 ore: controllo del veicolo, 3 μM e 6 μM.
         NOTA: Il CAN è stato ricostituito a 0,1 M con l'1% di DMSO.
      2. Aggiungere monensina (0,7 μL/mL), brefeldina (1:1.000), forbolo miristato acetato (50 ng/mL, PMA), ionomicina (1.000 ng/mL) e 2 μL di anti-CD107a a ciascun pozzetto per 2,5 ore in incubatore al 5% di CO₂ a 37 ^oC. Il volume totale della coltura è di 200 μL per pozzetto.
      3. Centrifugare gli anticorpi di colorazione a ~16.000 × g per 3-5 minuti a 4 °C per rimuovere gli aggregati di anticorpi. Preparare la miscela di anticorpi di superficie per il passaggio 2.1.1.8, che include tutti gli anticorpi di superficie ad eccezione dei recettori delle chemochine, del tampone colorante brillante Plus e del tampone FACS (volume di ciascuno annotato nella tabella dei materiali, totale 112 μl di miscela per reazione).
      4. Dopo aver completato 2,5 ore di coltura, lavare le cellule 2 volte con 200 μL di PBS ghiacciato centrifugando a 400 × g per 2 minuti a 4 °C. Tra un lavaggio e l'altro, scartare il surnatante capovolgendo rapidamente la piastra. Eseguire la colorazione nella stessa piastra.
      5. Incubare le cellule in 100 μL/pozzetto di colorante blu VIVO/MORTO diluito 1:800 in PBS per 15 minuti a RT. Lavare 2 volte con 200 μL di tampone FACS.
      6. Risospendere le cellule con True Stain Monocyte Blocker (5 μL di bloccante dei monociti + 45 μL di tampone FACS per pozzetto) per 5 minuti a RT.
      7. Aggiungere in sequenza gli anticorpi del recettore delle chemochine direttamente alla reazione di colorazione (prima, anti-CXCR3 e anti-CCR7 per 10 minuti ciascuno, seguiti da un mix di anti-CXCR5 e anti-CCR6 insieme a 10 μL di Brilliant Stain Buffer Plus per 5 minuti a RT). Mescolare bene dopo ogni aggiunta pipettando su e giù più volte. Vedere la Tabella dei materiali per i volumi degli anticorpi.
      8. Aggiungere la miscela di anticorpi di superficie preparata al punto 2.1.1.3 direttamente alla reazione di colorazione e incubare per 30 minuti a RT. Il volume totale di colorazione per reazione è di 180 μL: 50 μL di bloccante dei monociti in tampone (vedere il passaggio 2.1.1.6) + 18 μL di anticorpi anti-recettore delle chemochine (vedere il passaggio 2.1.1.7) + 112 μL di miscela di anticorpi di superficie (vedere il passaggio 2.1.1.3).
      9. Lavare 2 volte con 200 μL di tampone FACS freddo.
      10. Risospendere le cellule e incubare con 80 μL/pozzetto di tampone di fissazione a base di paraformaldeide a RT per 20 minuti.
      11. Aggiungere 160 μl di tampone di permeabilizzazione 1x a ciascun pozzetto, che contiene già un tampone di fissazione. Centrifugare la piastra a 400 × g per 2 minuti a RT e lavare 1 volta con 200 μl di tampone di permeabilizzazione.
      12. Preparare una miscela di anticorpi per citochine intracellulari (ICS), che include anticorpi anti-citochine, Brilliant Stain Buffer Plus e tampone di permeabilizzazione (volume totale 50 μL/pozzetto, Tabella dei materiali). Incubare le cellule con questa miscela di anticorpi intracellulari di citochine a RT per 30 minuti.
      13. Lavare 2 volte con 200 μL/tampone di permeabilizzazione. Risospendere con 200 μL/pozzetto di tampone FACS.
      14. Conservare le cellule colorate a 4 °C al buio e acquisire i dati su un citometro a flusso spettrale entro 24 ore per ridurre al minimo la perdita di intensità di colorazione¹⁴.
   2. Colorazione del fattore di trascrizione nucleare
      1. Coltivare le cellule con CAN come al punto 2.1.1.1 (senza stimolare le cellule).
      2. Aggiungere l'anticorpo anti-umano CD40 (0,5 μg/mL) al terreno di coltura e coltivare con le cellule per 15 minuti prima di iniziare la colorazione. Se le cellule sono stimolate, aggiungere questo anticorpo 15 minuti prima di iniziare la stimolazione per prevenire l'internalizzazione di CD40L all'attivazione ^15,16.
      3. Centrifugare gli anticorpi di colorazione e preparare la miscela di anticorpi di superficie in modo simile al passaggio 2.1.1.3: anticorpi di superficie nella tabella dei materiali, 10 μl/pozzetto di Brilliant Stain Buffer Plus e 54,1 μl/pozzetto di tampone FACS.
         NOTA: Il volume totale di colorazione per pozzetto è di 180 μL: 50 μL di bloccante dei monociti nel tampone + 13 μL di anticorpi del recettore delle chemochine + 117 μL di miscela di anticorpi di superficie.
      4. Lavare le celle ed eseguire la colorazione LIVE/DEAD Blue e la colorazione superficiale e i lavaggi come nei passaggi 2.1.1.5-2.1.1.8.
         NOTA: L'anticorpo anti-CXCR3 non è incluso in questo pannello.
      5. Fissare le cellule con 80 μL di tampone di fissazione del fattore di trascrizione nucleare da FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set. Incubare per 30 minuti a RT.
      6. Lavare le celle con tampone di permeabilizzazione come al punto 2.1.1.11.
      7. Preparare la miscela di anticorpi contro il fattore di trascrizione intracellulare (TF), che include gli anticorpi anti-fattore di trascrizione elencati nella Tabella dei materiali, 10 μl di Brilliant Stain Buffer Plus e 16 μl di tampone di permeabilizzazione (volume totale 40 μl/pozzetto). Incubare le cellule con questa miscela per 1 ora a 4 °C.
      8. Lavare e acquisire su un citometro spettrale come nei passaggi 2.1.1.13-2.1.1.14.

3. Analisi non supervisionata di dati di citometria a flusso ad alta dimensione

NOTA: Il software, i pacchetti e le relative versioni utilizzati per l'analisi sono elencati nella Tabella dei materiali. Le schermate dei passaggi da 3.2 a 3.4 si trovano nel file supplementare 1. Gli script di esempio dai passaggi da 3.5 a 3.7 si trovano nelfile 2 upplemental S e nel file supplementare 3, mentre i passaggi da 3.8 a 3.9 si trovano nel file supplementare 4 e nel file supplementare 5. I file non elaborati ICS e i file non elaborati TF per gli script sono forniti rispettivamente nel file supplementare 6 e nel file supplementare 7.

1. Aprire l'area di lavoro del software di analisi della citometria a flusso in cui sono memorizzati i file ".fcs" e completare il gating come mostrato nella Figura 1E.
2. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nodo di destinazione (in questo caso le cellule T CD4⁺ ). Scegliere Seleziona nodi equivalenti.
3. Fare nuovamente clic con il pulsante destro del mouse sul nodo di destinazione. Selezionare Esporta/Concatena popolazioni.
4. Attendi l'apertura della finestra Popolazioni: Esporta o Concatena, scegli i valori del canale CSV e scegli la destinazione per i file esportati. Includi tutte le celle nella casella Includi eventi e seleziona Tutti i parametri compensati nella casella Parametri . Espandere Opzioni avanzate, digitare un prefisso per rinominare i file e fare clic su Esporta per esportare i file nella cartella di destinazione (esportare un file .csv per ogni campione).
5. Leggere i file "*.csv" esportati con R (uno per ogni campione). Assegna un ID campione a ogni cella e combina le celle di tutti i campioni in un unico frame di dati.
6. Aggiungere o unire i metadati (informazioni aggiuntive sui campioni) nel frame di dati.
7. Sottocampionare in modo casuale un numero uguale di cellule per campione per l'analisi successiva. Questo passaggio è facoltativo.
   NOTA: In questo esempio, 8.000 cellule T CD4⁺ sono state sottocampionate dal totale delle cellule T CD4⁺ di ciascuna condizione, che rappresentano almeno 1/7 del numero totale di cellule T CD4⁺ .
8. Crea oggetto Seurat: interpreta i valori del canale per i marcatori anticorpali come livelli di espressione genica durante la creazione di un oggetto Seurat.
   1. Creare l'oggetto Seurat con il frame di dati generato dal passaggio 3.6. Salta il passaggio NormalizeData e salvali direttamente come test "dati".
   2. Selezionare gli indicatori di superficie dal pannello di flusso da utilizzare come VariableFeatures nel clustering non supervisionato.
   3. Eseguire ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP come pipeline standard introdotta da Seurat, ad eccezione del passaggio 17 di NormalizeData.
   4. Regolare il parametro resolution nel passaggio FindClusters per modificare il numero di cluster, assicurandosi che riflettano in modo più accurato il contesto biologico sottostante.
9. Utilizza strumenti di visualizzazione come DimPlot e FeaturePlot compatibili con il pacchetto Seurat. Per confrontare i gruppi che contengono più campioni per gruppo, calcolare la percentuale di ciascun cluster in base all'argomento ed eseguire confronti statistici. Successivamente, utilizzare modelli matematici per analisi statistiche più sofisticate¹⁰.

Results

Per confrontare la vitalità cellulare complessiva, abbiamo tagliato la tonsilla in tre pezzi simili e li abbiamo lavorati utilizzando il nostro protocollo in tre condizioni: (1) lavorazione in giornata, (2) conservazione notturna a 4 °C e (3) conservazione notturna su ghiaccio. La vitalità tra queste tre condizioni era abbastanza simile senza alcuna differenza significativa (Figura 1A). Abbiamo anche valutato l'impatto del processo di scongelamento sulla vitalità delle cellule. Il metodo di ...

Discussion

In contrasto con i precedenti rapporti secondo cui le tonsille fresche dovrebbero essere trattate entro 3 ore dall'intervento^{chirurgico 19}, abbiamo scoperto che i campioni di tonsille freschi potrebbero mantenere la loro vitalità se conservati a 4 °C e lavorati entro 24 ore. Per ottimizzare la vitalità cellulare dal tessuto tonsillare dopo lo scongelamento dallo stoccaggio di azoto liquido, abbiamo adottato il metodo di scongelamento a goccia raccomandato nel sequ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Macchine e strumenti
mL Siringa in plastica	BD	309657
96 pozzetti U Piastra inferiore	Thermo Scientific	163320
1,2 mL Fiale criogeniche	Corning	430487
Filtro cellulare 70 &; m Nylon	Falcon	352350
Piatto per colture cellulari (60 mm)	VWR	10062-890
Centrifuga	Thermo Scientific	Sorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L Bagno d'acqua digitale	Benchmark	B2000-2
Forbici fini - Sharp	F.S.T	14060-11
Valigette per strumenti in plastica	F.S.T	20830-05
Citometro a flusso spettrale, Aurora	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Forcipe modello standard	FST	11000-13
Forcipe modello standard	FST	11000-20
Vi-cell Analizzatore di vitalità cellulare Blu	Beckman Coulter	C19201
Reagenti
0,5 M EDTA pH 8.0	Qualità Biologia	351-027-101
2-Mercaptoetanolo	Gibco	21985-023
ACK tampone di lisi	Gibco	A10492-01
Miscela antibiotico-antimicotica (Penicillina-Streptomicina-Amfotericina B Sospensione, 100x)	Gibco	15240-062
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385
Cantharidin	Sigma	C7632-25MG
Cytofix Fixation Buffer	BD	554655
Dimethyl Sulphoxide (DMSO)	Sigma	D8418-250ml
DNAase I	Roche	10104159001
Fetale Siero bovino (FBS)	VWR	97068-085
FoxP3/Set di tamponi per colorazione del fattore di trascrizione	eBioscience	00-5523-00
Gentamicina (50 mg/mL)	Gibco	15750-060
Golgiplug	BD	555029
GolgiSTOP	BD	554724
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Ionomicina	Sigma	I0634-1mg
L-Glutammina (200 mM)	Gibco	25030-081
MEM NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Soluzione di paraformaldeide al 16%, grado EM (PFA)	Microscopia elettronica   Science	15710	Diluire con PBS
PBS, pH 7,4	Gibco	10010072
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140-122
Phorbol 12-Myristate 13-Acetato (PMA)	Sigma	P8139-1mg
Contenitori per congelamento a velocità controllata	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI (+L-Glutammina)	Gibco	11875-085
Piruvato di sodio (100 mM)	Gibco	11360-070
Bloccante dei monociti a vera macchia	BioLegend	426103
Tamponi
Terreno			10% FBS (VWR) inattivato a caldo, 2 nM glutammina, 0,055 mM 2-mercaptoetanolo, 1% penicillina/ streptomicina, 1 mM di piruvato di sodio, 10 mM di HEPES, 1% di aminoacidi non essenziali in RPMI (+L-Glutammina)
Tampone			2 mM EDTA e 2% FBS inattivato a caldo in PBS
Mezzo			90% FBS inattivato a caldo e 10% DMSO Tampone
		di disgelo	Tampone di lavaggio + 0,1 mg/mL DNaseI
Tonsilla			RPMI integrato con FBS inattivato al calore al 5%, 10 mM di glutammina, 0,05 mg/mL di gentamicina, miscela antibiotico-antimicotica all'1% (penicillina, streptomicina e amfotericina B).
Tampone			RPMI (+L-Glutammina) integrato con FBS inattivato termicamente al 10% e 10 mM di HEPES
Anticorpi e altri reggenti per il pannello delle citochine...
Biotina anti-umano CD107a (LAMP-1) Anticorpo	BioLegend	328604	2 μ L in 200 μ L terreno di coltura completo per pozzetto. Questo anticorpo è stato aggiunto alle cellule durante la stimolazione con PMA/ioomicina.
Colorazione Live Dead	100 μ L miscela per pozzetto
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0,125 μ L in 100 μ L PBS per pozzo.
Blocco di monociti	50 μ L miscela per pozzetto
tampone bloccante dei monociti	BioLegend	426103	5 μ L True Stain bloccante monociti e 45 μ L tampone FACS per anticorpi well
Surface per il pannello
di recettori per chemochine			L/pozzo
Anti-umano CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Anti-umano CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anti-umano CXCR3-PE-Cy5	BD	551128	5
Anti-umano CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
	18 μ L miscela per pozzetto per i recettori delle chemochine; Aggiungere diretto alle cellule con il tampone
Miscela di altri anticorpi di superficie			μ L/pozzo
Anti-umano CD103-BUV661	BD		749993 2.5
Anti-umano CD14-Spark Blue 550	BioLegend		367148 2.5
Anti-umano CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anti-umano CD25-BB515	BD	564467	10
Anti-umano CD27- Super Bright 436	Thermo	62-0279-42	5
Anti-umano CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Anti-umano CD38 APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anti-umano CD4 CF YG584	Cytek	R7-20041	2.5
Anti-umano CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
Anti-umano CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anti-umano CD57-FITC	BioLegend	359604	1.2
Anti-umano CD69-BUV563	BD	748764	1
Anti-umano CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anti-umano FAS-BB700	BD	566542	0.6
Anti-umano HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-umano PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-umano-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
FACS buffer			61
			112 μ L miscela per pozzetto per altri anticorpi di superficie; Aggiungere direttamente al tampone di blocco dei monociti (50 μ L) e il mix di recettori per le chemochine (18 μ L, 50+18+112 = 180 μ L in totale per pozzetto)
Anticorpi intracellulari contro le citochine per pannello di citochine			μ L/pozzo
Anti-umano Granzyme B-PE	BD		561142 1
Anti-umano IL10-PE-Dazzle 594	BioLegend		506812 1
Anti-umano IL17A-BV605	BioLegend	512326	1
Anti-umano IL2-BV650	BioLegend	500334	3
Anti-umano IL21- Alexa Fluor 647	BD	560493	10
Anti-umano IL4-PerCP Cy5.5	BD	561234	1
Anti-umano Perforin-APC	BioLegend	353312	2.5
Anti-umano TNFa-PE-Cy7	BioLegend	502930	0.1
Anti-IFNγ-Pacific Blue	BioLegend	502522	1
SAv-BUV615	BD	613013	0.25
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
1x tampone di permeabilizzazione	eBioscience	00-5523-00	19.15
	(50 μ L miscela per pozzetto)
Anticorpi e altri reggenti per il fattore di trascrizione panel
CD40 Antibody, anti-umano	Miltenyi Biotec	130-094-133	0,5 μ g/mL di terreno di coltura per la concentrazione di lavoro
colorazione Live Dead	100 μ L miscela per pozzetto
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0,125 μ L in 100 μ L PBS per pozzo.
tampone bloccante monociti	BioLegend	426103	5 μ L True Stain bloccante monociti e 45 μ L tampone FACS per anticorpi well
Surface per il fattore di trascrizione panel
Chemokine receptors mix			μ L/pozzo
Anti-umano CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Anti-umano CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anti-umano CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
	13 μ L miscela per pozzetto
Altra miscela di anticorpi di superficie			μ L/pozzo
Anti-umano 4-1BB-PE-CY7	BioLegend		309818 2.5
Anti-umano CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
Anti-umano CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anti-umano CD200-PerCP-eFluor 710	ThermoFisher	46-9200-42	2.5
Anti-umano CD25-PE-Cy5	BioLegend	302608	5
Anti-umano CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Anti-umano CD38-APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anti-umano CD4-Pacific Blue	BioLegend	317423	1
Anti-umano CD40L-PE	BD		557299 15
Anti-umano CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
Anti-umano CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anti-umano CD69-BUV650	BioLegend	310934	2.5
Anti-umano CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anti-umano HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-umano ICOS-BUV563	BD	741421	1.2
Anti-umano OX40-APC	BioLegend	350008	5
Anti-umano PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-umano-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
FACS tampone			54.1
			117  μ L miscela per pozzetto per altri anticorpi di superficie; Aggiungi direttamente al blocco di monociti  tampone (50 μ L) e il mix di recettori delle chemochine (13 μ L, 50+13+117 = 180 μ L in totale per pozzetto)
Anticorpi del fattore di trascrizione per il pannello del fattore di trascrizione	μ L/pozzo
Anti-umano T-bet-BV605	BioLegend	644817	4
Anti-umano Bcl6-PE-CF594	BD	562401	4
Anti-umano FoxP3-Alexa Fluor 488	BD	560887	1.6
Anti-umano GATA3-BB700	BD	566642	2
Anti-umano Ki67-Alexa Fluor 700	BD	561277	0.4
Anti-umano Rorgt-Alexa Fluor 647	BD	563620	2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
1 x Tampone di permeabilizzazione	eBioscience	00-5523-00	16
			40 μ L mix per well
Software e pacchetti per analisi non supervisionate
	Software/package	Version	Source
1	data.table	1.16.2	La rete completa di archiviazione R
2	FlowJO	10.9.0	Becton, Dickinson and Company
3	pheatmap	1.0.12	La rete completa di archivi R
4	R	4.3.2	La rete completa di archivi R
5	readxl	1.4.3	La rete completa di archivi R
6	Rstudio	2023.12.1+402	Posit PBC
7	Seurat	5.1.0	La rete completa di archivi R
8	SeuratData	0.2.2.9001	La rete completa di archiviazione R
9	SpectroFlo	3.0	Cytek
10	tidyverse	2.0.0	La rete completa di archiviazione R
11	viridis	0.6.5	La rete completa di archiviazione R