Elaborazione efficiente delle cellule helper follicolari T tonsillari e analisi funzionale attraverso la citometria a flusso ad alta dimensione

Summary

Qui presentiamo un protocollo per la raccolta e l'elaborazione di campioni di tonsilla, la fenotipizzazione utilizzando la citometria a flusso spettrale ad alta dimensionalità e l'esecuzione di analisi non supervisionate.

Abstract

Le cellule T follicolari helper (Tfh) sono un sottoinsieme di cellule T helper CD4⁺ che aiutano nella commutazione dell'isotipo delle cellule B, nella formazione del centro germinale (GC), nell'ipermutazione somatica e nella maturazione dell'affinità, aiutando così a orchestrare le risposte immunitarie umorali adattative nei tessuti linfoidi secondari durante l'infezione, l'autoimmunità e la vaccinazione. Comprendere lo sviluppo e la funzione delle cellule Tfh è fondamentale per la progettazione di vaccini efficaci e lo sviluppo di strategie di trattamento mirate per le malattie che coinvolgono questa popolazione. Le cellule tonsillari umane sono organi linfoidi mucosi accessibili. Offrono un'opportunità unica per profilare popolazioni immunitarie distinte come le cellule Tfh e GC, interrogare le interazioni cellula-cellula, valutare le funzioni cellulari dinamiche e scoprire i loro meccanismi di regolazione a livello di organo. Inoltre, le colture in vitro di cellule tonsillari sono semplici da elaborare e consentono la valutazione della biologia cellulare Tfh in varie condizioni. Qui, introduciamo un protocollo per la raccolta, l'isolamento, la conservazione e la coltura delle cellule tonsilari umane. Descriviamo anche due pannelli di citometria a flusso spettrale ottimizzati progettati per la caratterizzazione approfondita delle cellule Tfh. Infine, utilizzando come esempio un trattamento con inibitore della proteina fosfatasi 2A (PP2A), dimostriamo l'efficienza e la potenza delle analisi non supervisionate di dati di citometria a flusso ad alta dimensione, scoprendo efficacemente le differenze indotte dal trattamento su scala ad alta dimensione.

Introduction

Le cellule T follicolari helper (Tfh) sono un sottogruppo distinto di cellule T helper CD4⁺ essenziali per la formazione e la funzione dei centri germinali (GC) e per la produzione di anticorpi delle cellule B. Le cellule Tfh originano da cellule T CD4⁺ naive attraverso interazioni con cellule presentanti l'antigene e l'integrazione di fattori intrinseci ed estrinseci, tra cui la segnalazione del recettore delle cellule T, le interazioni costimolatorie con le cellule B, le citochine e le chemochine¹. Le cellule Tfh esprimono CXCR5 e PD-1, che guidano la loro posizione all'interno o vicino ....

Protocol

Il Codice Etico dell'Associazione Medica Mondiale (Dichiarazione di Helsinki) è stato seguito in tutta la ricerca sull'uomo in questo studio. I campioni di tonsille umane sono stati ottenuti da pazienti con ipertrofia adenotonsillare che causa disturbi respiratori del sonno o apnea ostruttiva del sonno, provenienti dalla Divisione di Otorinolaringoiatria Pediatrica, Children's National Hospital, Washington, DC, USA. Questo studio ha ricevuto l'approvazione dall'Institutional Review Board (IRB) presso il Children's National Hospital (numero di protocollo IRB 00009806). Il consenso informato è stato firmato dai genitori o dai tutori di ....

Results

Per confrontare la vitalità cellulare complessiva, abbiamo tagliato la tonsilla in tre pezzi simili e li abbiamo lavorati utilizzando il nostro protocollo in tre condizioni: (1) lavorazione in giornata, (2) conservazione notturna a 4 °C e (3) conservazione notturna su ghiaccio. La vitalità tra queste tre condizioni era abbastanza simile senza alcuna differenza significativa (Figura 1A). Abbiamo anche valutato l'impatto del processo di scongelamento sulla vitalità delle cellule. Il metodo di .......

Discussion

In contrasto con i precedenti rapporti secondo cui le tonsille fresche dovrebbero essere trattate entro 3 ore dall'intervento^{chirurgico 19}, abbiamo scoperto che i campioni di tonsille freschi potrebbero mantenere la loro vitalità se conservati a 4 °C e lavorati entro 24 ore. Per ottimizzare la vitalità cellulare dal tessuto tonsillare dopo lo scongelamento dallo stoccaggio di azoto liquido, abbiamo adottato il metodo di scongelamento a goccia raccomandato nel sequ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Macchine e strumenti
mL Siringa in plastica	BD	309657
96 pozzetti U Piastra inferiore	Thermo Scientific	163320
1,2 mL Fiale criogeniche	Corning	430487
Filtro cellulare 70 &; m Nylon	Falcon	352350
Piatto per colture cellulari (60 mm)	VWR	10062-890
Centrifuga	Thermo Scientific	Sorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L Bagno d'acqua digitale	Benchmark	B2000-2
Forbici fini - Sharp	F.S.T	14060-11
Valigette per strumenti in plastica	F.S.T	20830-05
Citometro a flusso spettrale, Aurora	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Forcipe modello standard	FST	11000-13
Forcipe modello standard	FST	11000-20
Vi-cell Analizzatore di vitalità cellulare Blu	Beckman Coulter	C19201
Reagenti
0,5 M EDTA pH 8.0	Qualità Biologia	351-027-101
2-Mercaptoetanolo	Gibco	21985-023
ACK tampone di lisi	Gibco	A10492-01
Miscela antibiotico-antimicotica (Penicillina-Streptomicina-Amfotericina B Sospensione, 100x)	Gibco	15240-062
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385
Cantharidin	Sigma	C7632-25MG
Cytofix Fixation Buffer	BD	554655
Dimethyl Sulphoxide (DMSO)	Sigma	D8418-250ml
DNAase I	Roche	10104159001
Fetale Siero bovino (FBS)	VWR	97068-085
FoxP3/Set di tamponi per colorazione del fattore di trascrizione	eBioscience	00-5523-00
Gentamicina (50 mg/mL)	Gibco	15750-060
Golgiplug	BD	555029
GolgiSTOP	BD	554724
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Ionomicina	Sigma	I0634-1mg
L-Glutammina (200 mM)	Gibco	25030-081
MEM NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Soluzione di paraformaldeide al 16%, grado EM (PFA)	Microscopia elettronica   Science	15710	Diluire con PBS
PBS, pH 7,4	Gibco	10010072
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140-122
Phorbol 12-Myristate 13-Acetato (PMA)	Sigma	P8139-1mg
Contenitori per congelamento a velocità controllata	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI (+L-Glutammina)	Gibco	11875-085
Piruvato di sodio (100 mM)	Gibco	11360-070
Bloccante dei monociti a vera macchia	BioLegend	426103
Tamponi
Terreno			10% FBS (VWR) inattivato a caldo, 2 nM glutammina, 0,055 mM 2-mercaptoetanolo, 1% penicillina/ streptomicina, 1 mM di piruvato di sodio, 10 mM di HEPES, 1% di aminoacidi non essenziali in RPMI (+L-Glutammina)
Tampone			2 mM EDTA e 2% FBS inattivato a caldo in PBS
Mezzo			90% FBS inattivato a caldo e 10% DMSO Tampone
		di disgelo	Tampone di lavaggio + 0,1 mg/mL DNaseI
Tonsilla			RPMI integrato con FBS inattivato al calore al 5%, 10 mM di glutammina, 0,05 mg/mL di gentamicina, miscela antibiotico-antimicotica all'1% (penicillina, streptomicina e amfotericina B).
Tampone			RPMI (+L-Glutammina) integrato con FBS inattivato termicamente al 10% e 10 mM di HEPES
Anticorpi e altri reggenti per il pannello delle citochine...
Biotina anti-umano CD107a (LAMP-1) Anticorpo	BioLegend	328604	2 μ L in 200 μ L terreno di coltura completo per pozzetto. Questo anticorpo è stato aggiunto alle cellule durante la stimolazione con PMA/ioomicina.
Colorazione Live Dead	100 μ L miscela per pozzetto
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0,125 μ L in 100 μ L PBS per pozzo.
Blocco di monociti	50 μ L miscela per pozzetto
tampone bloccante dei monociti	BioLegend	426103	5 μ L True Stain bloccante monociti e 45 μ L tampone FACS per anticorpi well
Surface per il pannello
di recettori per chemochine			L/pozzo
Anti-umano CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Anti-umano CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anti-umano CXCR3-PE-Cy5	BD	551128	5
Anti-umano CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
	18 μ L miscela per pozzetto per i recettori delle chemochine; Aggiungere diretto alle cellule con il tampone
Miscela di altri anticorpi di superficie			μ L/pozzo
Anti-umano CD103-BUV661	BD		749993 2.5
Anti-umano CD14-Spark Blue 550	BioLegend		367148 2.5
Anti-umano CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anti-umano CD25-BB515	BD	564467	10
Anti-umano CD27- Super Bright 436	Thermo	62-0279-42	5
Anti-umano CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Anti-umano CD38 APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anti-umano CD4 CF YG584	Cytek	R7-20041	2.5
Anti-umano CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
Anti-umano CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anti-umano CD57-FITC	BioLegend	359604	1.2
Anti-umano CD69-BUV563	BD	748764	1
Anti-umano CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anti-umano FAS-BB700	BD	566542	0.6
Anti-umano HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-umano PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-umano-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
FACS buffer			61
			112 μ L miscela per pozzetto per altri anticorpi di superficie; Aggiungere direttamente al tampone di blocco dei monociti (50 μ L) e il mix di recettori per le chemochine (18 μ L, 50+18+112 = 180 μ L in totale per pozzetto)
Anticorpi intracellulari contro le citochine per pannello di citochine			μ L/pozzo
Anti-umano Granzyme B-PE	BD		561142 1
Anti-umano IL10-PE-Dazzle 594	BioLegend		506812 1
Anti-umano IL17A-BV605	BioLegend	512326	1
Anti-umano IL2-BV650	BioLegend	500334	3
Anti-umano IL21- Alexa Fluor 647	BD	560493	10
Anti-umano IL4-PerCP Cy5.5	BD	561234	1
Anti-umano Perforin-APC	BioLegend	353312	2.5
Anti-umano TNFa-PE-Cy7	BioLegend	502930	0.1
Anti-IFNγ-Pacific Blue	BioLegend	502522	1
SAv-BUV615	BD	613013	0.25
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
1x tampone di permeabilizzazione	eBioscience	00-5523-00	19.15
	(50 μ L miscela per pozzetto)
Anticorpi e altri reggenti per il fattore di trascrizione panel
CD40 Antibody, anti-umano	Miltenyi Biotec	130-094-133	0,5 μ g/mL di terreno di coltura per la concentrazione di lavoro
colorazione Live Dead	100 μ L miscela per pozzetto
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1 : 800, 0,125 μ L in 100 μ L PBS per pozzo.
tampone bloccante monociti	BioLegend	426103	5 μ L True Stain bloccante monociti e 45 μ L tampone FACS per anticorpi well
Surface per il fattore di trascrizione panel
Chemokine receptors mix			μ L/pozzo
Anti-umano CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Anti-umano CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anti-umano CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
	13 μ L miscela per pozzetto
Altra miscela di anticorpi di superficie			μ L/pozzo
Anti-umano 4-1BB-PE-CY7	BioLegend		309818 2.5
Anti-umano CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
Anti-umano CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anti-umano CD200-PerCP-eFluor 710	ThermoFisher	46-9200-42	2.5
Anti-umano CD25-PE-Cy5	BioLegend	302608	5
Anti-umano CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Anti-umano CD38-APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anti-umano CD4-Pacific Blue	BioLegend	317423	1
Anti-umano CD40L-PE	BD		557299 15
Anti-umano CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
Anti-umano CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anti-umano CD69-BUV650	BioLegend	310934	2.5
Anti-umano CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anti-umano HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-umano ICOS-BUV563	BD	741421	1.2
Anti-umano OX40-APC	BioLegend	350008	5
Anti-umano PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-umano-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
FACS tampone			54.1
			117  μ L miscela per pozzetto per altri anticorpi di superficie; Aggiungi direttamente al blocco di monociti  tampone (50 μ L) e il mix di recettori delle chemochine (13 μ L, 50+13+117 = 180 μ L in totale per pozzetto)
Anticorpi del fattore di trascrizione per il pannello del fattore di trascrizione	μ L/pozzo
Anti-umano T-bet-BV605	BioLegend	644817	4
Anti-umano Bcl6-PE-CF594	BD	562401	4
Anti-umano FoxP3-Alexa Fluor 488	BD	560887	1.6
Anti-umano GATA3-BB700	BD	566642	2
Anti-umano Ki67-Alexa Fluor 700	BD	561277	0.4
Anti-umano Rorgt-Alexa Fluor 647	BD	563620	2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
1 x Tampone di permeabilizzazione	eBioscience	00-5523-00	16
			40 μ L mix per well
Software e pacchetti per analisi non supervisionate
	Software/package	Version	Source
1	data.table	1.16.2	La rete completa di archiviazione R
2	FlowJO	10.9.0	Becton, Dickinson and Company
3	pheatmap	1.0.12	La rete completa di archivi R
4	R	4.3.2	La rete completa di archivi R
5	readxl	1.4.3	La rete completa di archivi R
6	Rstudio	2023.12.1+402	Posit PBC
7	Seurat	5.1.0	La rete completa di archivi R
8	SeuratData	0.2.2.9001	La rete completa di archiviazione R
9	SpectroFlo	3.0	Cytek
10	tidyverse	2.0.0	La rete completa di archiviazione R
11	viridis	0.6.5	La rete completa di archiviazione R