Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro semplificato per generare e testare cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano (CAR Tregs).
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Articolo metodologico
Generazione di cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
La terapia con cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) ha rimodellato il volto del trattamento del cancro, portando a tassi di remissione record in tumori ematologici precedentemente incurabili. Questi successi hanno stimolato l'interesse nell'adattare la piattaforma CAR a un piccolo ma fondamentale sottogruppo di cellule T CD4+ principalmente responsabili della regolazione e dell'inibizione della risposta immunitaria, le cellule T regolatorie (Treg). La capacità di reindirizzare l'attività immunosoppressiva delle Treg a qualsiasi bersaglio extracellulare ha enormi implicazioni per la creazione di terapie cellulari per le malattie autoimmuni, il rigetto del trapianto d'organo e la malattia del trapianto contro l'ospite. Qui, descriviamo in dettaglio le metodologie per l'isolamento in buona fede delle Treg dal sangue periferico umano, la modificazione genetica delle Treg umane utilizzando lentivirus o knock-in assistito da CRISPR/Cas9 utilizzando la somministrazione di modelli di riparazione diretta omologa (HDR) mediata da virus adeno-associati e l'espansione ex vivo di Treg CAR umane stabili. Infine, descriviamo la valutazione della stabilità fenotipica delle Treg CAR umane e della funzione soppressiva in vitro , che fornisce informazioni su come si comporteranno le Treg CAR umane in applicazioni precliniche e cliniche.
Introduzione
Le terapie con cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) hanno rivoluzionato il trattamento delle neoplasie ematologiche, raggiungendo tassi di remissione notevolmente elevati in tumori precedentemente non trattabili 1,2. I primi risultati incoraggianti dell'utilizzo delle cellule T CAR per il trattamento del glioblastoma 3,4,5 evidenziano la versatilità della tecnologia CAR e il potenziale futuro per colpire un'ampia gamma di neoplasie. Mentre il campo esplora ulteriori a....
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Protocollo
1. Isolamento delle Treg umane
- Lavorazione di Leukopak
- Trasferire il contenuto del leucopak in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere un volume uguale di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (DPBS) +2% di siero fetale bovino (FBS) di Dulbco mescolando delicatamente con una pipetta.
- Centrifugare a 300 × g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Aspirare con cura il surnatante. Ricostituire il pellet cellulare in 2 mL di DPBS + 2% FBS. Aggiungere 8 mL di soluzione di cloruro di ammonio mediante pipetta alla sospensione cellulare in rapporto 4:1, mescolare per leggera inversione e lasciare la lisi dei....
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Risultati
Il protocollo qui descritto fornisce una pipeline semplificata e standardizzata per valutare nuovi costrutti di recettori chimerici dell'antigene (CAR) nelle cellule T regolatorie umane (Treg), con l'obiettivo di creare terapie viventi per le malattie autoimmuni, la malattia del trapianto contro l'ospite, il rigetto del trapianto d'organo e l'allergia. La Figura 1 illustra come otteniamo Treg umane altamente pure dal sangue periferico utilizzando FACS (Figura 1A.......
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Discussione
Questo protocollo fornisce una metodologia semplificata e completa per la generazione e la valutazione delle cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano (CAR Tregs). Il successo della tecnologia CAR nel trattamento dei tumori ematologici ha ispirato la sua applicazione al sottogruppo immunosoppressivo delle cellule T, le Treg. A differenza delle cellule T convenzionali, le Treg inibiscono le risposte immunitarie, offrendo potenziali trattamenti per le condizioni der.......
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Dichiarazioni
LMRF è un inventore e ha ricevuto royalties da brevetti su cellule immunitarie ingegnerizzate e fornisce consulenza per Guidepoint Global e McKesson. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
LMRF è finanziato dalla Human Islet Research Network (HIRN) Emerging Leader in Type 1 Diabetes grant U24DK104162-07, dall'American Cancer Society (ACS) Institutional Research Grant IRG-19-137-20, dal South Carolina Clinical and Translational Research (SCTR) Pilot Project Discovery Grant 1TL1TR001451-01, dal Diabetes Research Connection (DRC) Grant IPF 22-1224 e dal Swim Across America Grant 23-1579. RWC è supportato dalla borsa di studio per la formazione in Scienze Cellulari, Biochimiche e Molecolari T32GM132055 e dalla borsa di studio per laureati Lowvelo dell'Hollings Cancer Center. Questo studio è stato supportato in parte dalla F....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Virus adeno-associato ( AAV) | Charles River Laboratories | ||
| CAR che esprimono il bersaglio delle cellule | ad es. CD19-K562 | ||
| Cesio-137 Irradiatore | |||
| Anti-umano CD8 PerCP (clone SK1) | Biolegend | 344708 | |
| Anti-umano CD4 PE/Cy7 (clone SK3) | Biolegend | 344612 | |
| DynaMag-15 | magnete ThermoFisher | 12301D | |
| Ghost BV510 colorante di vitalità | Cellule TONBO | 13-0870-T100 | |
| K562 | Collezione di colture di tipo americano | CCL-243 | |
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Gibco | ||
| 1 M | HEPES Gibco 15630080 | ||
| Soluzione di cloruro di ammonio | STEMCELL Technologies | 7850 | |
| Anti-umano CD127 PE (clone hIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | |
| Anti-umano CD25 APC (clone BC96) | Biolegend | 302610 | |
| Anti-umano CD4 FITC (clone SK3) | Biolegend | ||
| Anti-umano CD71 PE (clone SK1) | Biolegend | 334106 | |
| Anti-umano CD8 PerCP (clone SK1) | Biolegend | ||
| Anti-umano CTLA-4 PerCP-e710 | ThermoFisher | 46-1529-42 | |
| Anti-umano EGFR APC (clone AY13) | Biolegend | 352905 | |
| Anti-umano FOXP3 eFluor 450 | ThermoFisher | 48-4776-42 | |
| Anti-umano HELIOS PE | Biolegend | 137216 | |
| Ca2+ e Mg2+ Dulbecco' libero s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Contatore di cellule (TC20 Automated Cell Counter) | Bio-Rad | 1450102 | |
| Vetrini per il conteggio delle cellule | Bio-Rad | 1450016 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | ThermoFisher | C34571 | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 22431021 | |
| Easy 50 EasySep magnet | Kit | ||
| l'arricchimento delle cellule T EasySep Human CD4+ | STEMCELL Technologies | 19052 | |
| EasySep Human CD8+ Kit per l'arricchimento delle cellule T | STEMCELL Technologies | 19053 | |
| Magnete EasySep | STEMCELL Technologies | 18000 | |
| eBioscience Set di tamponi per colorazione del fattore di trascrizione Foxp3 | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Provette in polistirene a fondo tondo Falcon con tappo a scatto per filtro cellulare, 5 mL | Fisher Scientific | 08-771-23 | 40μ m |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Citometro a flusso | Beckman Coulter | CytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2 | |
| Selezionatore cellulare attivato da fluorescenza | BD Biosciences | FACS Aria III Cell Sorter | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Dynabeads di espansione e attivazione delle cellule T CD3/28 umane | Gibco | 11131D | |
| Sistema di trasfezione Neon Invitrogen | 10431915 | ||
| Invitrogen Neon Transfection System 100 μ L Kit | ThermoFisher | 10114334 | |
| Lentivirus | VectorBuilder | ||
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali | Gibco | 11140050 | |
| Myc Tag anticorpo A647 (clone 9B11) | Cell Signaling Technologies | 2233S | |
| Opti-MEM I Siero ridotto | Medium ThermoFisher | 31985062 | |
| Penicilina-Streptomicina Soluzione | Gibco | 15140122 | |
| Interleuchina umana ricombinante 2 (rhIL-2) | Peprotech | 200-02 | |
| RPMI 1640 medium, senza glutammina | Gibco | 11875093 | |
| piruvato di sodio | Gibco | 11360070 | |
| citometro a flusso spettrale | Cytek | Northern Lights | |
| TRAC gRNA | Synthego | Sequence (CAGGGTTCTGGATATCTGT) | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | ThermoFisher | A36496 | |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154-100ML | |
| 1/10 Leukopak | STEMCELL Technologies | 200-0092 | 1-2 miliardi di PBMC |
Riferimenti
- Zhang, X., Zhu, L., Zhang, H., Chen, S., Xiao, Y. CAR-T cell therapy in hematological malignancies: current opportunities and challenges. Front Immunol. 13, 927153(2022).
- Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell thera....
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Ristampe e permessi
