Questo protocollo descrive un metodo per ottenere registrazioni in vivo di singoli neuroni ad alta densità dal tronco encefalico di topi fissati alla testa. Questo approccio viene utilizzato per misurare l'attivazione del potenziale d'azione dei neuroni nel grigio periacqueduttale ventrolaterale - una regione del tronco encefalico inattiva durante il sonno REM (Rapid Eye Movement) - prima e durante l'anestesia generale.
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Articolo metodologico
Registrazioni acute multi-elettrodo a unità singola dal tronco encefalico di topi fissati alla testa
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le registrazioni basate su multielettrodi al silicio sono sempre più popolari per studiare l'attività neuronale alla risoluzione temporale dei potenziali d'azione in molte regioni del cervello. Tuttavia, la registrazione dell'attività neuronale da strutture caudali profonde come il tronco encefalico utilizzando sonde multicanale rimane impegnativa. Una preoccupazione significativa è trovare una traiettoria per l'inserimento della sonda che eviti i grandi vasi sanguigni, come il seno venoso sagittale superiore e il seno venoso trasverso. Ferire queste grandi vene può causare emorragie estese, danni al tessuto cerebrale sottostante e potenzialmente la morte. Questo approccio descrive il targeting delle strutture del tronco encefalico accoppiando le coordinate anteriori con un approccio angolato, consentendo alla sonda di registrazione di penetrare nel cervello al di sotto delle strutture vascolari ad alto rischio. Rispetto a un approccio strettamente verticale, l'approccio angolato massimizza il numero di regioni cerebrali che possono essere mirate. Utilizzando questa strategia, il grigio periacqueduttale ventrolaterale (vlPAG), una regione del tronco encefalico associata al sonno REM, può essere accessibile in modo riproducibile e affidabile per ottenere registrazioni multi-elettrodo a unità singola in topi fissati alla testa prima e durante l'anestesia con sevoflurano. La capacità di registrare l'attività neuronale nel vlPAG e nei nuclei circostanti con un'elevata risoluzione temporale è un passo avanti nel far progredire la comprensione della relazione tra sonno REM e anestesia.
Introduzione
Le registrazioni basate su multielettrodi al silicio stanno diventando sempre più popolari per misurare l'attività neuronale in molte regioni del cervello con risoluzione del potenziale d'azione singolo 1,2,3,4. Nell'ultimo decennio, la tecnologia di registrazione ad alta densità è cresciuta notevolmente. Gli attuali elettrodi di registrazione a base di silicio possono ospitare un numero elevato di canali, fibre ottiche e dispositivi di registrazione per elettrocorticografia (ECoG)
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Protocollo
Tutti gli studi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della Virginia (Charlottesville, Virginia). Sono stati utilizzati cinque topi maschi C57BL/6J, di età compresa tra 3 e 7 mesi, del peso di 25-30 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature qui utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Impianto della piastra e della cuffia
- Realizzare una cuffia ECoG saldando un filo di acciaio inossidabile rivestito di perfluoroalcossi (PFA) a un connettore a 3 pin (Figura 2A). ....
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Risultati
A cinque maschi C57BL/6J sono stati impiantati una cuffia ECoG e una piastra per la testa (Figura 4A). Dopo il recupero, i topi sono stati abituati alla fissazione della testa e al rig di registrazione elettrofisiologica durante due sessioni di 1,5 ore in giorni separati (Figura 4B). Successivamente, è stata creata una finestra per craniotomia di 2 mm x2 mm (Figura 4C) ed è stata inserita una sonda in silicone con il topo sveglio e .......
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Discussione
I nuclei del tronco encefalico mediano funzioni fondamentali come la respirazione, la coscienza e il sonno 26,27,28. La posizione del tronco encefalico (profonda e posteriore) rappresenta una sfida nello studio della sua attività neuronale in vivo utilizzando tecniche standard. Qui viene presentato un approccio anteriore angolato per consentire la registrazione riproducibile di una sing.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse ai sensi di questo lavoro.
Ringraziamenti
La Figura 1, la Figura 3, la Figura 4, la Figura 8 e la Figura 9 sono state create con BioRender.com. Ringraziamo Scott Kilianski per l'aiuto con il codice MATLAB e per la condivisione dei suoi script. Ringraziamo Anna Grace Carns per l'aiuto nella ricostruzione della traiettoria della sonda.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Controller di registrazione RHD a 1024 canali | Intan Technologies, Los Angeles, California, USA | C3008 | Registrazione con sonda in silicone; hardware e software di registrazione |
| 24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip | VWR, Radnor, Pennsylvania, USA | 48393-081 | Istologia |
| 4% PFA in PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | J61899. AK | Istologia; soluzione di perfusione |
| C& B metabond | Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA | polvere: 5533559, base rapida: 5533492, catalizzatore: 55335007 | Headplate & Impianto di cuffie |
| C57/6J topi 4-6 settimane, maschi | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA | 000664 | |
| Capnomac Ultima | Datex, Helsinki, Finlandia | Analizzatore di gas ULT-SVi-27-07 | fuori produzione; l'analizzatore di gas alternativo può essere acquistato da Bionet America. |
| CM-DiI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | V22888 | Colorante fluorescente rosso per il rivestimento della sonda in silicone |
| Connettore Header | DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA | 1212-1788-ND | ECoG Headset |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA | 0100-20 | Istologia |
| iBOND Universal | Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA | 044-1113 | Piastra di testa & Impianto di cuffie; per fissaggio di fili di acciaio inossidabile al cranio |
| Adesivo siliconico a bassa tossicità | World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA | piastra di testa | KWIK-SIL |
| Nuove tecnologie di scala, Victor, New York, USA | Manipolatore multi-sonda: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, Kit di sistema MPM: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, anello MPM per bracci manuali MPM, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000 | Registrazione con sonda al silicio; inserimento della sonda nel cervello | |
| Microsonde | UCLA, Los Angeles, California, USA | 256 ANS, 64M | Fuori produzione; sonde in silicone alternative possono essere acquistate da Neuropixels |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA | M8410-100ML | Registrazione della sonda in silicone; prevenzione dell'essiccazione del tessuto durante la registrazione |
| Soluzione salina normale | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | Z1376 | Piastra di testa & Impianto di cuffie; prevenire l'essiccazione del cervello durante l'intervento chirurgico |
| Filo in acciaio inossidabile rivestito in PFA Diametro 0,008 pollici rivestito con estremità striate | Sistemi A-M, Sequim, Washington, USA | 791400 | ECoG Cuffia ed elettrodo di riferimento per ECoG |
| Filo di platino 24AWG | World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA | PTP201 | Elettrodo di riferimento per la registrazione della sonda al silicio |
| Vetrini per microscopio Shandon Colorfrost Plus | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 99-910-01 | Istologia |
| Piastra di testa in acciaio inossidabile | Star Rapid, Cina | parte su misura | Piastra di testa & Impianto di cuffie; design disponibile su richiesta |
| Apparecchio stereotassico | KOPF, Tujunga, California, USA | Modello 940 Strumento stereotassico per piccoli animali con console di visualizzazione digitale | Piastra per la testa e Impianto di cuffie |
Riferimenti
- Wu, F., et al. Monolithically integrated µLEDs on silicon neural probes for high-resolution optogenetic studies in behaving animals. Neuron. 88 (6), 1136-1148 (2015).
- Hong, G., Lieber, C. M. Novel electrode technologies for neural recordin....
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Ristampe e permessi
