Method Article

Registrazioni acute multi-elettrodo a unità singola dal tronco encefalico di topi fissati alla testa

DOI:

10.3791/67205

⸱

October 11th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Virginia, 2Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 3Department of Pharmacology, University of Virginia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un metodo per ottenere registrazioni in vivo di singoli neuroni ad alta densità dal tronco encefalico di topi fissati alla testa. Questo approccio viene utilizzato per misurare l'attivazione del potenziale d'azione dei neuroni nel grigio periacqueduttale ventrolaterale - una regione del tronco encefalico inattiva durante il sonno REM (Rapid Eye Movement) - prima e durante l'anestesia generale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le registrazioni basate su multielettrodi al silicio sono sempre più popolari per studiare l'attività neuronale alla risoluzione temporale dei potenziali d'azione in molte regioni del cervello. Tuttavia, la registrazione dell'attività neuronale da strutture caudali profonde come il tronco encefalico utilizzando sonde multicanale rimane impegnativa. Una preoccupazione significativa è trovare una traiettoria per l'inserimento della sonda che eviti i grandi vasi sanguigni, come il seno venoso sagittale superiore e il seno venoso trasverso. Ferire queste grandi vene può causare emorragie estese, danni al tessuto cerebrale sottostante e potenzialmente la morte. Questo approccio descrive il targeting delle strutture del tronco encefalico accoppiando le coordinate anteriori con un approccio angolato, consentendo alla sonda di registrazione di penetrare nel cervello al di sotto delle strutture vascolari ad alto rischio. Rispetto a un approccio strettamente verticale, l'approccio angolato massimizza il numero di regioni cerebrali che possono essere mirate. Utilizzando questa strategia, il grigio periacqueduttale ventrolaterale (vlPAG), una regione del tronco encefalico associata al sonno REM, può essere accessibile in modo riproducibile e affidabile per ottenere registrazioni multi-elettrodo a unità singola in topi fissati alla testa prima e durante l'anestesia con sevoflurano. La capacità di registrare l'attività neuronale nel vlPAG e nei nuclei circostanti con un'elevata risoluzione temporale è un passo avanti nel far progredire la comprensione della relazione tra sonno REM e anestesia.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le registrazioni basate su multielettrodi al silicio stanno diventando sempre più popolari per misurare l'attività neuronale in molte regioni del cervello con risoluzione del potenziale d'azione singolo 1,2,3,4. Nell'ultimo decennio, la tecnologia di registrazione ad alta densità è cresciuta notevolmente. Gli attuali elettrodi di registrazione a base di silicio possono ospitare un numero elevato di canali, fibre ottiche e dispositivi di registrazione per elettrocorticografia (ECoG) 5,6. Inoltre, l'impianto cronico di questi elettrodi consente registrazioni a lungo termine 7,8.

Nonostante i recenti progressi tecnologici, il targeting di strutture caudali profonde come il tronco encefalico con sonde multicanale rimane una sfida. Quando si prendono di mira strutture del tronco encefalico come il grigio periacqueduttale ventrolaterale (vlPAG), un ostacolo significativo è l'identificazione di una traiettoria della sonda che eviti i principali vasi sanguigni, ad esempio il seno venoso sagittale superiore e il seno venoso trasverso. La lesione di queste grandi vene può causare emorragie estese, danni al tessuto cerebrale sottostante e persino la morte 9,10. Proponiamo di indirizzare le strutture del tronco encefalico dalle coordinate anteriori ad angolo, consentendo alla sonda di registrazione di penetrare nel cervello al di sotto di tali strutture vascolari ad alto rischio (vedi Figura 1). Questo approccio angolato, rispetto a quello verticale, massimizza il numero di regioni cerebrali accessibili per la registrazione. Inoltre, in circostanze sperimentali in cui si desidera effettuare registrazioni ECoG, l'approccio anteriore angolato offre una maggiore superficie cranica disponibile per l'impianto di cuffie ECoG, poiché la finestra craniotomica per l'inserimento della sonda è posizionata più anteriormente10,11.

L'identificazione dei gruppi cellulari e dei circuiti specifici responsabili dei cambiamenti del sonno REM indotti dall'anestesia rimane uno degli obiettivi principali della ricerca sull'anestesia. Pertanto, l'obiettivo era quello di accedere in modo riproducibile e affidabile al vlPAG - una regione del tronco encefalico associata al sonno REM - per ottenere registrazioni multi-elettrodo a singola unità in topi fissati alla testa prima e durante l'anestesia con sevoflurano12,13. Studi precedenti hanno utilizzato misurazioni elettrofisiologiche del potenziale di campo locale (LFP) del vlPAG in topi svegli per identificare i cambiamenti di stato neurale associati all'anestesia14,15. Tuttavia, le misurazioni LFP sono principalmente sensibili all'attività sinaptica, non ai potenziali d'azione, all'interno dell'area registrata16. Di conseguenza, rimane una comprensione limitata di come gli anestetici influenzino direttamente i modelli di attività neurale prodotti dai neuroni vlPAG. Qui, viene descritto un metodo per ottenere registrazioni di singoli neuroni ad alta densità dal tronco cerebrale di topi fissati alla testa. Questo metodo può anche essere adattato per registrare l'attività di un singolo neurone da varie altre strutture del tronco encefalico profondo e posteriore.

Protocol

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Tutti gli studi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della Virginia (Charlottesville, Virginia). Sono stati utilizzati cinque topi maschi C57BL/6J, di età compresa tra 3 e 7 mesi, del peso di 25-30 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature qui utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Impianto della piastra e della cuffia

  1. Realizzare una cuffia ECoG saldando un filo di acciaio inossidabile rivestito di perfluoroalcossi (PFA) a un connettore a 3 pin (Figura 2A).
  2. Identificare le coordinate di inserzione in base a un atlante stereotassico del mouse17. L'uso del teorema di Pitagora per calcolare l'angolo e la profondità di inserimento della sonda, in particolare quando ci sono poche informazioni in letteratura, è un punto di partenza ragionevole (Figura 1)18.
    NOTA: Alla fine, le coordinate verranno regolate per tentativi ed errori. Per indirizzare il vlPAG sono state utilizzate le seguenti coordinate nei topi adulti: anteroposteriore (AP) -3,6 mm, mediolaterale (ML) +0,5 mm, dorsoventrale (DV) -4 mm. La sonda è stata inserita con un angolo di 20° (AP).
  3. Indurre l'anestesia generale posizionando il topo nella camera di induzione (1,5%-3% di isoflurano in ossigeno). Una volta anestetizzato, posizionare il topo nel telaio stereotassico, posizionando il naso dell'animale nel cono del naso e stabilizzando la testa con delle barre per la testa.
  4. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire danni alla cornea. Utilizzare un sistema di controllo della temperatura per mantenere la temperatura corporea a 37 °C.
  5. Applicare una crema depilatoria o radere il pelo sul cuoio capelluto, quindi disinfettare con iodio povidone e alcol al 70%. Utilizzare la tecnica asettica "solo punte" per mantenere un campo chirurgico sterile.
  6. Eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi per verificare la profondità dell'anestesia.
  7. Somministrare analgesia: carprofene 2,5 mg/kg, somministrato per via sottocutanea nella parte posteriore.
  8. Praticare un'incisione del cuoio capelluto di 5 mm per rimuovere una macchia circolare di pelle sopra le ossa parietale e occipitale. Rimuovere delicatamente le meningi raschiandole con la lama del bisturi.
  9. Utilizzare la lama del bisturi per tagliare gli attacchi muscolari ed esporre le ossa parietali e occipitali19. Applicare perossido di idrogeno secondo necessità per controllare il sanguinamento e asciugare la superficie del cranio. È fondamentale applicare cemento dentale e resina sul cranio asciutto per ottenere un legame forte.
  10. Innanzitutto, identifica i punti di riferimento bregma e lambda sul cranio20. Quindi, regolare la posizione del cono del naso per livellare la posizione antero-posteriore del cranio, assicurandosi che non esistano più di 100 μm di differenza di altezza tra i due punti di riferimento.
  11. Per livellare la posizione mediale-laterale del cranio, prelevare due punti opposti tra bregma e lambda, ciascuno a 1 mm dalla sutura sagittale e controllarne il livello. Se c'è una differenza di altezza superiore a 100 μm tra di loro, regola la posizione mediale-laterale del cranio manipolando le barre della testa.
  12. Misurare la distanza tra bregma e lambda e confrontarla con la distanza riportata nell'atlante stereotassico di Franklin-Paxinos (di solito 4,2 mm)17. Utilizzare la differenza tra le distanze misurate e riportate per scalare proporzionalmente le coordinate AP. Segna le coordinate della craniotomia sul cranio con una matita sterilizzata.
    NOTA: Se la distanza misurata tra la bregma e l'altra è diversa da 4,2 mm, le coordinate devono essere scalate proporzionalmente. Tutte le coordinate AP riportate in un atlante stereotassico corrispondono a una distanza bregma-lambda standardizzata. Poiché la dimensione del cranio di un topo è variabile, è importante regolare le coordinate di conseguenza.
  13. Utilizzando un micromanipolatore stereotassico, posizionare la piastra direttamente sopra la sutura lambda e fissarla al cranio applicando cemento dentale sulla piastra e attorno ad essa (Figura 3A, B). Lasciare asciugare almeno 10 minuti per il cemento.
  14. Praticare dei fori (0,5 mm di diametro) per due elettrodi corticali (corteccia frontale e parietale) e per uno che fungerà da elettrodo di riferimento (cervelletto). Posizionare le estremità spellate (0,5 mm) degli elettrodi a filo d'argento rivestiti all'interno dei fori della fresa e fissarle con resina attivata dalla luce ultravioletta.
  15. Coprire completamente i fili di acciaio inossidabile rivestiti con cemento dentale in modo che nessun filo sia esposto. Coprire la parte inferiore e i lati dell'auricolare con cemento dentale in modo che sia saldamente in posizione. Assicurarsi che le suture bregma e lambda rimangano visibili una volta che l'auricolare è fissato in posizione (Figura 2B).
  16. Lascia che il topo si riprenda per un minimo di 7 giorni, esamina quotidianamente l'animale e il sito chirurgico per eventuali irregolarità. Somministrare analgesici (Carprofene 2,5 mg/kg, SC) secondo necessità.

2. Posizionamento e registrazione della sonda al silicio

  1. Abituare il mouse al rig di registrazione e al fissaggio della testa (almeno 1,5 ore in due giorni separati) (Figura 2D).
  2. Il giorno della registrazione, posizionare il topo nella camera di anestesia (isoflurano 1,5%-3% in ossigeno).
  3. Posizionare il mouse in una cornice stereotassica, regolare l'ogiva e le barre della testa come descritto in 1.3. Mantenere l'anestesia (isoflurano 1,5%-3% in ossigeno) durante l'intervento di chirurgia stereotassica. Eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi per verificare la profondità dell'anestesia.
  4. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi e mantenere una temperatura corporea adeguata.
  5. Identificare bregma e lambda, assicurandosi che non esistano più di 100 μm di differenza di altezza tra i due punti di riferimento anatomici.
  6. Trova e segna le coordinate calcolate sul cranio con una matita sterile, quindi crea un contorno della finestra craniotomica di 2 mm x 2 mm attorno alle coordinate.
  7. Eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi per verificare la profondità dell'anestesia.
  8. Utilizzare un trapano ad alta velocità per creare una finestra per craniotomia di 2 mm x 2 mm. Applicare 0,5-1 ml di soluzione fisiologica normale per evitare che la superficie cerebrale si secchi. Rimuovere la dura madre utilizzando un ago da siringa e una pinza fine.
    NOTA: Fare attenzione ai vasi principali (seno sagittale superiore, seno trasverso) per evitare un sanguinamento eccessivo (Figura 3).
  9. Utilizzare un trapano ad alta velocità per creare un foro di fresatura separato per l'elettrodo di riferimento della sonda in silicone, generalmente a ~1-2 mm dalla finestra cranica.
  10. Applicare 0,2 ml di adesivo siliconico a bassa tossicità sul cranio per sigillare completamente la craniotomia, utilizzando l'applicatore allegato.
  11. Lascia che il mouse si riprenda per circa 1 ora.
  12. Fissare la testa del mouse al rig di registrazione elettrofisiologica utilizzando la piastra e le viti (Figura 2D).
  13. Rivestire il gambo della sonda in silicone con il colorante fluorescente DiI (1:4 DiI:Etanolo) in modo che la traiettoria della sonda possa essere ricostruita dopo l'esperimento.
  14. Montare la sonda sul manipolatore e impostare l'angolo desiderato. Per puntare il vlPAG, è stato applicato un angolo AP di 15-20°.
  15. Abbassare la sonda di registrazione sulla superficie del cervello al centro della finestra cranica. Innanzitutto, inserire manualmente la sonda a una profondità di ~300 μm. Una volta inserita a questa profondità, abbassare lentamente la sonda automaticamente (ad es. 200 μm/min) alla profondità desiderata per ridurre al minimo il danno tissutale21 (Figura 2C).
    NOTA: Inizialmente si consiglia l'inserimento manuale della sonda. L'inserimento manuale della sonda garantisce la possibilità di arrestare e ritrarre la sonda nel caso in cui si pieghi al momento dell'inserimento iniziale. Una volta che la sonda è completamente penetrata nel tessuto, è generalmente sicuro continuare a scendere la sonda in modalità automatica.
  16. Applicare olio minerale sulla superficie del cervello all'interno della finestra craniotomica per evitare che si secchi.
  17. Lasciare che la sonda di registrazione si stabilizzi per 10 minuti dopo l'inserimento.
  18. Registra i dati dalla sonda al silicio e dall'ECoG a 30 kHz utilizzando un controller di registrazione Intan.
  19. 1-2 ore dopo la registrazione, utilizzare la tecnica della perfusione transcardica per fissare il cervello in paraformaldeide22% al 4%.
    NOTA: A causa del cemento, potrebbe essere difficile rimuovere la parte rostrale del cranio. Ecco perché è preferibile asportare il cervello rimuovendo le parti dorsali del cranio.
  20. Decapitare il topo, tagliare la pelle seguendo la linea mediana sul lato dorsale, dal collo alla mascella inferiore. Rimuovere i muscoli e i tessuti attaccati al cranio, tagliare la mascella inferiore per un più facile accesso al cervello.
  21. Se la perfusione viene eseguita correttamente, il cervello dovrebbe restringersi un po', lasciando abbastanza spazio per inserire le forbici sottili nella parte dorsale del forame magno. Eseguire un taglio mediale, un taglio laterale e un taglio controlaterale, di circa 1 mm di dimensione, nell'osso occipitale.
  22. Rimuovere con cautela la parte dorsale del cranio utilizzando una pinza oftalmica. Inizia dall'osso occipitale, rimuovi tutti i frammenti del cranio fino a quando l'intera parte dorsale del cervello non è esposta.
  23. Fai scorrere una micro spatola sotto il cervello, iniziando dai bulbi olfattivi per estrarre il cervello.
  24. Una volta perfuso e rimosso, il cervello può essere conservato in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 24-48 ore.

3. Istologia per la ricostruzione della traiettoria della sonda

  1. Sezionare il cervello in sezioni coronali di 70 μm utilizzando un vibratomo.
  2. Montare le sezioni sui vetrini utilizzando un mezzo di montaggio DAPI che colora i nuclei cellulari. Vetrino coprioggetti e sigillare i vetrini con smalto trasparente.
  3. Visualizzare i vetrini su un microscopio a fluorescenza. Regolare il contrasto/luminosità in modo che le tracce della sonda siano chiaramente visibili. Assicurati che le dimensioni del file immagine tiff risultante siano inferiori a 10 MB, in modo che i codici MATLAB vengano eseguiti senza problemi. Ricostruisci le tracce della sonda utilizzando un codice MATLAB23.

4. Analisi dei dati elettrofisiologici

  1. Analizza i segnali neurali registrati dalla sonda al silicio utilizzando un software di rilevamento off-line e di smistamento automatico (Kilosort)24.
  2. Classificare manualmente i cluster rilevati con Phy come unità multiple o singole25. Classificare i cluster come singole unità quando hanno una forma d'onda a picco fisiologico, mostrano un periodo refrattario nel correlatore incrociato e una normale distribuzione della vista dell'ampiezza.
  3. Importa i dati di una singola unità in MATLAB e analizzali23.

Results

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A cinque maschi C57BL/6J sono stati impiantati una cuffia ECoG e una piastra per la testa (Figura 4A). Dopo il recupero, i topi sono stati abituati alla fissazione della testa e al rig di registrazione elettrofisiologica durante due sessioni di 1,5 ore in giorni separati (Figura 4B). Successivamente, è stata creata una finestra per craniotomia di 2 mm x2 mm (Figura 4C) ed è stata inserita una sonda in silicone con il topo sveglio e la testa fissa (Figura 4D). Sono stati utilizzati due tipi di sonde UCLA al silicio: (1) 64 M: una sonda a un gambo e 64 elettrodi; e (2) 256 ANS: una sonda a quattro ancore e 256 elettrodi. Il sevoflurano e l'ossigeno sono stati somministrati utilizzando un cono nasale fissato al rig di elettrofisiologia. I livelli di ossigeno e sevoflurano sono stati monitorati ogni 5 minuti utilizzando un analizzatore di gas in linea. Dopo la perfusione transcardica, il cervello è stato prelevato (Figura 4E) e valutato per la traiettoria della sonda (Figura 4F). I potenziali d'azione registrati sono stati poi curati in dati di singole unità (Figura 4G).

Sono state eseguite cinque registrazioni in cui il posizionamento della sonda è stato convalidato con gli algoritmi di ricostruzione della sonda disponibili sviluppati in MATLAB23. Utilizzando questi algoritmi, ogni elettrodo della sonda di silicio è stato localizzato in una specifica struttura cerebrale in modo da acquisire una prospettiva tridimensionale del posizionamento della sonda all'interno del cervello (Figura 5). Questi algoritmi di ricostruzione sono stati accoppiati con marcatori immunoistochimici per convalidare ulteriormente le traiettorie delle sonde (Figura 6). I dati sono stati poi confrontati con singole unità curate (Figura 7).

Sono stati catturati un totale di 64 singoli neuroni, di cui 13 si trovavano nel vlPAG. I restanti 51 neuroni si trovavano in nuclei vicini: mesencefalo, nucleo reticolare mesencefalico, nucleo paratrocleare, nucleo cuneiforme, nucleo tegmentale laterodorsdal, nucleo parabrachiale e peduncoli cerebellari superiori. L'attività di attivazione dei neuroni in ciascun topo è presentata come mappe di calore (Figura 7). Il topo 3 è stato escluso dall'analisi a causa della scarsa qualità della registrazione di una singola unità. La maggior parte dei neuroni registrati ha diminuito la loro attivazione durante l'anestesia con sevoflurano.

L'attivazione media dei neuroni vlPAG è stata confrontata per ciascun topo a 5 minuti al basale (cioè 10-15 minuti nella registrazione) e 5 minuti durante il sevoflurano (cioè 40-45 minuti nella registrazione). L'attivazione di vlPAG è stata significativamente ridotta (Figura 8A) e, inoltre, questo aumento è stato coerente in tutti i neuroni vlPAG (Figura 8B).

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Figura 1: Calcolo delle coordinate stereotassiche per l'inserimento della sonda. Pannello di sinistra: Utilizzo della geometria per calcolare l'approccio angolato per l'inserimento della sonda. Sono stati identificati i seguenti componenti di un triangolo rettangolo: (a) profondità DV della struttura target dalla superficie cerebrale (acquisita utilizzando l'atlante stereotassico), (b) distanza tra la coordinata AP assumendo una discesa strettamente verticale e la coordinata AP della struttura target. Pannello di destra: Con (a) e (b), si può utilizzare il teorema di Pitagora per calcolare l'angolo AP (β) e la lunghezza (c) di inserimento della sonda. Le seguenti coordinate sono state utilizzate per puntare il vlPAG: (AP) -3,6 mm, (ML) +0,5 mm, (DV) -4 mm. È stato utilizzato un angolo AP (β) di 20°. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Impianto della piastra di testa e registrazione di una singola unità. (A) Posizionamento del cavo della cuffia ECoG durante l'impianto. (B) Vista dall'alto del cranio del topo dopo l'impianto del visore ECoG e della piastra per la testa. (C) Gambi di sonda in silicio inseriti nel cervello. (D) Mouse fissato sulla testa durante la registrazione di una sonda al silicio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Posizionamento della finestra cranica, rispetto ai principali vasi sanguigni. Rappresentazione schematica della vascolarizzazione sulla superficie del cervello del topo con seno sagittale superiore e seno trasverso marcati. Il quadrato bianco indica la posizione della finestra cranica e il punto rosso rappresenta il punto di inserimento della sonda. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Disegno sperimentale. Cinque topi maschi C57BL/6J sono stati impiantati con cuffie ECoG e piastra per la testa (A). Dopo il recupero, si sono abituati al fissaggio della testa e all'impianto di registrazione (B). Successivamente, è stata eseguita una craniotomia (C) e una sonda in silicone è stata inserita con il topo sveglio e in una posizione fissa della testa. Gli anestetici volatili e l'ossigeno sono stati somministrati utilizzando un cono nasale (D). Dopo la registrazione, il cervello è stato prelevato (E) e analizzato utilizzando tecniche di immunoistochimica per ricostruire la traiettoria della sonda (F). I potenziali d'azione registrati sono stati quindi curati in dati di singole unità (G). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Modello 3D del cervello con tracce di sonda ricostruite. Ogni linea retta colorata rappresenta una traiettoria della sonda. Ogni punto segna la posizione del colorante DiI visibile sulle fette di cervello coronale. La traiettoria della sonda viene ricostruita per ogni gambo della sonda in silicio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Ricostruzione post hoc del posizionamento della sonda all'interno del vlPAG. Fetta di cervello coronale rappresentativa per ogni topo registrato (1-5) colorato con DAPI (blu) che mostra tracce di sonda ((DiI, rosso, contrassegnato da frecce verdi) con un contorno di regioni cerebrali. Barra di scala: 500 μm. I topi 1-3 sono stati registrati con sonde al silicio a gambo singolo (cioè 64 canali), mentre i topi 4 e 5 sono stati registrati con sonde al silicio a quattro gambi (cioè 256 canali). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Attività di attivazione del bidone prima e durante l'anestesia con sevoflurano. Le mappe di calore rappresentano il numero di potenziali d'azione attivati da 64 singoli neuroni a intervalli di un minuto. Ai singoli neuroni è stata assegnata una struttura di origine basata sulla ricostruzione della traiettoria della sonda. La linea tratteggiata bianca indica l'inizio della somministrazione di sevoflurano, n = 4 topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Abolizione dell'attivazione dei neuroni vlPAG durante l'anestesia con sevoflurano. (A) Numero medio di potenziali d'azione attivati prima e durante l'anestesia per ciascun topo. (B) Numero di potenziali d'azione attivati da ciascun neurone vlPAG (B). Test t-student accoppiato, **P = 0,0036, P = 0,0053 rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Esempio di come il posizionamento irregolare della piastra di testa può influenzare la traiettoria della sonda. (A) Posizionamento irregolare della piastra di testa sulla testa del mouse. (B,C) Ricostruzione 3D del cervello del topo con traiettoria della sonda renderizzata in cui è presente un angolo mediolaterale non intenzionale causato dal posizionamento irregolare delle piastre sulla testa del topo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

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I nuclei del tronco encefalico mediano funzioni fondamentali come la respirazione, la coscienza e il sonno 26,27,28. La posizione del tronco encefalico (profonda e posteriore) rappresenta una sfida nello studio della sua attività neuronale in vivo utilizzando tecniche standard. Qui viene presentato un approccio anteriore angolato per consentire la registrazione riproducibile di una singola unità nei topi con testa fissata.

L'inserimento accurato della sonda in silicio multi-elettrodo è fondamentale per garantire un targeting coerente delle strutture del tronco encefalico correlate al sonno REM, evitando danni ai principali vasi sanguigni. Sono necessari un notevole grado di finezza, concentrazione e pazienza per risolvere le migliori coordinate e traiettorie dell'ingresso13.

A causa della traiettoria angolata della sonda e della distanza richiesta per mirare alle strutture profonde, anche piccole incongruenze nelle coordinate e nel posizionamento della piastra di testa probabilmente comporteranno la mancanza della struttura target. È imperativo che Bregma e Lambda siano allo stesso livello durante l'impianto della piastra di testa e che la distanza tra loro sia misurata con precisione. In particolare, poiché gli interventi chirurgici vengono eseguiti su un telaio stereotassico e le registrazioni vengono eseguite su un impianto di elettrofisiologia separato, è fondamentale che le piastre siano fissate a un cranio livellato. L'introduzione di angoli aggiuntivi (ad esempio, la testa inclinata) aumenta il rischio di errore, che è particolarmente elevato per le strutture cerebrali piccole e profonde (Figura 9).

Poiché le sonde in silicone sono fragili, è importante rimuovere la dura madre dalla superficie del cervello e assicurarsi che nessun frammento osseo ostruisca la finestra cranica. Dopo la rimozione della dura madre può verificarsi un leggero sanguinamento, quindi è fondamentale liberare la superficie della craniotomia dal sangue rappreso che potrebbe causare la flessione della sonda. Se l'inserimento della sonda in silicone nel cervello si rivela difficile (ad esempio, la sonda si sta piegando), è importante verificare la presenza di eventuali residui di dura madre o se la superficie del cervello si è asciugata, poiché può formarsi una membrana sottile se lasciata con poco o nessun liquido. Negli esseri umani27, le aree vicine ai vasi sanguigni hanno una dura più spessa e un problema simile si riscontra nei topi, dove rimuovere la dura madre senza rompere i vasi può essere difficile. Sebbene un'attenta rimozione della dura madre di solito porti a un inserimento regolare della sonda, angoli di inserimento più ampi possono presentare ulteriori difficoltà.

La resa delle registrazioni può variare considerevolmente tra gli animali e dipende da numerose variabili. Un fattore significativo è la densità dei neuroni nella struttura bersaglio; Le aree con bassa densità neuronale (ad esempio, la corteccia) tendono ad avere una resa inferiore di singoli neuroni registrati. Inoltre, il danno tissutale, come la rottura di un vaso sotto la superficie del cervello, può portare alla morte o alla lesione neuronale, riducendo ulteriormente la resa21,29. Anche la qualità delle registrazioni è fondamentale, poiché le registrazioni di qualità superiore facilitano la distinzione dei singoli neuroni. Una traiettoria della sonda fuori bersaglio può anche comportare rendimenti inferiori. Sebbene sia stato sviluppato per le registrazioni nel vlPAG, questo protocollo può essere utilizzato per registrare da strutture vicine nel tronco encefalico.

Disclosures

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse ai sensi di questo lavoro.

Acknowledgements

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La Figura 1, la Figura 3, la Figura 4, la Figura 8 e la Figura 9 sono state create con BioRender.com. Ringraziamo Scott Kilianski per l'aiuto con il codice MATLAB e per la condivisione dei suoi script. Ringraziamo Anna Grace Carns per l'aiuto nella ricostruzione della traiettoria della sonda.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Controller di registrazione RHD a 1024 canaliIntan Technologies, Los Angeles, California, USAC3008Registrazione con sonda in silicone; hardware e software di registrazione
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslipVWR, Radnor, Pennsylvania, USA48393-081Istologia
4% PFA in PBSThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAJ61899. AKIstologia; soluzione di perfusione
C& B metabondPatterson Dental, Richmond, Virginia, USApolvere: 5533559, base rapida: 5533492, catalizzatore: 55335007Headplate & Impianto di cuffie
C57/6J topi 4-6 settimane, maschiThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA000664
Capnomac UltimaDatex, Helsinki, FinlandiaAnalizzatore di gas ULT-SVi-27-07fuori produzione; l'analizzatore di gas alternativo può essere acquistato da Bionet America.
CM-DiIThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAV22888Colorante fluorescente rosso per il rivestimento della sonda in silicone
Connettore HeaderDigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA1212-1788-NDECoG Headset
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA0100-20Istologia
iBOND UniversalPatterson Dental, Richmond, Virginia, USA044-1113Piastra di testa & Impianto di cuffie; per  fissaggio di fili di acciaio inossidabile al cranio
Adesivo siliconico a bassa tossicitàWorld Precision Instruments, Sarasota, Florida, USApiastra di testaKWIK-SIL
Nuove tecnologie di scala, Victor, New York, USAManipolatore multi-sonda: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, Kit di sistema MPM: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, anello MPM per bracci manuali MPM, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000Registrazione con sonda al silicio; inserimento della sonda nel cervello
MicrosondeUCLA, Los Angeles, California, USA256 ANS, 64MFuori produzione; sonde in silicone alternative possono essere acquistate da Neuropixels
Mineral OilSigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USAM8410-100MLRegistrazione della sonda in silicone; prevenzione dell'essiccazione del tessuto durante la registrazione
Soluzione salina normaleThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAZ1376Piastra di testa & Impianto di cuffie; prevenire l'essiccazione del cervello durante l'intervento chirurgico
Filo in acciaio inossidabile rivestito in PFA Diametro 0,008 pollici rivestito con estremità striateSistemi A-M, Sequim, Washington, USA791400ECoG Cuffia ed elettrodo di riferimento per ECoG 
Filo di platino 24AWG World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USAPTP201Elettrodo di riferimento per la registrazione della sonda al silicio 
Vetrini per microscopio Shandon Colorfrost PlusThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA99-910-01Istologia
Piastra di testa in acciaio inossidabileStar Rapid, Cinaparte su misuraPiastra di testa & Impianto di cuffie; design disponibile su richiesta
Apparecchio stereotassicoKOPF, Tujunga, California, USAModello 940 Strumento stereotassico per piccoli animali con console di visualizzazione digitalePiastra per la testa e Impianto di cuffie
; Sistema di micro-manipolatore con

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