Il presente studio evidenzia i vantaggi dell'impiego del metodo sviluppato da Jeffrey e Humphrey per l'estrazione e la quantificazione di pigmenti liposolubili dalle microalghe. Questo metodo funge da strumento prezioso per valutare l'influenza dei fattori di crescita sulla produzione di clorofilla e sul contenuto cellulare in questi organismi.
Articolo metodologico
Valutazione dell'effetto dei fattori di crescita sulla produzione di clorofille a e b dalle microalghe
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le microalghe contengono due gruppi principali di pigmenti: clorofille e carotenoidi. La clorofilla è un pigmento verde che assorbe l'energia luminosa e la trasforma in energia chimica per facilitare la sintesi dei composti organici. Questo pigmento funge da preziosa fonte primaria per i prodotti biotecnologici nell'industria alimentare, farmaceutica e cosmetica grazie alle sue elevate proprietà antiossidanti e capacità coloranti. L'obiettivo di questa ricerca è stato quello di valutare l'effetto dei fattori di crescita (concentrazione di CO2 , colore della luce e intensità della luce) attraverso un disegno sperimentale Taguchi L4 sulla crescita cellulare e sul contenuto cellulare di clorofilla a e b in Chlorella sorokiniana, seguito dalla convalida del metodo utilizzando Haematococcus pluvialis microalghe come modello di studio aggiuntivo. La crescita cellulare è stata quantificata utilizzando la tecnica spettrofotometrica a densità ottica a una lunghezza d'onda di 550 nm. Per la quantificazione delle clorofille è stato ottenuto un estratto cellulare utilizzando una soluzione di acetone pura al 90% e, successivamente, le concentrazioni di clorofille a e b sono state quantificate mediante tecniche spettrofotometriche a lunghezze d'onda di 647 nm e 664 nm, secondo il metodo descritto da Jeffrey e Humphrey. I risultati sperimentali hanno indicato che il controllo delle condizioni di bassa aggiunta di CO2 , luce viola e bassa intensità luminosa aumenta sia la crescita cellulare che la concentrazione di clorofille a e b all'interno delle cellule. L'implementazione di questo metodo di quantificazione della clorofilla consente una determinazione rapida, semplice e precisa del contenuto di clorofilla, poiché le lunghezze d'onda utilizzate sono ai picchi di assorbanza di entrambi i tipi di clorofille, rendendo questa tecnica facilmente riproducibile per qualsiasi microalga in studio.
Introduzione
Negli ultimi anni, i crescenti problemi ambientali causati dalle attività antropiche e i loro effetti negativi sulla salute e sull'equilibrio degli ecosistemi hanno spinto la ricerca di sistemi di produzione più efficienti e rispettosi dell'ambiente. Ciò ha accelerato i processi nelle industrie e favorito l'implementazione di trattamenti di biorisanamento e lo sviluppo di biocomposti per mitigare questi effetti dannosi1.
Questo contesto ha portato a una crescita significativa nello studio delle microalghe, spinta dalla necessità di trovare soluzioni innovative alle attuali sfide ambientali ed economiche. Le microalghe prosperano negli ambienti acquatici, utilizzando la luce solare e l'anidride carbonica rispettivamente come fonti di energia e carbonio. Questa caratteristica li rende un'alternativa sostenibile e promettente per la produzione di vari prodotti di valore. La ricerca in questo campo si è concentrata sulla comprensione della fisiologia e del metabolismo di queste cellule, nonché sullo sviluppo di tecnologie efficienti per la loro coltivazione e lavorazione2.
C'è una chiara necessità di sviluppare strumenti accessibili e affidabili per lo studio delle microalghe per accelerare i processi di ricerca e approfondire la comprensione della loro fisiologia, metabolismo e potenziali applicazioni. Questi strumenti dovrebbero consentire una rapida analisi dell'effetto dei fattori ambientali e di produzione su parametri chiave, come la concentrazione di clorofilla, che è un indicatore fondamentale della salute e dello sviluppo di questi organismi. Una diminuzione del contenuto di clorofilla può indicare stress ambientale, carenze nutrizionali o malattie.
Questi pigmenti verdi svolgono un ruolo cruciale nella fotosintesi, catturando l'energia solare per convertire l'anidride carbonica e l'acqua in glucosio e ossigeno e costituiscono tra lo 0,5% e il 5% della biomassa delle microalghe3. Oltre al loro ruolo essenziale nel sostenere i processi vitali, le clorofille hanno trovato applicazioni in vari settori. Gli estratti di clorofilla sono utilizzati nella lavorazione di alimenti e bevande come coloranti naturali, conferendo vivaci sfumature verdi ai prodotti e fornendo anche proprietà antiossidanti. Inoltre, gli integratori a base di clorofilla stanno guadagnando popolarità nel settore della salute e del benessere grazie ai loro presunti effetti disintossicanti e antinfiammatori. Sfruttando le molteplici proprietà della clorofilla, le industrie possono sviluppare prodotti innovativi che contribuiscono sia all'aspetto visivo che al benessere dei consumatori1.
A questo proposito, una microalga di grande rilevanza biotecnologica è C. sorokiniana. Questo microrganismo si distingue per il suo rapido tasso di crescita, che lo rende altamente efficiente nella produzione di biomassa. Inoltre, C. sorokiniana presenta un contenuto diversificato di composti altamente nutrizionali, tra cui proteine, lipidi e vitamine, che lo rendono prezioso per varie applicazioni nella produzione di alimenti, mangimi e biocarburanti2. Inoltre, è stato scoperto che questa specie di microalghe produce enzimi extracellulari con diverse funzioni, aprendo possibilità per applicazioni biotecnologiche come il trattamento delle acque reflue, il biorisanamento e i prodotti farmaceutici4. Oltre alla sua rapida crescita e alle sue versatili applicazioni, C. sorokiniana dimostra anche un potenziale significativo per la produzione di clorofilla. Come microrganismo fotosintetico, C. sorokiniana possiede il macchinario necessario per la sintesi della clorofilla, che costituisce tra lo 0,5% e il 5% della biomassa delle microalghe3. Questa capacità rende C. sorokiniana un candidato attraente per la produzione di clorofilla su scala commerciale e promette di essere una soluzione sostenibile alle urgenti sfide ambientali e nutrizionali5.
D'altra parte, un'altra specie di microalghe di notevole interesse è H. pluvialis. Questa microalga è rinomata per la sua produzione di astaxantina, un potente pigmento antiossidante con numerose applicazioni industriali. L'astaxantina funge da meccanismo protettivo per il fotosistema di H. pluvialis , proteggendolo dallo stress ossidativo indotto da fattori ambientali. Questo pigmento è molto ricercato nei cosmetici, nei nutraceutici e nell'industria dell'acquacoltura, grazie alle sue proprietà antiossidanti e ai potenziali benefici per la salute. Con la sua abbondante capacità di produrre astaxantina, H. pluvialis rappresenta una strada promettente per lo sviluppo di prodotti innovativi che soddisfano le varie esigenze industriali e dei consumatori6.
Studi recenti hanno anche evidenziato il potenziale di H. pluvialis1 per la produzione di clorofilla, aumentando ulteriormente la sua importanza industriale. Ad esempio, uno studio ha studiato il contenuto di clorofilla di H. pluvialis in condizioni di crescita variabili e ha scoperto che, con parametri di coltivazione ottimali, H. pluvialis ha mostrato notevoli tassi di produzione di clorofilla, superiori a quelli di altre specie di microalghe7. Questa scoperta sottolinea il potenziale di H. pluvialis come fonte sostenibile di clorofilla, offrendo nuove opportunità per il suo utilizzo in vari settori industriali.
Protocollo
1. Preparazione dei terreni di coltura e preparazione dell'inoculo
- Preparare 1 L di terreno di coltura 3N-BBM+ V(CCAP) (Macronutrienti: NaNO3 [0,75 g L-1], CaCl2 [0,019 g L-1], MgSO4 [0,019 g L-1], K2HPO4 [0,057 g L-1], NaCl [0,025 g L-1], KH2PO4 [0,175 g L-1]; micronutrienti: Na2 EDTA [0,0186 g L-1], FeCl3 [0,0024 g L-1], MnCl2 [0,001 g L-1], ZnCl2 [1,25 x 10-4 g L-1], CoCl2 [5 x 10-5 g L-1], Na2MoO4 [9,98 x 10-5 g L-1])8 e sterilizzarlo per 15 minuti a 121 °C e 1,5 psi.
- Inoculare in un matraccio 1 L di terreno di coltura ad una concentrazione approssimativa di 3 x 106 cellule mL-1 per la microalga C. sorokiniana; Oppure aggiungere dal 5% al 10% (v/v) di inoculo al terreno di coltura.
NOTA: Per mantenere le condizioni di sterilità, si consiglia di utilizzare un cappuccio a flusso laminare, guanti, camice da laboratorio e maschera facciale. - Incubare il pallone inoculato sotto sorgenti di luce rossa con un'intensità approssimativa di 3.600-4.200 lux, a una temperatura compresa tra 22-26 °C, con un fotoperiodo di 12 ore di luce e 12 ore di oscurità per C. sorokiniana e fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di oscurità per H. pluvialis, e agitare manualmente ogni 24 ore, circa per 7 giorni per entrambi i ceppi.
NOTA: Mantenere in condizioni di crescita per almeno 7-10 giorni (fino ad ottenere un colore verde intenso) per C. sorokiniana e 10-12 giorni per H. pluvialis. Per ottenere il concentrato di microalghe che fungerà da inoculo nella cinetica, è necessario rimuovere il mezzo surnatante dalle alghe prodotte. - In un ambiente sterile, riempire provette da centrifugazione coniche sterili da 15 mL con circa 10 mL di terreno inoculato e centrifugare a 3.000 x g per 20 minuti a una temperatura inferiore a 25-30 °C.
- In condizioni sterili, rimuovere il surnatante utilizzando una micropipetta o versando e concentrando la biomassa in una provetta da centrifugazione conica sterile da 50 mL.
- Ripetere questo processo se necessario fino ad ottenere il volume di inoculo richiesto per la cinetica.
- Misurare la densità ottica (OD550 nm) dell'inoculo per determinare la concentrazione cellulare delle microalghe e conservarlo a una temperatura di 3-4 °C fino al momento dell'uso.
NOTA: Il conteggio cellulare diretto è stato inizialmente eseguito per correlare la concentrazione cellulare con l'assorbanza. Una volta contato, l'inoculo può essere conservato in frigorifero per non più di 4 giorni.
2. Studio della cinetica di crescita
- Preparare il volume richiesto di 3N-BBM+ V(CCAP) adatto a ciascun esperimento (8 L per i test a livello di fotobioreattore per C. sorokiniana e 0,5 L per i test a livello di pallone per H. pluvialis) secondo le procedure standard di laboratorio, garantendo una corretta sterilizzazione.
- Sia per il fotobioreattore che per i flaconi, configurare la sorgente luminosa sullo spettro di colori desiderato (blu a 460 nm, viola, miscela di 460 nm e 630 nm per C. sorokiniana e rosso a 630 nm per H. pluvialis); Coprire entrambi i sistemi per evitare interferenze di luce esterna.
NOTA: A causa della variazione della lunghezza d'onda emessa da ciascun diodo emettitore di luce, la spettroradiometria è stata eseguita utilizzando uno spettroradiometro sulle sorgenti luminose per determinare la lunghezza d'onda e la potenza di emissione di ciascun diodo9. La luce viola è stata ottenuta combinando i LED rossi e blu, ottenendo lunghezze d'onda di 460 nm con una potenza di emissione di 1,65 W nm-1 per i LED blu e 630 nm con una potenza di emissione di 0,6 W nm-1 per i LED rossi. Queste misurazioni sono state utilizzate per i test condotti esclusivamente sotto luce blu e rossa. - Programmare il timer per alternare tra cicli di luce e 12 ore di buio per C. sorokiniana e cicli di luce di 16 ore e 8 ore di buio per H. pluvialis.
- Collegare il sistema di aerazione della CO2 al recipiente di coltura del fotobioreattore per fornire anidride carbonica a intervalli di 12 ore per C. sorokiniana.
- Inoculare il recipiente di coltura con un volume sufficiente di pre-inoculo per ottenere una densità cellulare iniziale di 3 x 105 cellule mL-1 o il suo equivalente in densità ottica (OD550 nm) = 0,180.
NOTA: Garantire una tecnica asettica durante l'inoculazione per evitare contaminazioni. - Campionare la coltura a intervalli regolari di 12 ore per C. sorokiniana e 8 ore per H. pluvialis per monitorare la crescita cellulare e i parametri fisiologici. Raccogliere campioni utilizzando tecniche sterili per mantenere l'integrità della coltura.
3. Quantificazione delle clorofille
NOTA: I dati per la quantificazione cellulare sono forniti nel file supplementare 1.
- Versare 40 mL del campione in provette da centrifugazione coniche di plastica.
- Centrifugare a 3.000 x g per 20 minuti a 15 °C ed eliminare il surnatante per decantazione o con una pipetta Pasteur.
- Trasferire il pellet di cella in un tubo di vetro coperto con un foglio di alluminio e un tappo a vite per prevenire l'ossidazione.
- Risospendere il pellet cellulare con 3 mL di soluzione di acetone pura al 90% utilizzando un vortice.
- Sonicare il campione sospeso in un bagno di ghiaccio per due cicli di 5 minuti ciascuno e lasciarlo riposare a 4 °C per 16 oree 10.
- Dopo 16 ore, sonicare nuovamente nelle stesse condizioni menzionate nella fase precedente (fase 3.5) e centrifugare nuovamente nelle condizioni precedentemente descritte (fase 3.2).
- Separare l'estratto di pigmento utilizzando una pipetta Pasteur e trasferirlo in un'altra provetta pulita e protetta dalla luce.
- Posizionare l'estratto di pigmento in una cella di quarzo per leggerlo in uno spettrofotometro a lunghezze d'onda di 630 nm, 647 nm e 664 nm.
NOTA: Calibrare preventivamente lo spettrofotometro con acetone al 90%. - Per calcolare le concentrazioni di clorofilla, utilizzare le seguenti equazioni11:
Clorofilla a = 11,93 A664 - 1,93 A647
Clorofilla b = 20,36 A647 - 5,50 A664
NOTA: I risultati sono espressi in μg mL-1 di estratto, che vengono moltiplicati per il volume dell'estratto e divisi per il numero di mL di campione per ottenere concentrazioni di clorofilla in μg mL-1 di coltura. - Per ottenere valori in μg chl cella-1, utilizzare la seguente formula:
μg chl cell-1 = μg chl in 1 mL di coltura / [cellule mL-1] concentrazione di cellule nella coltura.
Risultati
Per osservare l'efficienza della tecnica che rileva le variazioni nella concentrazione cellulare di clorofilla e valutare l'effetto dei fattori di crescita in C. sorokiniana, è stato stabilito un disegno sperimentale Taguchi L4 , che valuta l'aggiunta di volume di CO2 , il colore della luce e l'intensità della luce. Ogni fattore è stato valutato a livelli bassi e alti, come mostrato nella Tabella 1, nelle condizioni definite dal disegno sperimentale nella Tabella 2.
Una volta concluso il processo sperimentale, i risultati hanno mostrato che la combinazione di bassa aggiunta di CO2, luce viola e alta intensità luminosa (C1, P, I2) corrispondente al trattamento 2, ha aumentato la crescita microbica a 7,83 x 105 cellule mL-1. D'altra parte, il contenuto di clorofilla era più alto nel trattamento 4 nelle condizioni C2, P, I2, raggiungendo una concentrazione di 5,92 x 10-7 μg cel-1 a 132 ore (Figura 1) in coincidenza con la luce viola e l'alta intensità luminosa come livelli ottimali dei fattori in entrambe le esperienze.
Allo stesso tempo, un comportamento simile è stato osservato nelle quattro linee valutate. Tuttavia, è stato osservato un chiaro favore nei test condotti sotto la luce viola. Questo modello suggerisce che la luce viola può avere un impatto positivo sui risultati, promuovendo potenzialmente le condizioni ottimali per la crescita o l'attività cellulare. Questi risultati sottolineano l'importanza di considerare attentamente le condizioni di illuminazione negli esperimenti biologici.
Dall'analisi statistica è stato ottenuto il grafico degli effetti principali. Nella Figura 2, si può osservare come ogni livello dei fattori valutati influenzi la produzione di clorofilla in C. sorokiniana. Le migliori condizioni per la produzione di clorofilla erano l'elevata aggiunta di CO2, la luce viola e l'alta intensità luminosa (C2, P, I2), dove il colore e la concentrazione di anidride carbonica mostrano valori di significatività molto vicini, mentre l'intensità della luce mostra un effetto significativo inferiore sulle variabili di risposta valutate.
Inoltre, è stato generato un diagramma di contrasto (Figura 3), che mostra il comportamento della concentrazione di clorofilla cellulare in base all'effetto dell'aggiunta di volume di CO2 e al colore della luce a cui sono stati sottoposti.
È stato osservato che la luce viola (una miscela di luce blu e rossa) e un'elevata intensità luminosa promuovono significativamente la crescita microbica e la produzione di clorofilla. Nel frattempo, un'elevata aggiunta di CO2 influenza entrambi i parametri rispettivamente positivamente e negativamente, poiché aumenta la concentrazione cellulare di clorofilla al massimo durante la sperimentazione, ma ostacola la crescita microbica. Tuttavia, è evidente che sotto la luce viola, un'aggiunta di volume di CO2 di 20 impulsi s di CO2 ogni 12 ore a una velocità di flusso di 8,5 ft³ h-1 consente una risposta favorevole per entrambi i parametri.
Per convalidare il metodo e i risultati ottenuti da C. sorokiniana, è stato condotto un test di conferma a livello di fiaschetta su H. pluvialis sotto luce rossa a causa della sua caratteristica naturale di degradare la clorofilla per sintetizzare l'astaxantina in condizioni di stress, che sono state indotte a 168 ore aumentando la salinità del mezzo. È stato generato un grafico della concentrazione (Figura 4) in cui la concentrazione massima di clorofilla è stata ottenuta a 0 h con 1,41 x 10-7 μg cel-1. In questo caso, a causa del comportamento naturale delle microalghe, è stata osservata una diminuzione della concentrazione di clorofilla, suggerendo potenziali cambiamenti fisiologici nel modello biologico in esame. Ciò è ulteriormente illustrato nella Figura 5, che mostra una micrografia di C. sorokiniana (Figura 5A) e due micrografie di H. pluvialis: una nella fase verde (Figura 5B) e una nella fase di cambiamento e produzione di astaxantina (Figura 5C). È interessante notare che, nonostante questo declino, non si è verificata alcuna interferenza dalla presenza di composti carotenoidi, che sono, a loro volta, pigmenti liposolubili presenti in essi; Questa è una forte prova della selettività e riproducibilità della tecnica in microalghe con diverse capacità e comportamenti.
Il grafico mostra una diminuzione della concentrazione totale di clorofilla durante l'esperimento. In particolare, c'è un aumento della clorofilla a rispetto alla clorofilla b a 50 ore, dove la concentrazione di clorofilla b diminuisce in modo significativo. Il calo più sostanziale della concentrazione di clorofilla si verifica alla fine della fase di crescita esponenziale. Questa diminuzione è attribuita alla produzione di carotenoidi in H. pluvialis.
Allo stesso modo, l'analisi della composizione della clorofilla a e b è stata condotta per il trattamento con la più alta produzione di C. sorokiniana (C1, P, I2) nella Figura 6. Contrariamente a H. pluvialis, la produzione di clorofille ha mostrato un aumento consistente durante l'intero periodo di sperimentazione, che è stato analizzato solo durante la fase esponenziale. Si osserva che, in modo simile a H. pluvialis, la clorofilla a è inizialmente presente in proporzioni inferiori rispetto alla clorofilla b all'inizio dell'esperimento; Tuttavia, queste proporzioni subiscono un notevole cambiamento a 50 ore, con la clorofilla A che mostra un tasso di produzione più elevato rispetto alla clorofilla B in seguito.
La tecnica analitica impiegata in questo studio si è dimostrata efficiente nel rilevare i cambiamenti all'interno di un modello biologico e tra diversi modelli biologici. Questi risultati sottolineano la sensibilità e la precisione del metodo analitico, consentendo una comprensione sfumata delle dinamiche della clorofilla all'interno e tra i sistemi biologici. Tali intuizioni sono preziose per svelare gli intricati meccanismi che regolano la sintesi e il metabolismo dei pigmenti, aprendo la strada a ulteriori progressi nella ricerca biotecnologica e ambientale.
Figura 1: Contenuto cellulare di clorofilla in trattamenti sperimentali. Contenuto cellulare di clorofilla misurato in Chlorella sorokiniana in diversi trattamenti sperimentali. Dati presentati come deviazione standard per n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Grafico degli effetti principali per il contenuto di clorofilla cellulare. Grafico degli effetti principali che illustra l'impatto di diversi trattamenti sul contenuto di clorofilla cellulare in Chlorella sorokiniana. Dati presentati come deviazione standard per n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Diagramma di contorno della concentrazione cellulare di clorofilla. Grafico di contorno che mostra la relazione tra la concentrazione di clorofilla cellulare, la concentrazione di CO2 e il colore della luce. Il colore della luce è rappresentato con l'asse 1 blu e l'asse 2 viola, con livelli intermedi che indicano l'aggiunta di luce rossa. Dati presentati come deviazione standard per n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Concentrazione di clorofilla durante la cinetica di crescita di H. pluvialis . Concentrazione di clorofilla misurata sulla cinetica di crescita di Haematococcus pluvialis. Dati presentati come deviazione standard per n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Micrografie di C. sorokiniana e H. pluvialis. Immagini micrografiche di Chlorella sorokiniana (A) e Haematococcus pluvialis, che illustrano un esemplare nella fase verde (B) e un altro nella fase rossa precoce (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Concentrazione di clorofilla durante la cinetica di crescita di C. sorokiniana . Concentrazione di clorofilla misurata sulla cinetica di crescita di Chlorella sorokiniana. Dati presentati come deviazione standard per n = 3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Fattore | Basso livello | Alto livello |
| Aggiunta di CO2 (L) | C1 | C2 |
| Colore chiaro | Blu (B) | Viola (P) |
| Intensità luminosa (Lux) | I1 | I2 |
Tabella 1: Fattori e livelli cinetici. Panoramica dei fattori cinetici e dei loro rispettivi livelli: C1 = 0,078 L; C2 = 0,15 L; B = Luce blu; P = Luce viola; I1 = 550 lux; I2 = 1200 lux.
| Trattamento | Aggiunta di CO2 | Colore chiaro | Intensità luminosa (Lux) |
| (L) | |||
| 1 | C1 | B | I1 |
| 2 | C1 | P | I2 |
| 3 | C2 | B | I1 |
| 4 | C2 | P | I2 |
Tabella 2: Disegno sperimentale e trattamenti. Riassunto del disegno sperimentale e dei trattamenti applicati: C1 = 0,078 L; C2 = 0,15 L; B = Luce blu; P = Luce viola; I1 = 550 lux; I2 = 1200 lux.
File supplementare 1: Dati di quantificazione cellulare. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
Lo studio comparativo tra H. pluvialis e C. sorokiniana ha rivelato differenze significative nelle dinamiche di produzione della clorofilla. Mentre H. pluvialis ha mostrato una diminuzione della concentrazione di clorofilla durante l'esperimento, C. sorokiniana ha mostrato un aumento costante. Inoltre, c'era inizialmente una percentuale inferiore di clorofilla a in entrambe le specie, ma questo rapporto si è invertito in particolari condizioni di crescita, il che può dare indicazioni di un'induzione della produzione di dette clorofille attraverso la selettività o l'esposizione di specifiche lunghezze d'onda. Questi risultati suggeriscono una risposta unica di ogni specie alle condizioni sperimentali, evidenziando la sensibilità della tecnica analitica utilizzata per rilevare i cambiamenti all'interno e tra i modelli biologici. La capacità di discernere sottili cambiamenti nelle proporzioni della clorofilla a e b fornisce nuove intuizioni sulla regolazione della sintesi dei pigmenti nelle microalghe, che possono avere implicazioni significative in campi come la biotecnologia e la ricerca ambientale.
Rilevare i periodi di aumento della produzione di clorofilla è fondamentale a causa del suo ruolo come pigmento primario nel processo di fotosintesi. La clorofilla è essenziale per catturare l'energia luminosa e convertirla in energia chimica, che viene poi utilizzata per guidare la crescita cellulare e il metabolismo. Pertanto, un aumento della produzione di clorofilla a indica un aumento della capacità fotosintetica degli organismi, suggerendo condizioni ottimali per la crescita microbica12; ciò supporta l'osservazione in C. sorokiniana che i test che hanno generato una maggiore concentrazione di clorofilla sono stati quelli in cui è stata ottenuta una maggiore crescita cellulare, fornendo preziose informazioni su quando le condizioni ambientali sono più favorevoli per lo sviluppo e la proliferazione di microrganismi fotosintetici.
In particolare, comprendere le proporzioni della clorofilla in H. pluvialis è particolarmente intrigante in quanto possono fornire segnali importanti riguardo allo stato di stress delle microalghe. Quando le condizioni diventano sfavorevoli, ad esempio in condizioni di luce intensa o privazione di nutrienti, le microalghe possono ridurre la produzione di clorofilla e sintetizzare invece pigmenti carotenoidi come l'astaxantina11. Questa transizione da fasi di crescita verde, caratterizzate da alte concentrazioni di clorofilla, a fasi indotte da stress ricche di astaxantina è vantaggiosa per massimizzare la resa di astaxantina. Sottolinea l'importanza di monitorare i livelli di clorofilla come proxy per la risposta allo stress e le dinamiche di produzione di pigmenti nella coltivazione di H. pluvialis .
Inoltre, sebbene i limiti della tecnica siano pochi a causa della sua elevata selettività, sono essenziali accorgimenti come tenere gli estratti al riparo dalla luce per prevenire l'ossidazione e maneggiare con cura i campioni centrifugati per eliminare la torbidità dai residui di biomassa. Inoltre, uno svantaggio del metodo è la necessità di volumi di campione relativamente grandi, in particolare per i terreni diluiti o gli studi cinetici a lungo termine a livello di fiaschetta, che possono porre sfide logistiche. Queste considerazioni evidenziano l'importanza di un'attenta progettazione sperimentale e della manipolazione dei campioni per massimizzare l'efficacia delle tecniche di analisi della clorofilla nella ricerca sulle microalghe.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il finanziamento parziale da parte del TecNM nell'ambito del Bando per la Ricerca Scientifica, lo Sviluppo Tecnologico e l'Innovazione (16898.23-P) per gli Institutos Tecnologics Federales. Apprezzano anche il sostegno dell'Instituto de Ciencia, Tecnología e Innovación del Estado de Michoacán de Ocampo (FCCHTI23_ME-4.1.-0001).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| C3H6O | Meyer | 67-64-1 | Acetone 90% |
| 15 mL provetta | Biologix | 10-9502 | Provetta |
| 2510-DTH | Branson | D-73595 | Sonicatore |
| 5 mL provetta con tappo a vite | Kimax | 45066-13100 | Provetta |
| 50 mL provetta da centrifuga | Biologix | 10-9151 | Provetta |
| Foglio di alluminio | Reynolds | 611 standard, 12" x 1000 piedi | Coperchio della provetta |
| CaCl2 | Meyer | 0925-250 | Centrifuga di cloruro di calcio |
| Dynamica | 14 R | Centrifuga Refrigerata | |
| CoCl2 | Merck | 1057-100 | Dicloruro di cobalto |
| FeCl3 | Merck | 157740 | Cloruro di ferro (III) |
| K2HPO4 | Meyer | 2051-250 | Fosfato dipotassico |
| KH2PO4 | Meyer | 2055-250 | Fosfato monopotassico |
| MgSO4 | Meyer | 1605-250 | Micropipetta di solfato di magnesio |
| Modello LabNet | Micropipetta | Beta-Pette | |
| MnCl2 | Merck | 429449 Cloruro di manganese (II) | |
| Na2 EDTA | Merck | 200-449-4 | Edatamil, Edetato Sale disodico diidrato |
| Na2MoO4 | Merck | 243655 Molibdato di sodio | |
| NaCl | Meyer | 2365-500 | Cloruro di sodio |
| NaNO3 | Meyer | 2465-250 | Nitrato di sodio |
| RGB Striscia LED | Steren | GAD-LED2 | Luce fonte |
| Spettrofotometro | PerkinElmer | Modello Lambda35 | Spettrofotometro |
| spettroradiometro | Gigahertz-Optik | modello BTS256 | |
| Vortex | Scientific Industries | Vortex-Genie® 2 | Vortex |
| ZnCl2 | Merck | 208086 | Cloruro di zinco |
Riferimenti
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