Valutazione dell'effetto dei fattori di crescita sulla produzione di clorofille a e b dalle microalghe

Sommario

Il presente studio evidenzia i vantaggi dell'impiego del metodo sviluppato da Jeffrey e Humphrey per l'estrazione e la quantificazione di pigmenti liposolubili dalle microalghe. Questo metodo funge da strumento prezioso per valutare l'influenza dei fattori di crescita sulla produzione di clorofilla e sul contenuto cellulare in questi organismi.

Abstract

Le microalghe contengono due gruppi principali di pigmenti: clorofille e carotenoidi. La clorofilla è un pigmento verde che assorbe l'energia luminosa e la trasforma in energia chimica per facilitare la sintesi dei composti organici. Questo pigmento funge da preziosa fonte primaria per i prodotti biotecnologici nell'industria alimentare, farmaceutica e cosmetica grazie alle sue elevate proprietà antiossidanti e capacità coloranti. L'obiettivo di questa ricerca è stato quello di valutare l'effetto dei fattori di crescita (concentrazione di CO₂ , colore della luce e intensità della luce) attraverso un disegno sperimentale Taguchi L₄ sulla crescita cellulare e sul contenuto cellulare di clorofilla a e b in Chlorella sorokiniana, seguito dalla convalida del metodo utilizzando Haematococcus pluvialis microalghe come modello di studio aggiuntivo. La crescita cellulare è stata quantificata utilizzando la tecnica spettrofotometrica a densità ottica a una lunghezza d'onda di 550 nm. Per la quantificazione delle clorofille è stato ottenuto un estratto cellulare utilizzando una soluzione di acetone pura al 90% e, successivamente, le concentrazioni di clorofille a e b sono state quantificate mediante tecniche spettrofotometriche a lunghezze d'onda di 647 nm e 664 nm, secondo il metodo descritto da Jeffrey e Humphrey. I risultati sperimentali hanno indicato che il controllo delle condizioni di bassa aggiunta di CO₂ , luce viola e bassa intensità luminosa aumenta sia la crescita cellulare che la concentrazione di clorofille a e b all'interno delle cellule. L'implementazione di questo metodo di quantificazione della clorofilla consente una determinazione rapida, semplice e precisa del contenuto di clorofilla, poiché le lunghezze d'onda utilizzate sono ai picchi di assorbanza di entrambi i tipi di clorofille, rendendo questa tecnica facilmente riproducibile per qualsiasi microalga in studio.

Introduzione

Negli ultimi anni, i crescenti problemi ambientali causati dalle attività antropiche e i loro effetti negativi sulla salute e sull'equilibrio degli ecosistemi hanno spinto la ricerca di sistemi di produzione più efficienti e rispettosi dell'ambiente. Ciò ha accelerato i processi nelle industrie e favorito l'implementazione di trattamenti di biorisanamento e lo sviluppo di biocomposti per mitigare questi effetti dannosi¹.

Questo contesto ha portato a una crescita significativa nello studio delle microalghe, spinta dalla necessità di trovare soluzioni innovative alle attuali sfide ambientali ed economiche. Le microalghe prosperano negli ambienti acquatici, utilizzando la luce solare e l'anidride carbonica rispettivamente come fonti di energia e carbonio. Questa caratteristica li rende un'alternativa sostenibile e promettente per la produzione di vari prodotti di valore. La ricerca in questo campo si è concentrata sulla comprensione della fisiologia e del metabolismo di queste cellule, nonché sullo sviluppo di tecnologie efficienti per la loro coltivazione e lavorazione².

C'è una chiara necessità di sviluppare strumenti accessibili e affidabili per lo studio delle microalghe per accelerare i processi di ricerca e approfondire la comprensione della loro fisiologia, metabolismo e potenziali applicazioni. Questi strumenti dovrebbero consentire una rapida analisi dell'effetto dei fattori ambientali e di produzione su parametri chiave, come la concentrazione di clorofilla, che è un indicatore fondamentale della salute e dello sviluppo di questi organismi. Una diminuzione del contenuto di clorofilla può indicare stress ambientale, carenze nutrizionali o malattie.

Questi pigmenti verdi svolgono un ruolo cruciale nella fotosintesi, catturando l'energia solare per convertire l'anidride carbonica e l'acqua in glucosio e ossigeno e costituiscono tra lo 0,5% e il 5% della biomassa delle microalghe³. Oltre al loro ruolo essenziale nel sostenere i processi vitali, le clorofille hanno trovato applicazioni in vari settori. Gli estratti di clorofilla sono utilizzati nella lavorazione di alimenti e bevande come coloranti naturali, conferendo vivaci sfumature verdi ai prodotti e fornendo anche proprietà antiossidanti. Inoltre, gli integratori a base di clorofilla stanno guadagnando popolarità nel settore della salute e del benessere grazie ai loro presunti effetti disintossicanti e antinfiammatori. Sfruttando le molteplici proprietà della clorofilla, le industrie possono sviluppare prodotti innovativi che contribuiscono sia all'aspetto visivo che al benessere dei consumatori¹.

A questo proposito, una microalga di grande rilevanza biotecnologica è C. sorokiniana. Questo microrganismo si distingue per il suo rapido tasso di crescita, che lo rende altamente efficiente nella produzione di biomassa. Inoltre, C. sorokiniana presenta un contenuto diversificato di composti altamente nutrizionali, tra cui proteine, lipidi e vitamine, che lo rendono prezioso per varie applicazioni nella produzione di alimenti, mangimi e biocarburanti². Inoltre, è stato scoperto che questa specie di microalghe produce enzimi extracellulari con diverse funzioni, aprendo possibilità per applicazioni biotecnologiche come il trattamento delle acque reflue, il biorisanamento e i prodotti farmaceutici⁴. Oltre alla sua rapida crescita e alle sue versatili applicazioni, C. sorokiniana dimostra anche un potenziale significativo per la produzione di clorofilla. Come microrganismo fotosintetico, C. sorokiniana possiede il macchinario necessario per la sintesi della clorofilla, che costituisce tra lo 0,5% e il 5% della biomassa delle microalghe³. Questa capacità rende C. sorokiniana un candidato attraente per la produzione di clorofilla su scala commerciale e promette di essere una soluzione sostenibile alle urgenti sfide ambientali e nutrizionali⁵.

D'altra parte, un'altra specie di microalghe di notevole interesse è H. pluvialis. Questa microalga è rinomata per la sua produzione di astaxantina, un potente pigmento antiossidante con numerose applicazioni industriali. L'astaxantina funge da meccanismo protettivo per il fotosistema di H. pluvialis , proteggendolo dallo stress ossidativo indotto da fattori ambientali. Questo pigmento è molto ricercato nei cosmetici, nei nutraceutici e nell'industria dell'acquacoltura, grazie alle sue proprietà antiossidanti e ai potenziali benefici per la salute. Con la sua abbondante capacità di produrre astaxantina, H. pluvialis rappresenta una strada promettente per lo sviluppo di prodotti innovativi che soddisfano le varie esigenze industriali e dei consumatori⁶.

Studi recenti hanno anche evidenziato il potenziale di H. pluvialis¹ per la produzione di clorofilla, aumentando ulteriormente la sua importanza industriale. Ad esempio, uno studio ha studiato il contenuto di clorofilla di H. pluvialis in condizioni di crescita variabili e ha scoperto che, con parametri di coltivazione ottimali, H. pluvialis ha mostrato notevoli tassi di produzione di clorofilla, superiori a quelli di altre specie di microalghe⁷. Questa scoperta sottolinea il potenziale di H. pluvialis come fonte sostenibile di clorofilla, offrendo nuove opportunità per il suo utilizzo in vari settori industriali.

Protocollo

1. Preparazione dei terreni di coltura e preparazione dell'inoculo

1. Preparare 1 L di terreno di coltura 3N-BBM+ V(CCAP) (Macronutrienti: NaNO₃ [0,75 g ^L-1], CaCl₂ [0,019 g ^L-1], MgSO₄ [0,019 g ^L-1], K₂HPO₄ [0,057 g ^L-1], NaCl [0,025 g ^L-1], KH₂PO₄ [0,175 g ^L-1]; micronutrienti: Na₂ EDTA [0,0186 g ^L-1], FeCl₃ [0,0024 g ^L-1], MnCl₂ [0,001 g ^L-1], ZnCl₂ [1,25 x ^10-4 g ^L-1], CoCl₂ [5 x ^10-5 g ^L-1], Na₂MoO₄ [9,98 x ^10-5 g ^L-1])⁸ e sterilizzarlo per 15 minuti a 121 °C e 1,5 psi.
2. Inoculare in un matraccio 1 L di terreno di coltura ad una concentrazione approssimativa di 3 x 10⁶ cellule ^mL-1 per la microalga C. sorokiniana; Oppure aggiungere dal 5% al 10% (v/v) di inoculo al terreno di coltura.
   NOTA: Per mantenere le condizioni di sterilità, si consiglia di utilizzare un cappuccio a flusso laminare, guanti, camice da laboratorio e maschera facciale.
3. Incubare il pallone inoculato sotto sorgenti di luce rossa con un'intensità approssimativa di 3.600-4.200 lux, a una temperatura compresa tra 22-26 °C, con un fotoperiodo di 12 ore di luce e 12 ore di oscurità per C. sorokiniana e fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di oscurità per H. pluvialis, e agitare manualmente ogni 24 ore, circa per 7 giorni per entrambi i ceppi.
   NOTA: Mantenere in condizioni di crescita per almeno 7-10 giorni (fino ad ottenere un colore verde intenso) per C. sorokiniana e 10-12 giorni per H. pluvialis. Per ottenere il concentrato di microalghe che fungerà da inoculo nella cinetica, è necessario rimuovere il mezzo surnatante dalle alghe prodotte.
4. In un ambiente sterile, riempire provette da centrifugazione coniche sterili da 15 mL con circa 10 mL di terreno inoculato e centrifugare a 3.000 x g per 20 minuti a una temperatura inferiore a 25-30 °C.
5. In condizioni sterili, rimuovere il surnatante utilizzando una micropipetta o versando e concentrando la biomassa in una provetta da centrifugazione conica sterile da 50 mL.
6. Ripetere questo processo se necessario fino ad ottenere il volume di inoculo richiesto per la cinetica.
7. Misurare la densità ottica (OD₅₅₀ nm) dell'inoculo per determinare la concentrazione cellulare delle microalghe e conservarlo a una temperatura di 3-4 °C fino al momento dell'uso.
   NOTA: Il conteggio cellulare diretto è stato inizialmente eseguito per correlare la concentrazione cellulare con l'assorbanza. Una volta contato, l'inoculo può essere conservato in frigorifero per non più di 4 giorni.

2. Studio della cinetica di crescita

1. Preparare il volume richiesto di 3N-BBM+ V(CCAP) adatto a ciascun esperimento (8 L per i test a livello di fotobioreattore per C. sorokiniana e 0,5 L per i test a livello di pallone per H. pluvialis) secondo le procedure standard di laboratorio, garantendo una corretta sterilizzazione.
2. Sia per il fotobioreattore che per i flaconi, configurare la sorgente luminosa sullo spettro di colori desiderato (blu a 460 nm, viola, miscela di 460 nm e 630 nm per C. sorokiniana e rosso a 630 nm per H. pluvialis); Coprire entrambi i sistemi per evitare interferenze di luce esterna.
   NOTA: A causa della variazione della lunghezza d'onda emessa da ciascun diodo emettitore di luce, la spettroradiometria è stata eseguita utilizzando uno spettroradiometro sulle sorgenti luminose per determinare la lunghezza d'onda e la potenza di emissione di ciascun diodo⁹. La luce viola è stata ottenuta combinando i LED rossi e blu, ottenendo lunghezze d'onda di 460 nm con una potenza di emissione di 1,65 W ^nm-1 per i LED blu e 630 nm con una potenza di emissione di 0,6 W ^nm-1 per i LED rossi. Queste misurazioni sono state utilizzate per i test condotti esclusivamente sotto luce blu e rossa.
3. Programmare il timer per alternare tra cicli di luce e 12 ore di buio per C. sorokiniana e cicli di luce di 16 ore e 8 ore di buio per H. pluvialis.
4. Collegare il sistema di aerazione della CO₂ al recipiente di coltura del fotobioreattore per fornire anidride carbonica a intervalli di 12 ore per C. sorokiniana.
5. Inoculare il recipiente di coltura con un volume sufficiente di pre-inoculo per ottenere una densità cellulare iniziale di 3 x 10⁵ cellule ^mL-1 o il suo equivalente in densità ottica (OD₅₅₀ nm) = 0,180.
   NOTA: Garantire una tecnica asettica durante l'inoculazione per evitare contaminazioni.
6. Campionare la coltura a intervalli regolari di 12 ore per C. sorokiniana e 8 ore per H. pluvialis per monitorare la crescita cellulare e i parametri fisiologici. Raccogliere campioni utilizzando tecniche sterili per mantenere l'integrità della coltura.

3. Quantificazione delle clorofille

NOTA: I dati per la quantificazione cellulare sono forniti nel file supplementare 1.

1. Versare 40 mL del campione in provette da centrifugazione coniche di plastica.
2. Centrifugare a 3.000 x g per 20 minuti a 15 °C ed eliminare il surnatante per decantazione o con una pipetta Pasteur.
3. Trasferire il pellet di cella in un tubo di vetro coperto con un foglio di alluminio e un tappo a vite per prevenire l'ossidazione.
4. Risospendere il pellet cellulare con 3 mL di soluzione di acetone pura al 90% utilizzando un vortice.
5. Sonicare il campione sospeso in un bagno di ghiaccio per due cicli di 5 minuti ciascuno e lasciarlo riposare a 4 °C per 16 ore^{e 10}.
6. Dopo 16 ore, sonicare nuovamente nelle stesse condizioni menzionate nella fase precedente (fase 3.5) e centrifugare nuovamente nelle condizioni precedentemente descritte (fase 3.2).
7. Separare l'estratto di pigmento utilizzando una pipetta Pasteur e trasferirlo in un'altra provetta pulita e protetta dalla luce.
8. Posizionare l'estratto di pigmento in una cella di quarzo per leggerlo in uno spettrofotometro a lunghezze d'onda di 630 nm, 647 nm e 664 nm.
   NOTA: Calibrare preventivamente lo spettrofotometro con acetone al 90%.
9. Per calcolare le concentrazioni di clorofilla, utilizzare le seguenti equazioni¹¹:
   Clorofilla a = 11,93 A₆₆₄ - 1,93 A₆₄₇
   Clorofilla b = 20,36 A₆₄₇ - 5,50 A₆₆₄
   NOTA: I risultati sono espressi in μg ^mL-1 di estratto, che vengono moltiplicati per il volume dell'estratto e divisi per il numero di mL di campione per ottenere concentrazioni di clorofilla in μg ^mL-1 di coltura.
10. Per ottenere valori in μg chl ^cella-1, utilizzare la seguente formula:
    μg chl ^cell-1 = μg chl in 1 mL di coltura / [cellule ^mL-1] concentrazione di cellule nella coltura.

Risultati

Per osservare l'efficienza della tecnica che rileva le variazioni nella concentrazione cellulare di clorofilla e valutare l'effetto dei fattori di crescita in C. sorokiniana, è stato stabilito un disegno sperimentale Taguchi L₄ , che valuta l'aggiunta di volume di CO₂ , il colore della luce e l'intensità della luce. Ogni fattore è stato valutato a livelli bassi e alti, come mostrato nella Tabella 1, nelle condizioni definite dal disegno sperimentale nella Tabella 2<...

Discussione

Lo studio comparativo tra H. pluvialis e C. sorokiniana ha rivelato differenze significative nelle dinamiche di produzione della clorofilla. Mentre H. pluvialis ha mostrato una diminuzione della concentrazione di clorofilla durante l'esperimento, C. sorokiniana ha mostrato un aumento costante. Inoltre, c'era inizialmente una percentuale inferiore di clorofilla a in entrambe le specie, ma questo rapporto si è invertito in particolari condizioni...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
C3H6O	Meyer	67-64-1	Acetone 90%
15 mL provetta	Biologix	10-9502	Provetta
2510-DTH	Branson	D-73595	Sonicatore
5 mL provetta con tappo a vite	Kimax	45066-13100	Provetta
50 mL provetta da centrifuga	Biologix	10-9151	Provetta
Foglio di alluminio	Reynolds	611 standard, 12" x 1000 piedi	Coperchio della provetta
CaCl2	Meyer	0925-250	Centrifuga di cloruro di calcio
	Dynamica	14 R	Centrifuga Refrigerata
CoCl2	Merck	1057-100	Dicloruro di cobalto
FeCl3	Merck	157740	Cloruro di ferro (III)
K2HPO4	Meyer	2051-250	Fosfato dipotassico
KH2PO4	Meyer	2055-250	Fosfato monopotassico
MgSO4	Meyer	1605-250	Micropipetta di solfato di magnesio
	Modello LabNet	Micropipetta	Beta-Pette
MnCl2	Merck		429449 Cloruro di manganese (II)
Na2 EDTA	Merck	200-449-4	Edatamil, Edetato Sale disodico diidrato
Na2MoO4	Merck		243655 Molibdato di sodio
NaCl	Meyer	2365-500	Cloruro di sodio
NaNO3	Meyer	2465-250	Nitrato di sodio
RGB Striscia LED	Steren	GAD-LED2	Luce fonte
Spettrofotometro	PerkinElmer	Modello Lambda35	Spettrofotometro
spettroradiometro	Gigahertz-Optik	modello BTS256
Vortex	Scientific Industries	Vortex-Genie® 2	Vortex
ZnCl2	Merck	208086	Cloruro di zinco