Ottimizzazione della preparazione dei campioni per la microscopia elettronica criogenica

Summary

Questo protocollo presenta un metodo pratico che utilizza Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) come esempio per affrontare la distribuzione irregolare delle particelle attraverso l'ottimizzazione della preparazione del campione, fornendo un riferimento per i ricercatori per chiarire in modo efficiente le strutture macromolecolari utilizzando la microscopia elettronica criogenica (cryo-EM).

Abstract

La microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) ha rivoluzionato la biologia strutturale consentendo lo studio di strutture macromolecolari in condizioni quasi native, sospese nel ghiaccio vitreo. Questa tecnica consente la visualizzazione ad alta risoluzione di proteine e altre biomolecole senza la necessità di cristallizzazione, offrendo informazioni significative sulla loro funzione e meccanismo. I recenti progressi nell'analisi di singole particelle, insieme a una migliore elaborazione dei dati computazionali, hanno reso la crio-EM uno strumento indispensabile nella moderna biologia strutturale. Nonostante la sua crescente adozione, la crio-EM deve affrontare sfide persistenti che possono limitarne l'efficacia, in particolare la distribuzione irregolare delle particelle. Questo problema spesso porta a una scarsa risoluzione e a una ridotta accuratezza nelle strutture proteiche ricostruite. Questo articolo delinea un approccio semplice e pratico per affrontare questa sfida, utilizzando come esempio la piccola proteina da shock termico di Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5). Il metodo ottimizza la preparazione del campione per ridurre al minimo l'adsorbimento preferenziale, garantendo una distribuzione più omogenea delle particelle e strutture crio-EM proteiche di qualità superiore. Questa tecnica offre una guida preziosa per i ricercatori che mirano a superare sfide simili negli studi strutturali.

Introduction

Con i recenti progressi sia^{nell'hardware} dello strumento ^1,2 che nel software di elaborazione delle immagini ^3,4,5, la microscopia elettronica criogenica (cryo-EM) è emersa come uno strumento popolare e potente nella moderna biologia strutturale. Nonostante queste scoperte, persistono colli di bottiglia nel raggiungimento di strutture macromolecolari ad alta risoluzione utilizzando la crio-EM. Una di queste sfide significative è la distribuzione irregolare delle particelle, compreso i....

Protocol

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Purificazione delle proteine

1. Indurre l'espressione del ricombinante MjsHSP16.5 in E. coli BL21(DE3) e purificare la proteina utilizzando una colonna cromatografica nichel-chelante come descritto in precedenza²⁶. Dopo la purificazione su una colonna²⁶ per cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), esaminare la purezza delle proteine caricando 5 μL di frazioni di picco su un gel SDS-PAG....

Results

Per identificare le condizioni ottimali della griglia per MjsHSP16.5, è stato condotto uno screening crio-EM iniziale, concentrandosi principalmente sull'esame di varie condizioni del tampone proteico: (1) il tampone di purificazione finale, che garantisce la stabilità e l'omogeneità di MjsHSP16.5 ed è importante per la sua cristallizzazione³⁰; (2) tamponi adattati dalle condizioni necessarie per la crescita di cristalli³⁰ di MjsHSP16.5 di alta diffrazione; e (3) tamponi pr.......

Discussion

Tutti gli studi strutturali delle proteine iniziano con la purificazione delle proteine, un processo iterativo per raggiungere un equilibrio tra l'isolamento di bersagli proteici con elevata purezza e omogeneità, preservando la loro funzionalità nativa. Anche se le composizioni dei tamponi per purificare e conservare i campioni proteici sono accuratamente selezionate durante il processo di purificazione, questi tamponi rappresentano spesso una sfida durante la successiva preparazione dei.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provetta a fondo tondo da 14 mL	SPL Life Sciences	40114
250 &; Siringa a tenuta di gas L Modello 1725 LTN	Hamilton	81100	Ago cementato, calibro 22s, 2 pollici, stile punta 2
50 & micro; L Pulsante per dialisi	Hampton Research	HR3-326
Bicchiere in vetro da 50 ml	DIAMOND	HA.1010D.50
Ä KTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 Unità di filtro centrifugo	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford Reagente	Supelco	B6916
Dumoxel Style N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
Micro Centrifuga Provetta 1,5 mL	HD Micro	H23015
Provette PCR 0,2 mL, tappo piatto	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow Glow Unità di scarica	Ted Pella	91000
PELCO TEM blocco supporto griglia	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Microscopia	elettronica Cu Scienze	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC Tubi a membrana per dialisi	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
Acetato di uranile	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase Kit di screening tampone e detergenti	ThermoFisher Scientific	A49856