Articolo metodologico

Coltura gliale enterica equina e applicazione allo studio di un meccanismo infiammatorio neurale nelle coliche equine

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DOI:

10.3791/67244

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4 ottobre 2024

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1Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, NC State University

In questo articolo

Sommario

Le glia enteriche stanno diventando sempre più riconosciute per il loro ruolo nell'omeostasi intestinale e nei processi patologici, comprese le complicanze postoperatorie. I pazienti equini che si stanno riprendendo da una laparotomia esplorativa d'urgenza soffrono di un alto rischio di condizioni infiammatorie postoperatorie, evidenziando l'importanza di stabilire una coltura di cellule primarie gliali enteriche equine ripetibili per lo studio.

Abstract

Le condizioni infiammatorie postoperatorie delle coliche equine (addome acuto) contribuiscono non solo all'aumento dei costi per il cliente, del disagio del paziente e del tempo di ospedalizzazione, ma in molti casi si rivelano pericolose per la vita. Una popolazione unica di cellule intestinali, la glia enterica, è sempre più riconosciuta per il suo ruolo nel percepire l'ambiente gastrointestinale e comunicare con i tipi di cellule circostanti. Le interazioni tra la glia enterica e gli epiteli intestinali possono rivelarsi fondamentali per stabilire come la glia enterica equina possa alterare la barriera mucosa per modulare l'infiammazione in salute e le coliche.

Per studiare questa interazione, presentiamo un metodo per stabilire colture gliali enteriche equine primarie da digiuno equino ed esporre le colture a condizioni infiammatorie note per essere presenti nelle coliche. Le colture gliali enteriche primarie sono state ottenute da cavalli adulti soppressi per motivi non correlati alle coliche. I villi intestinali e la lamina propria sono stati micro-sezionati per esporre la sottomucosa. La sottomucosa isolata è stata sottoposta a digestione enzimatica con collagenasi, proteasi e albumina sierica bovina per 2-3 ore. Successivamente, la digestione meccanica che coinvolge la centrifugazione, il pipettaggio e i filtri cellulari (40-100 μm), ha prodotto un pellet utilizzato per la placcatura su pozzetti rivestiti di poli-L-lisina da 0,05 mg/mL a una concentrazione di ~400.000 cellule/300 μL di terreno.

Dopo la confluenza e il primo passaggio, le cellule gliali enteriche sono state esposte a IL-1β ricombinante equina (0, 10, 25 ng) per 24 ore. Per modellare le interazioni epiteliale-gliale al momento della colica, il terreno condizionato dalla glia enterica di controllo o trattata è stato aggiunto direttamente ai monostrati digiunali equini confluenti durante la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) utilizzando una camera EndOhm a doppio elettrodo. Questi dati dimostrano solo una delle tante potenziali applicazioni di impatto della coltura gliale enterica equina.

Introduzione

La colica equina è il reclamo medico più diffuso per la consultazione di emergenza1. Con fino al 17% di questi cavalli che richiedono una correzione chirurgica, gli sforzi per aumentare i risultati postoperatori dovrebbero essere in prima linea nella ricerca medica equina2. Attualmente, i pazienti con coliche postoperatorie presentano un alto rischio di diversi disturbi potenzialmente letali, tra cui sepsi/shock endotossico (12,3% dei pazienti) e ileo postoperatorio (13,7% dei pazienti)3. Nonostante i progressi nel trattamento delle complicanze postoperatorie, continua ad esserci la necessità di trattamenti avanzati per prevenire o trattare queste condizioni.

Recenti ricerche hanno evidenziato lo stato infiammatorio locale e sistemico dei pazienti con coliche4. Ad esempio, è stato dimostrato che le proteine proinfiammatorie come il fattore di necrosi tumorale (TNF) alfa, l'interleuchina 1β (IL-1β), l'interleuchina 6 (IL-6) e la proteina chemioattrattiva dei monociti-1, hanno tutte dimostrato di aumentare significativamente l'espressione nella mucosa intestinale delle coliche rispetto al tessuto intestinale normale4. Da un punto di vista sistemico, è stato dimostrato che l'aumento del TNF alfa nel tessuto intestinale è correlato con un aumento del rischio di reflusso nasogastrico postoperatorio superiore a 2 L, una misura generale della dismotilità postoperatoria4. È anche noto che la somministrazione di interleuchina IL-1β e TNF alfa è in grado di indurre segni clinici di shock settico5.

Una potenziale spiegazione per lo stato infiammatorio del tessuto intestinale delle coliche e il suo legame con le complicanze postoperatorie è la barriera epiteliale intestinale. In salute, i complessi di giunzione stretta che collegano il singolo strato di epitelio colonnare che riveste il tratto intestinale forniscono una barriera funzionale per limitare il contenuto luminale e i suoi componenti batterici dal raggiungere lo spazio sottomucoso e il flusso sanguigno. Tuttavia, la distensione e il danno causati dall'ostruzione intestinale associata alle coliche e dalla manipolazione intestinale durante l'intervento chirurgico possono interrompere questa funzione di barriera intestinale.

In termini di componenti funzionali della parete intestinale nel suo complesso, la rete gliale enterica sottomucosa all'interno del sistema nervoso enterico ha dimostrato di essere cruciale nello sviluppo fisiopatologico delle complicanze postoperatorie associate alle vie infiammatorie e può fornire un bersaglio terapeutico specifico 6,7,8,9 . Non solo le glia enteriche sono presenti in tutto il tratto gastrointestinale, ma agiscono come sensori dell'ambiente intestinale, influenzano la segnalazione con numerosi tipi di cellule della parete intestinale e regolano direttamente la barriera intestinale6. È quindi giustificabile presumere che questi potenti sensori dell'intestino vengano attivati da lesioni e infiammazioni e possano produrre una risposta acuta come alterazioni della permeabilità della barriera.

Questo studio è il primo a descrivere la coltura della glia enterica equina e, più specificamente, il ruolo della glia enterica equina infiammatoria sulla funzione della barriera intestinale. Qui, presentiamo i metodi di coltura primaria della glia enterica sottomucosa equina e la loro risposta all'esposizione all'IL-1β infiammatoria, la valutazione dell'effetto dei prodotti gliali enterici dopo l'esposizione all'IL-1β sulla permeabilità dei monostrati di enterociti equini e il possibile blocco attraverso l'applicazione di siero equino.

Protocollo

Le colture primarie gliali enteriche equine sono state ottenute da tre cavalli sottoposti a eutanasia umana con un sovradosaggio di un barbiturico per ragioni non correlate a questo studio. I cavalli selezionati per gli studi colturali erano cavalli adulti senza precedenti di malattia gastrointestinale.

1. Coltura primaria gliale enterica equina sottomucosa

  1. Coltiva monostrati epiteliali equini da cripte digiunali ottenute da tre cavalli equini adulti separati.
    1. Rivestire le piastre a 24 pozzetti con una soluzione di rivestimento per 2 ore a 37 °C o per una notte a temperatura ambiente, lavarle 2 volte con acqua sterile e conservarle a temperatura ambiente fino a quando le celle non sono pronte per la piastra.
    2. Dopo l'eutanasia umanitaria, entro 60 minuti, rimuovere una sezione del digiuno e metterla nella soluzione fredda di Ringer sul ghiaccio.
    3. Rimuovere una porzione di 10 cm dal digiuno e aprirla in corrispondenza del bordo anetimesenterico per mantenere le regioni non linfoidi al centro del tessuto. Taglia la porzione a una sezione di circa 7 cm x 7 cm. Sciacquare bene il fazzoletto con una soluzione fresca di Ringer prima della dissezione.
    4. Fissare il tessuto su una piastra di Petri rivestita di elastomero siliconico nella soluzione fredda di Ringer o con la mucosa PBS rivolta verso l'alto, allungando il tessuto il più possibile (Figura 1A).
    5. Rimuovere i villi intestinali con una pinza curva (Figura 1B) seguiti dallo strato di lamina propria dalla regione non linfoide di circa 5 cm x 5 cm (Figura 1C).
      NOTA: Questi strati si separano facilmente dalla sottomucosa (Figura 1B).
    6. Rimuovere la sottomucosa in un foglio liberandola con le forbici da microdissezione in un angolo e osservare la separazione naturale mentre si stacca la sottomucosa dallo strato muscolare circolare interno del digiuno (Figura 1D).
    7. Tritare lo strato sottomucoso raccolto in pezzi di 2-5 mm e metterli in una provetta conica da 50 mL contenente 5 mL di "Organo-FBS" (Tabella 1), 0,825 mg di collagenasi, 5 mg di proteasi e 20 mg di albumina sierica bovina. Incubare il tessuto per 2-3 ore a 37 °C per la digestione enzimatica.
    8. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 mL di "Organo + FBS" a temperatura ambiente per arrestare l'azione enzimatica. Pipettare la miscela di tessuto su e giù circa 15 volte con una pipetta sierologica da 10 ml per dissociare le cellule dal tessuto e quindi centrifugare a 3.000 × g per 3 minuti a temperatura ambiente.
    9. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con 10 mL di PBS a temperatura ambiente pipettandolo nuovamente su e giù circa 15 volte con una pipetta sierologica da 10 mL per dissociare le cellule dal tessuto.
    10. Centrifugare la provetta conica a 3.000 × g per 3 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con 10 mL di temperatura ambiente "Organo + FBS" pipettando su e giù circa 15x con una pipetta sierologica da 10 mL per dissociare le cellule dal tessuto.
    11. Filtrare le cellule in serie attraverso un filtro cellulare da 100 μm, 70 μm e quindi un filtro cellulare di dimensioni porabili da 40 μm.
    12. Centrifugare le celle e i terreni filtrati a 3.000 × g per 3 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di "Organo + FBS".
    13. Colorare con blu di tripano per identificare le cellule vive e contarle con un emocitometro.
    14. Seminare circa 400.000 cellule in 300 μL di "Organo + FBS" in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e aggiungere fattori di crescita a ciascun pozzetto: N2 5 μL/pozzetto, G5 5 μL/pozzetto e B27 10 μL/pozzetto. Posizionare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 per consentire alle cellule di aderire. Ventiquattro ore dopo, cambiare il terreno in "glia media" (Tabella 1) con i fattori di crescita sopra indicati e cambiare ogni 48 ore (Figura 2).

2. Citologia immunofluorescente

  1. Far crescere le cellule gliali enteriche dalla coltura primaria (P0) (passaggio 2.1.14) alla confluenza del 70-80% e farle passare una volta (P1).
  2. Fissare le cellule di coltura primaria (P0) nei pozzetti utilizzando paraformaldeide al 4% per 5 minuti prima dell'applicazione di azide PBS allo 0,1%.
  3. Preparare una soluzione di saturazione composta da azoturo PBS, siero d'asina al 4% e Triton-X allo 0,5%. Aggiungere 300 μl di soluzione di saturazione ai pozzetti per permeabilizzare le celle per 2 ore a temperatura ambiente.
  4. Aggiungere l'anticorpo primario per il marcatore gliale, la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e l'anticorpo primario per il marcatore dei fibroblasti, l'alfa actina della muscolatura liscia, a diluizioni 1:1.000 in soluzione di saturazione per l'incubazione notturna a 4 oC.
  5. Lavare 3 volte con PBS prima di aggiungere l'anticorpo secondario per l'IgG anti-coniglio d'asino Alexa Fluor 594 e la farina IgG Alexa 488 anti-topo di capra a una diluizione 1:500 in soluzione di saturazione per 2-3 ore.
  6. Colorare i nuclei con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) alla diluizione di 1:1.000 in PBS per 5 minuti.
  7. Dopo tre lavaggi con PBS, conservare le cellule in azide PBS allo 0,1%.

3. Esposizione primaria a IL-1β in coltura gliale enterica equina sottomucosa

  1. Quando le cellule del primo passaggio (P1) raggiungono il 70-80% di confluenza, eseguire l'esperimento di esposizione a IL-1β. Esporre i pozzetti a 0 ng, 10 ng e 25 ng di IL-1β per 24 ore. Dopo 24 ore, conservare e conservare il terreno da ciascun pozzetto a -80 °C.

4. Coltura di organoidi equini per la produzione di monostrati di enterociti

NOTA: Seguendo il protocollo di Stewart et al. pubblicato nel 2018, le cripte intestinali equine bancarie e le gemme che erano state crioconservate sono state ampliate per gli studi enteroidi 2D10.

  1. Utilizzare circa 700-1.000 gemme/frammenti di cripta (40.000-50.000 cellule se dissociate in singole cellule) per inserto del pozzetto trans. Rivestire gli inserti transwell con 42 μl di Matrigel allo 0,05% prima dell'aggiunta degli enterociti. Lasciare fissare il Matrigel sull'inserto incubando per 1 ora a 37 oC. Aspirare il terreno extra e lasciare asciugare i pozzetti per 30 minuti scoperti. Aggiungere 200 μl di terreno DMEM-F12 a ciascun inserto del pozzetto e conservare la piastra a 37 °C fino al momento dell'uso.
  2. Lavare le polpette Matrigel contenenti gli organoidi con PBS e poi esporle a 500 μL di Cell Recovery mentre sono in ghiaccio. Pipettarli ripetutamente per garantire la raccolta completa delle cellule in una provetta da 15 mL.
  3. Centrifugare la provetta a 300 × g per 5 minuti a 4 °C., rimuovere il surnatante e sospendere il pellet cellulare nel volume target del terreno di cellule staminali epiteliali intestinali (IESC). Calcolare il volume target moltiplicando il numero desiderato di monostrati per 200 μL di terreno. (Tabella 1).
  4. Predisporre una siringa da 1 mL in terreno IESC e aspirare la sospensione cellulare attraverso un ago da 16 G. Sostituire l'ago da 16 G con un ago da 28 G ed espellere la sospensione cellulare attraverso di esso per favorire la separazione degli organoidi.
  5. Posizionare 200 μl della sospensione cellulare risultante nel lato apicale dei pozzetti rivestiti e 500 μl di IESC e i fattori di crescita precedentemente descritti sul lato basale dell'inserto del pozzetto10. Cambiare il terreno e i fattori di crescita ogni 24-48 ore fino a raggiungere la confluenza. Definisci la confluenza come la densità delle celle corrispondente a un TEER di 1.000 ohmxcm 2,11. Per la misurazione, vedere il passaggio 5.1.

5. Permeabilità del monostrato degli enterociti equini in seguito all'esposizione a citochine infiammatorie e prodotti gliali enterici equini

  1. Utilizzare una camera di misura TEER a doppio elettrodo per quantificare il TEER attraverso i monostrati e stabilire una lettura di base su ciascuna membrana permeabile al pozzetto. Assicurarsi che il terreno IESC e il pozzetto abbiano 15 minuti per raggiungere la temperatura ambiente prima di effettuare le misurazioni. Riempire la tazza di coltura con 1,5 mL di terreno IESC e assicurarsi che siano presenti esattamente 200 μL di terreno all'interno dell'inserto del pozzetto in modo che le linee del fluido corrispondano al momento della misurazione.
  2. Esporre l'aspetto basolaterale degli inserti del transwell a citochine infiammatorie di 25 ng di IL-1β, 10 ng e 25 ng di interleuchina 6 (IL-6) per pozzetto, o a prodotti gliali di colture esposte a 10 ng o 25 ng di IL-1β. Esporre l'aspetto basolaterale degli inserti del pozzetto di controllo ai terreni gliali e ai terreni gliali provenienti da colture non esposte a IL-1β.
  3. Misurare il TEER per 45 minuti a intervalli di 10-15 minuti posizionando ciascun pozzetto nella tazza di coltura.

6. Statistiche

  1. Calcolare la variazione di piega del TEER di ciascun pozzetto per i punti temporali: 0, 10, 20, 30 e 45 min.
  2. Utilizzando il software di scelta (vedere la Tabella dei materiali), confrontare le correlazioni tra la diminuzione del TEER e l'esposizione basolaterale a IL-1β (25 ng), IL-6 (10 ng, 25 ng e 100 ng) e ai mezzi gliali (esposti a 0 ng di IL-1β, 10 ng di IL-1β e 25 ng di IL-1β) per controllare i terreni utilizzando un t-test a una coda non accoppiato.

Risultati

La microdissezione del digiuno equino nello strato sottomucoso (Figura 1) con ulteriore digestione enzimatica e meccanica, potrebbe produrre colture cellulari vitali di glia enterica equina. Le cellule hanno dimostrato un pleomorfismo con una dominanza di cellule a forma di fuso coerente con la glia enterica di altre specie (Figura 2A). Le colture erano positive per il marcatore gliale selettivo, la proteina acida fibrillare gliale (GFAP), con bassa contaminazione da fibroblasti (alfa SMA, Figura 2B). In alcuni casi, la microdissezione degli strati sottomucosi non è stata controllata in misura sufficientemente elevata e le colture sono state contaminate con alte percentuali di fibroblasti osservate attraverso l'immunofluorescenza del marcatore di fibroblasti actina della muscolatura liscia (Figura 3).

Successivamente, come esempio dell'utilità della coltura gliale enterica equina, è stato valutato l'impatto della glia enterica esposta a IL-1β sulla funzione della barriera epiteliale intestinale. L'esposizione basolaterale ai terreni provenienti da colture gliali enteriche sottomucose equine esposte a 10 ng e 25 ng di IL-1β per 24 ore ha aumentato significativamente la permeabilità (p = 0,05 e 0,04, rispettivamente, media dei terreni di controllo = 0,9, media del gruppo IL-1β gliale da 10 ng = 0,8, intervallo di confidenza al 95% = da -0,2 a 0,02, media del gruppo IL-1β da 25 ng alla glia = 0,8, Intervallo di confidenza al 95% = da -0,1995 a 0,01060, n = 3-4) (Figura 4A). Tuttavia, l'esposizione di monostrati epiteliali equini a IL-6 equina basolaterale da 10-25 ng, una citochina infiammatoria che ha dimostrato di essere prodotta dalla glia enterica esposta a IL-1β e di indurre un aumento della permeabilità degli enterociti nei modelli di roditori12, non ha aumentato significativamente la permeabilità del monostrato di enterociti equini (Figura 4B)

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Figura 1: Isolamento della glia enterica dal digiuno equino mediante microdissezione e digestione enzimatica e meccanica. (A) Il digiuno è stato tagliato lungo il bordo anetimesenterico e appuntato con la mucosa rivolta verso l'alto. (B) I villi intestinali sono stati visualizzati al microscopio e rimossi con un raschiamento delicato fino a visualizzare la sottile lamina propria. (C) Lo strato di lamina propria è stato quindi rimosso fino a quando le fibre muscolari lisce erano appena visibili attraverso la sottomucosa traslucida. (D) La sottomucosa è stata tesa e staccata dallo strato muscolare, praticando tagli alle etichette fibrose secondo necessità. Le immagini sono state ottenute con un microscopio a dissezione 10x (B,C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Imaging delle colture di glia enterica sottomucosa equina. (A) La morfologia stellata (frecce), fusiforme (punta di freccia aperta) e gangliare (punta di freccia chiusa) della glia enterica equina è stata apprezzata dalla microscopia a contrasto di fase. (B) La purezza delle colture è stata valutata mediante colorazione per GFAP e, per il marcatore dei fibroblasti, actina muscolare liscia Barre della scala = 100 mm (A), 400 mm (B). Abbreviazioni: GFAP = proteina acida fibrillare gliale; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Imaging di colture di glia enterica sottomucosa equina non riuscite. La purezza delle colture è stata valutata mediante colorazione per GFAP (rosso) e per il marcatore dei fibroblasti, actina della muscolatura liscia (verde), dimostrando un'ampia percentuale di contaminazione da fibroblasti. La punta di freccia gialla denota GFAP e l'actina di muscolatura liscia bianca della punta di freccia. Barra della scala = 400 mm. Abbreviazione: GFAP = proteina acida fibrillare gliale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: TEER monostrato epiteliale equino dopo esposizione a citochine infiammatorie e prodotti gliali infiammatori. (A) L'esposizione basolaterale a terreni provenienti da coltura di glia enterica sottomucosa equina, esposta a 10 ng e 25 ng di IL-1β per 24 ore, ha aumentato significativamente la permeabilità (*p = 0,05 e 0,04, rispettivamente, n = 3-4). (B) L'esposizione acuta al monostrato di enterociti equini a 25 ng basolaterali di IL-1β e 10-25 ng di IL-6 equina non ha aumentato significativamente la permeabilità del monostrato epiteliale equino (n = 2-4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Reagenti per l'isolamento e la coltura. I seguenti reagenti sono stati utilizzati per formulare terreni per l'isolamento della glia enterica equina, la coltura gliale enterica e la coltura di cellule staminali epiteliali intestinali equine. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare un metodo ripetibile di coltura primaria della glia enterica sottomucosa equina e dimostrare la sua applicazione per modellare le interazioni epiteliali-gliali al momento della colica. L'isolamento e la coltura enterica della glia, che è una novità nel cavallo, si è dimostrata utile nella comprensione dei percorsi delle malattie intestinali nei modelli di suini e roditori e nell'uomo 6,7,13,14. Lo studio di questa popolazione cellulare è potenzialmente importante a causa del loro ruolo come sensori subepiteliali dell'ambiente intestinale, nonché della loro capacità di interagire e comunicare con le cellule circostanti all'interno della parete intestinale. Con la loro acuta capacità di percezione, non è difficile immaginare un ruolo potenzialmente critico della glia nelle coliche equine, dove il tessuto intestinale è stressato da distensione, ischemia e potenzialmente manipolazione chirurgica6.

Il lavoro precedente di Lisowski et al. ha dimostrato l'elevato stato infiammatorio del tessuto intestinale equino al momento della chirurgia delle coliche. L'importanza di mitigare questo ambiente infiammatorio è evidenziata dalle colture di glia enterica dei roditori che si sono dimostrate in grado di sintetizzare prodotti con la capacità di interrompere la funzione della barriera intestinale 7,12. La fuoriuscita del contenuto luminale intestinale nella parete intestinale non solo porterebbe a una risposta infiammatoria, ma anche a una potenziale infiltrazione nella circolazione, che potrebbe quindi indurre shock endotossicomico/sepsi. I pazienti con coliche equine postoperatorie sono purtroppo afflitti da numerose complicanze postoperatorie su base infiammatoria, tra cui sepsi e ileo postoperatorio, che non solo riducono la sopravvivenza e il comfort del paziente, ma aumentano anche i costi per i clienti e il disagio emotivo3. Stabilire un modello di interazioni epiteliali-gliali al momento della colica può chiarire un potenziale percorso di permeabilità della barriera intestinale equina nelle coliche e una possibile prevenzione.

La coltura della glia enterica sottomucosa equina comporta adattamenti e limitazioni dovute alle caratteristiche della specie. Ancora più importante, il tempo necessario per un'efficace digestione enzimatica richiedeva la titolazione. Gli autori hanno scoperto che l'incubazione con gli enzimi per 2-3 ore a 37 °C era necessaria per il successo dell'isolamento della glia enterica equina. Inoltre, consentire alle colture enteriche equine di raggiungere oltre l'80% di confluenza prima del passaggio sembra essere dannoso per la vitalità della coltura. Il limite principale di questo metodo a questa data è la dimensione del campione. Questo studio ha coinvolto solo tessuti/cellule che erano stati ottenuti da cavalli sottoposti a chirurgia delle coliche o eutanasia per motivi non correlati allo studio. La continua coltura della glia enterica equina da altri soggetti, nonché lo sviluppo di un protocollo per il congelamento e la conservazione della glia enterica equina, aumenteranno notevolmente la potenza di questo studio.

Questo studio introduce la nuova utilità della coltura gliale enterica sottomucosa equina e della coltura primaria di enterociti equini come potenziali metodologie per aiutare a comprendere le coliche equine e la malattia gastrointestinale. Inoltre, mentre i monostrati epiteliali equini cresciuti da cripte intestinali e organoidi isolati sono stati ben consolidati in passato, questo studio non solo ha continuato a mostrare la loro utilità come modello, ma incoraggia anche ulteriori studi che esaminano l'interazione con l'enterocita intestinale equino e altri tipi di cellule che si trovano all'interno della parete intestinale.

Le interazioni osservate tra questi tipi di cellule contengono potenziali applicazioni sia per le coliche che per altri disturbi gastrointestinali infiammatori come la malattia infiammatoria intestinale (IBD) e la colite. Inoltre, il continuo perfezionamento dei metodi di coltura per la glia enterica e gli enterociti consentirà l'istituzione di studi di cocoltura in futuro. Inoltre, mentre il presente studio si concentra sulla popolazione gliale enterica sottomucosa a causa della sua vicinanza al monostrato epiteliale e dell'attenzione alla funzione di barriera intestinale, è possibile eseguire ulteriori lavori per coltivare e valutare la funzione della glia enterica equina dal plesso mienterico della parete intestinale, che può aiutare a determinare l'impatto della glia enterica equina infiammatoria sulla motilità15.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare la Morris Animal Foundation per il finanziamento di questo progetto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 M tampone HEPESGibco15630-080
10 mM HEPESLife Technologies15630-106
2 mM GlutaMAXLife Technologies25050-061
4' 6-Diaminidino-2-FenilindoloInvitrogenD3571
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
Anticorpo alfa actina muscolare lisciaAbcam7817
Amfotericina BSigmaAA95294,4 g/mL aliquote di riserva, concentrazione finale 1,1 & micro; g/mL
Antimicotico 1xGibco15240-096
B27Gibco12587010
Siero Bovino AlbuminaSigmaAA3311
BSA 50 mg/mL soluzione madreSigmaA3311
CaCL2ACROS Organiics206791000Componente di Equine Ringer ' s Brodo 1: unire ad altri ingredienti, quindi aggiungere 100 ml di questo brodo in un cilindro graduato e diluire a 1 litro con acqua deionizzata. Regolare il pH a 7,4 con il 5% di CO2,
Combinare con Equine Ringer' s Stock 2 per rendere completo " Suoneria' .
CollagenasiSigma9891
DMEM-F12 mediaThermo Fisher11320033
Donkey anti-coniglio IgG Alexa Fluor 594Invitrogen21207
EVOM EndOhm doppio elettrodo Camera di misura TEERWorld Precision InstrumentsEVM-EL-03-01
EVOM Manuale per la misurazione TEERWorld Precision InstrumentsEVM-MT-03-01
G5Gibco17503012
Soluzione di gentamicinaSigmaG1272Concentrazione finale 20 & micro; g/mL
anticorpo GFAPAbcam4674
Capra anti-topo IgG Alexa Fluor 488Invitrogen28175
IL-1β ELISAThermo FisherESIL1B
KClThermo FisherP330-500Componente di Equine Ringer' s Brodo 1: unire ad altri ingredienti, quindi aggiungere 100 ml di questo brodo in un cilindro graduato e diluire a 1 litro con acqua deionizzata. Regolare il pH a 7,4 con il 5% di CO2,
Combinare con Equine Ringer' s Stock 2 per rendere completo " Suoneria' .
Soluzione di L-glutamminaCorning25-00-Cl
MatrigelBD Bioscience354277
MgCl2Thermo FisherM33-500Componente di Equine Ringer' s Brodo 1: unire ad altri ingredienti, quindi aggiungere 100 ml di questo brodo in un cilindro graduato e diluire a 1 litro con acqua deionizzata. Regolare il pH a 7,4 con il 5% di CO2,
Combinare con Equine Ringer' s Stock 2 per rendere completo " Suoneria' .
N2Gibco17502048
Na2HPO4Thermo FisherBP332-1Componente di Equine Ringer' s Brodo 2: unire ad altri ingredienti, quindi aggiungere 100 ml di questo brodo in un cilindro graduato e diluire a 1 litro con acqua deionizzata. Regolare il pH a 7,4 con il 5% di CO2,
Combinare con Equine Ringer' s Stock 1 per rendere completo " Suoneria' .
NaClThermo FisherS271-10Componente di Equine Ringer' s Brodo 1: unire ad altri ingredienti, quindi aggiungere 100 ml di questo brodo in un cilindro graduato e diluire a 1 litro con acqua deionizzata. Regolare il pH a 7,4 con il 5% di CO2,
Combinare con Equine Ringer' s Stock 2 per rendere completo " Suoneria' .
NaH2PO4Thermo FisherBP329-500Componente di Equine Ringer' s Brodo 2: unire ad altri ingredienti, quindi aggiungere 100 ml di questo brodo in un cilindro graduato e diluire a 1 litro con acqua deionizzata. Regolare il pH a 7,4 con il 5% di CO2,
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NaHCO3Thermo FisherS637-212Componente di Equine Ringer' s Brodo 2: unire ad altri ingredienti, quindi aggiungere 100 ml di questo brodo in un cilindro graduato e diluire a 1 litro con acqua deionizzata. Regolare il pH a 7,4 con il 5% di CO2,
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Soluzione penna/streptococcoGemini400-109
Poli-L-lisinaSigmaP26360,5 mg/mL in 1x tampone borato Software prismatico
GraphPad
ProteasiSigmaP4630
Soluzione di bicarbonato di sodioSigmaS8761Soluzione madre al 7,5%

Riferimenti

  1. Tinker, M. K., et al. Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).
  2. Morton, A. J., Blikslager, A. T. Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001). Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).
  3. French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications. Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).
  4. Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection. Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).
  5. Sheats, M. K. A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils. Front Vet Sci. 6, 69(2019).
  6. Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols. Front Pharm. 11, 583422(2020).
  7. Stoffels, B., et al. Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia. Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).
  8. Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).
  9. Savidge, T. C., et al. Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione. Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).
  10. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).
  11. Hellman, S. Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics. Vet Res. 52 (1), 108(2021).
  12. Al-Sadi, R., et al. Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene. PLoS One. 9 (3), e85345(2014).
  13. Ochoa-Cortes, F., et al. Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).
  14. Ziegler, A. L., et al. Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).
  15. Grubišić, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).

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