Articolo metodologico

Esecuzione di uno screening CRISPR knockout in vitro a livello di genoma in cellule T del recettore dell'antigene chimerico

DOI:

10.3791/67338

⸱

31 gennaio 2025

 ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, 3Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Mayo Clinic, 4Center for Regenerative Biotherapeutics, Mayo Clinic, 5Division of Hematology, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

In questo articolo

Sommario

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L'articolo descrive un protocollo per l'applicazione di un modello in vitro per l'esaurimento per completare uno screening CRISPR knockout per l'intero genoma in cellule T del recettore dell'antigene chimerico del donatore sano.

Abstract

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La terapia cellulare con recettore T dell'antigene chimerico (CART) è una forma innovativa di immunoterapia mirata che ha rivoluzionato il trattamento del cancro. Tuttavia, la risposta duratura rimane limitata. Studi recenti hanno dimostrato che il panorama epigenetico dei prodotti cellulari CART preinfusionali può influenzare la risposta alla terapia e l'editing genetico è stato proposto come soluzione. Tuttavia, è necessario fare più lavoro per determinare la strategia ottimale di editing genetico. Gli screening CRISPR a livello di genoma sono diventati strumenti popolari sia per studiare i meccanismi di resistenza che per ottimizzare le strategie di editing genetico. Tuttavia, la loro applicazione alle cellule primarie presenta molte sfide. Qui descriviamo un metodo per completare uno screening CRISPR knockout per l'intero genoma in cellule CART da donatori sani. Come modello proof-of-concept, abbiamo progettato questo metodo per studiare lo sviluppo dell'esaurimento nelle cellule CART che hanno come bersaglio l'antigene CD19. Tuttavia, riteniamo che questo approccio possa essere utilizzato per affrontare una varietà di meccanismi di resistenza alla terapia in diversi costrutti CAR e modelli tumorali.

Introduzione

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La terapia cellulare con recettore T dell'antigene chimerico (CART) ha mostrato un successo impressionante nel trattamento delle neoplasie maligne delle cellule B; Tuttavia, la risposta duratura è limitata al 30-40%1,2,3,4,5. Mentre i ricercatori hanno sviluppato e testato diversi approcci per affrontare i meccanismi di resistenza alla terapia cellulare CART, tra cui l'ottimizzazione della progettazione CAR, l'editing genico e le terapie combinate, lo sviluppo della resistenza rimane in gran parte sconosciuto. Recentemente, è stato dimostrato che il profilo di espressione genica di base dei prodotti cellulari CART preinfusionali è un importante determinante sia della tossicità che dell'efficacia della terapia CART 6,7,8,9. Pertanto, l'editing genetico durante la produzione di cellule CART è diventato un approccio popolare per migliorare il successo della terapia cellulare CART.

Ad esempio, il nostro laboratorio ha precedentemente dimostrato che l'utilizzo della tecnologia Cas9 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) per eliminare il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) migliora l'attività delle cellule CART e riduce i segni di tossicità associata a CART 10,11,12. Inoltre, la terapia cellulare ingegnerizzata con CRISPR è stata testata in studi clinici e ha dimostrato efficacia e sicurezza13. Insieme, ciò indica che l'editing genetico con la tecnologia CRISPR può non solo migliorare la nostra comprensione della biologia cellulare CART, ma anche generare prodotti cellulari CART traducibili.

Gli screening knockout CRISPR a livello di genoma sono diventati strumenti sempre più popolari nella ricerca sulla biologia del cancro per comprendere i meccanismi di resistenza alle terapie. In questa tecnica, decine di migliaia di RNA guida (gRNA) vengono consegnati a pool di cellule per incoraggiare l'ingresso di un gRNA per cellula14. Quindi, le cellule subiscono condizioni che inducono pressione in cui le cellule trasdotte con gRNA che prendono di mira geni essenziali muoiono e le cellule trasdotte con gRNA che prendono di mira i geni inibitori sopravvivono e proliferano. Utilizzando il sequenziamento di nuova generazione, possiamo determinare come cambia la rappresentazione del gRNA durante lo schermo CRISPR14.

Tuttavia, la scala e il tempo di selezione necessari per le perturbazioni geniche dell'intero genoma possono essere difficili da realizzare nelle cellule primarie, come le cellule CART. Pertanto, i gruppi hanno utilizzato screening CRISPR mirati per comprendere ulteriormente i meccanismi della resistenza terapeutica15,16. Le schermate mirate sono spesso più facili da completare nelle celle primarie perché hanno librerie più piccole che richiedono meno celle per ottenere un'adeguata rappresentazione della libreria. Mentre questi studi hanno migliorato la nostra comprensione dei meccanismi di resistenza alla terapia cellulare CART, gli screening mirati introducono un bias dovuto alla selezione manuale dei bersagli genici. Questo articolo cerca di descrivere un metodo per completare uno screening knockout CRISPR in vitro per l'intero genoma in cellule CART da donatori sani. In quanto tale, questo approccio ad alto rendimento consente un'identificazione efficiente e imparziale di percorsi e geni chiave che possono essere modificati per migliorare le risposte terapeutiche 17,18,19.

In particolare, il protocollo descritto in questo articolo è progettato per aumentare la comprensione del campo dell'esaurimento cellulare CART completando lo screening di knockout CRISPR a livello di genoma con un modello in vitro per l'esaurimento. L'esaurimento è un destino disfunzionale delle cellule CART che è stato implicato nella mancata risposta alla terapia cellulare CART 20,21,22. Questo destino cellulare è noto per essere epigeneticamente regolato ed è caratterizzato da una diminuzione della proliferazione delle cellule CART, una diminuzione della produzione di citochine effettrici e un aumento dell'espressione dei recettori inibitori23. Nella letteratura precedente, l'editing genetico è stato in grado di prevenire lo sviluppo dell'esaurimento attraverso la sovraregolazione o la sottoregolazione dei geni chiave 24,25,26. Data sia la diminuzione della capacità proliferativa quando le cellule CART si esauriscono sia l'evidenza che l'editing genetico può prevenirne l'insorgenza, abbiamo modellato il nostro schermo di knockout CRISPR in vitro su questo destino cellulare. Tuttavia, questo protocollo potrebbe essere modificato in futuro per esplorare altri meccanismi di resistenza alla terapia cellulare CART.

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Protocollo

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È importante sottolineare che il protocollo descritto di seguito segue le linee guida e ha ricevuto l'approvazione dell'Institutional Review Board della Mayo Clinic (IRB 18-005745) e dell'Institutional Biosafety Committee (IBC HIP00000252.43). Tutte le operazioni di coltura cellulare, compresa la produzione di lentivirali, devono essere eseguite in una cappa per colture cellulari con adeguati dispositivi di protezione individuale. In particolare, il lavoro sui lentivirali deve essere condotto con le precauzioni di biosicurezza di livello 2 (BSL-2), compreso l'uso di candeggina al 10% per disinfettare gli articoli prima dello smaltimento.

1. Amplificazione della libreria CRISPR

  1. Amplifica la libreria CRISPR secondo le raccomandazioni del produttore. In breve, elettrorizzare la libreria CRISPR in quattro aliquote di celle elettrocompetenti completando quanto segue:
    1. Aggiungere 2 μL di plasmide della libreria CRISPR da 50 ng/μL a 25 μL di celle elettrocompetenti in una cuvetta da 1,0 mm.
    2. Elettrorizzare i campioni utilizzando le seguenti impostazioni: 10 μF, 600 Ohm, 1.800 volt e una costante di tempo compresa tra 3,5 ms e 4,5 ms.
    3. Recuperare in 975 μL di terreno di recupero e trasferire in una provetta con 1 mL di terreno di recupero aggiuntivo.
    4. Ruotare tutte le aliquote a 250 giri/min per 1 ora a 37 °C.
  2. Piastra le trasformazioni:
    1. Raggruppare tutte le aliquote di celle elettroporate e mescolare bene.
    2. Piastra tutte le celle elettroporate distribuendo 400 μl della miscela di trasformazione su piastre preriscaldate da 10 cm di brodo Luria (LB) con 100 μg/mL di carbenicillina. Porre la piastra in un'incubatrice a 32 °C per 14 ore.
  3. Raccogli le colonie:
    1. Pipettare 1 mL di terreno LB + 100 μg/mL di carbenicillina su ciascuna piastra. Raschiare le colonie da ogni piastra e raccoglierle in una provetta conica da 50 ml.
    2. Aggiungere un altro 1 mL di terreno LB + 100 μg/mL di carbenicillina a ciascuna piastra per lavare e garantire il completo recupero.
    3. Eseguire una maxi-preparazione seguendo le istruzioni di un kit di maxi-preparazione.
    4. Raggruppare il DNA plasmidico risultante.

2. Sequenziamento di nuova generazione per verificare la rappresentazione del gRNA al basale nella libreria CRISPR

NOTA: I primer NGS per questa libreria CRISPR sono stati progettati in una precedente pubblicazione27. L'uso di un primer inverso diverso per ogni campione codificherà ogni campione e consentirà il raggruppamento dei campioni durante il sequenziamento.

  1. Preparare i campioni per la PCR con la seguente miscela di reazione (volume totale = 50 μl): master mix PCR ad alta fedeltà, 2x: 25 μl; DNA stampo aggregato, 0,5 μg: 1 μL; Primer diretto della libreria NGS, 10 μM: 1,25 μL; Primer inverso della libreria NGS, 10 μM: 1,25 μL; Acqua priva di DNasi: 21,5 μL.
  2. Eseguire la PCR con le seguenti condizioni cicliche: ciclo 1: denaturazione a 98 °C per 3 min; cicli 2-23: denaturazione a 98 °C per 10 s, ricottura a 63 °C per 10 s, prolungamento a 72 °C per 25 s; ciclo 24: prolungare a 72 °C per 2 min.
  3. Purificare la reazione PCR raggruppando le reazioni PCR per ciascun campione e purificando il prodotto PCR con un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore.
  4. Eseguire 3 μg del prodotto PCR per ciascun campione su un gel di agarosio al 2% (p/v).
  5. Rimuovere il prodotto PCR (~260-270 bp) dal gel estraendo il DNA dal gel utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore. Puntare ad almeno 500 ng di DNA.
  6. Conservare i campioni estratti a -20 °C.
  7. Esegui il sequenziamento di nuova generazione (NGS) con i campioni e punta a 100 letture per gRNA27.
  8. Analizza i risultati del sequenziamento con la pipeline MAGeCK-VISPR e assicurati che oltre il 99,5% dei gRNA nella libreria siano rappresentati28.

3. Produzione della libreria CRISPR e dei lentivirus di espressione CAR

  1. Preparare il lentivirus come descritto in precedenza10,29.
    1. Giorno 1: Iniziare con fiasche T175 di cellule 293T confluenti all'80-90% che sono cresciute in terreni D10 composti per il 10% da siero fetale bovino (FBS) (v/v), penicillina-streptomicina-glutammina (PSG) all'1% (v/v) e terreno di coltura dell'aquila modificato di Dulbecco. Prima di iniziare, scaldare i reagenti di trasfezione e il DNA a temperatura ambiente e quantificare il DNA.
    2. Per ogni matraccio da 293 T, etichettare due provette coniche da 50 mL A e B. Aggiungere 4,5 mL di terreno sierico ridotto alla provetta A e alla provetta B.
    3. In una provetta da microcentrifuga sterile da 1,5 mL, mescolare il seguente DNA e lasciare riposare per 1 minuto: 18 μg di pCMVR8.74 (gag, pol, tat e rev), 7 μg di pMD2.G (VSV-G) e 15 μg di vettore di espressione lentivirale (libreria CRISPR A o vettori CAR19-28ζ).
    4. Aggiungere 129 μl di reagente di trasfezione alla provetta A. Mescolare bene il tubo A con il vortice delle dita.
    5. Aggiungere la miscela di DNA alla provetta B. Mescolare bene il tubo B con il vortice delle dita.
    6. Aggiungere 111 μl di reagente colipidico neutro alla provetta B. Mescolare bene il tubo B con il vortice delle dita.
    7. Aggiungere il contenuto del tubo A al tubo B e mescolare bene con il vortice delle dita. Incubare la provetta B per 30 minuti a temperatura ambiente.
    8. Verso la fine del periodo di incubazione di 30 minuti, preparare le cellule 293T aspirando il terreno esistente. Aggiungere 16 mL di terreno R10 composto da 10% FBS (v/v), 1% PSG (v/v) e Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
    9. Dopo il periodo di incubazione di 30 minuti, aggiungere il contenuto della provetta B (circa 9 mL) goccia a goccia nel pallone di cellule 293T. Appoggiare il matraccio e ruotarlo delicatamente prima di incubarlo a 37 °C, 5% CO2.
    10. Il giorno 2 (circa 24 ore dopo la trasfezione), raccogliere il lentivirus come segue:
      NOTA: Preraffreddare tutte le apparecchiature e i materiali ed eseguire le seguenti operazioni sul ghiaccio per mantenere freddo il surnatante virale.
      1. Trasferire il surnatante dai matracci 293T trasfettati in provette coniche preraffreddate da 50 mL.
      2. Aggiungere 30 mL di terreno R10 preriscaldato ai matracci 293T.
      3. Pellettare i detriti cellulari centrifugando le provette coniche da 50 mL a 900 × g per 10 minuti a 4 °C in rotori chiusi.
      4. Dopo la centrifugazione, filtrare il surnatante con un filtro da 0,45 μm. Centrifugare il filtrato in un'ultracentrifuga a 112.700 × g a 4 °C per 2 ore.
      5. Dopo la centrifuga di 2 ore, aspirare il surnatante fino a quando rimangono circa 5 mL. Risospendere le particelle virali pipettando delicatamente su e giù 10x. Conservare la sospensione virale a 4 °C per una notte.
    11. Il giorno 3, raccogli e conserva il lentivirus come segue:
      1. Trasferire il surnatante dai matracci 293T trasfettati in provette coniche preraffreddate da 50 mL.
      2. Aggiungere 30 ml di candeggina al 10% ai palloni 293T.
      3. Pellettare i detriti cellulari nel surnatante centrifugando le provette coniche da 50 mL a 900 × g per 10 minuti a 4 °C in rotori chiusi.
      4. Dopo la centrifugazione, filtrare il surnatante con un filtro da 0,45 μm. Centrifugare il filtrato in un'ultracentrifuga a 112.700 × g a 4 °C per 2 ore.
      5. Dopo la centrifuga di 2 ore, aspirare il surnatante fino a quando rimangono circa 2 mL e risospendere pipettando delicatamente su e giù 10 volte. Conservare il surnatante virale in aliquote da 300-500 μL e conservare a -80 °C.

4. Calcolo del titolo virale per lentivirus che esprime CAR

NOTA: Il lentivirus CAR è stato titolato come precedentemente descritto 10,12.

  1. Il giorno 1, attiva e piasta le cellule T.
    1. Isolare 1 × 106 cellule T da PBMC di donatori sani utilizzando un kit di selezione negativa.
    2. Conta le cellule T.
    3. Lavare una quantità sufficiente di perle CD3+/CD28+ per stimolare le cellule T con un rapporto perline:cellule di 3:1. Ad esempio, per stimolare 1 × 106 cellule T, lavare 3 × 106 perline. Per farlo, lavate le perline completando le seguenti 3 volte:
      1. Utilizzare la separazione magnetica per rimuovere le perline dalla sospensione.
      2. Rimuovere il surnatante.
      3. Aggiungere 1000 μl di terreno di coltura a cellule T (MTC) composto per il 10% da siero umano (v/v), per l'1% da PSG (v/v) e da terreno cellulare ematopoietico.
        NOTA: La MTC deve essere sterilizzata prima dell'uso filtrandola con un filtro per vuoto sterile da 0,45 μm e quindi con un filtro per vuoto sterile da 0,22 μm.
      4. Aggiungere le perline alla sospensione delle cellule T con un rapporto perlina:cella 3:1.
      5. Risospendere le cellule T a 1 × 106 cellule/mL in MTC.
      6. Aggiungere 100 μl di cellule T attivate a 10 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra a 37 °C, 5% CO2.
  2. Il giorno 2, aggiungere una diluizione di lentivirus CAR creando una piastra di diluizione come segue:
    1. Aggiungere 100 μl di TCM a sette pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
    2. Al primo pozzetto, aggiungere 50 μL del virus di interesse; Mescolate bene.
    3. Diluire ulteriormente il virus in serie aggiungendo 50 μl dal pozzetto 1 al pozzetto 2; Mescolate bene.
    4. Aggiungere 50 μl dal pozzetto 2 al pozzetto 3 e continuare questo schema fino al pozzetto 7.
    5. Dopo aver miscelato il pozzetto 7, rimuovere 50 μl. Assicurarsi che tutti i pozzetti abbiano un volume totale di 100 μl.
    6. Aggiungere 50 μl da ciascun pozzetto della piastra di diluizione ai primi sette pozzetti della piastra delle cellule T dal giorno 1. Mescola bene.
    7. Agli ultimi tre pozzetti della piastra delle cellule T, aggiungere 50 μL di MTC; Mescolate bene. Conservare la piastra in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO2.
  3. Il giorno 3, alimentare le cellule aggiungendo 100 μL di MTC a tutti i pozzetti della piastra delle cellule T; Mescolate bene.
  4. Il giorno 4, eseguire la citometria a flusso per rilevare la percentuale di cellule che esprimono CAR con un anticorpo anti-catena kappa, un marcatore surrogato per l'espressione di CAR, completando quanto segue:
    1. Centrifugare la piastra delle cellule T a 1.000 × g per 3 minuti e decantare.
    2. Lavare la piastra 3 volte con tampone anticorpale anti-catena kappa (composto dal 4% di albumina sierica bovina in PBS (p/v)) aggiungendo 200 μl di tampone anticorpale anti-catena kappa, centrifugando la piastra a 1.000 × g per 3 minuti e decantando.
    3. Aggiungi un anticorpo anti-catena anti-kappa della biotina a ciascun pozzetto. Incubare per 45 minuti su un bilanciere a 4 °C.
    4. Lavare la piastra 3 volte con tampone anticorpale anti-catena kappa come al punto 4.4.2.
    5. Colorare le cellule per la citometria a flusso con un anticorpo streptavidina coniugato con fluorocromo e un anticorpo vivo/morto. Incubare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
    6. Lavare i campioni una volta nel tampone di flusso (composto da 2% FBS (v/v) e 1% di sodio azide (v/v) in PBS) aggiungendo 200 μl di tampone di flusso, centrifugando la piastra a 1.000 × g per 3 minuti e decantando.
    7. Risospendere in 100 μL di tampone di flusso ed eseguire sul citometro.
    8. Eseguire il gating negativo con i tre pozzetti non trasdotti.

5. Calcolo del titolo virale per il lentivirus della libreria CRISPR

NOTA: Questo protocollo descrive un numero minimo di cellule T per la titolazione del lentivirus della libreria CRISPR, ma può essere ingrandito per ospitare più cellule T e quindi volumi più elevati di virus.

  1. Il giorno 0, attivare le cellule T aggiungendo 18 × 10 6 perleCD3+/CD28+ (rapporto 3:1 perline:cellule) a 6 × 106 cellule T e portando il volume finale a 6 ml con MTC. Aliquotare 0,5 mL della sospensione di cellule T in 12 pozzetti di una piastra a 48 pozzetti. Conservare in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO2.
  2. Ventiquattro ore dopo, il primo giorno, aggiungere il virus CAR a una molteplicità di infezione (MOI) di 3 a ogni pozzo. Mescolare bene pipettando su e giù più volte. Conservare in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO2.
  3. Quarantotto ore dopo, il giorno 2, aggiungere una serie di volumi di virus della libreria CRISPR alle cellule CART attivate aggiungendo uno dei seguenti volumi di virus CRISPR a ciascun pozzetto (0 μL, 0 μL, 6,25 μL, 6,25 μL, 12,5 μL, 12,5 μL, 25 μL, 25 μL, 50 μL, 50 μL, 100 μL o 100 μL). Mescolare bene pipettando su e giù più volte. Conservare in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO2.
  4. Il giorno 3, aggiungere 1 μg di puromicina per mL di terreno a metà dei pozzetti, incluso un pozzetto che ha ricevuto ciascuno dei seguenti volumi di virus CRISPR (0 μL, 6,25 μL, 12,5 μL, 25 μL, 50 μL e 100 μL). Gli altri pozzetti non saranno trattati con puromicina.
  5. Dal giorno 4 all'8, contare le cellule T ogni giorno e regolare la densità cellulare finale a 1 × 106 cellule/mL con 1 μg/mL di puromicina nella MTC per i pozzetti di trattamento con puromicina e con MTC per i pozzetti non trattati.
  6. Il giorno 8, contare il numero di cellule vive per pozzetto e calcolare le unità di trasduzione/mL di surnatante virale utilizzando la seguente equazione:
    figure-protocol-1
    Dove A: la conta delle cellule vive è trasdotta viralmente bene; B: Conta delle cellule vive in pozzetto di controllo senza selezione antibiotica; V: Volume del virus utilizzato per l'infezione in ciascun pozzetto; D: Piega di diluizione.
  7. Utilizzando il pozzetto TU/mL calcolato da un pozzetto che mostra un'efficienza di trasduzione di circa il 20%, calcolare il volume di virus necessario per trasdurre 1 × 106 cellule con un MOI di 0,3 utilizzando la seguente formula:
    figure-protocol-2

6. Fase di produzione delle celle CART del vaglio CRISPR (giorni 0 - 8)

NOTA: Il protocollo che segue descrive il completamento dello screening CRISPR in una replica biologica. Tuttavia, questo protocollo è stato precedentemente convalidato con tre repliche biologiche e si raccomanda l'uso di almeno tre repliche biologiche per gli altri che completano questo protocollo30.

  1. Giorno 0: Isolare e stimolare le cellule T dal sangue sano del donatore come descritto in precedenza10.
    1. Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue di un donatore sano non identificato.
      1. Aggiungere 15 mL di un mezzo a gradiente di densità a una provetta di separazione a gradiente di densità.
      2. Aggiungere sangue diluito 1:2 alla sommità della provetta di separazione a gradiente di densità. Centrifugare a 1.200 × g per 10 min a temperatura ambiente.
        NOTA: Il sangue deve essere diluito con tampone di isolamento (2% FBS (v/v) in soluzione salina tamponata con fosfato [PBS]).
      3. Svuotare lo strato superiore in una nuova provetta conica da 50 mL e raddoppiare il volume con il tampone di isolamento. Centrifugare il campione a 300 × g per 8 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante.
      4. Risospendere il pellet della cella con il tampone di isolamento e contare le PBMC.
    2. Isolare le cellule T dalle PBMC utilizzando un kit di selezione negativa. Seguire le istruzioni del produttore del kit.
      NOTA: Supponiamo un recupero del 10-20% delle cellule T dalle PBMC.
    3. Stimolare le cellule T con le perle CD3+/CD28+ .
      1. Conta le cellule T.
      2. Aliquotare una quantità sufficiente di perle CD3+/CD28+ per stimolare le cellule T con un rapporto perlina:cellula di 3:1. Ad esempio, per stimolare 110 × 106 cellule T, aliquote 330 × 106 perline. Lavare le perle 3 volte separando prima le perle dalla sospensione con la separazione magnetica e poi aggiungendo 1.000 μl di TCM.
      3. Aggiungere le perline alla sospensione delle cellule T. Risospendere le cellule T a 1 × 106 cellule/mL in MTC.
      4. Aliquotare le cellule T in piastre a 6 pozzetti per la migliore efficienza di trasduzione. Aggiungere 5 × 106 cellule T a ciascun pozzetto. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
  2. Giorno 1: In condizioni BSL-2+, scongelare abbastanza lentivirus CAR per trasdurre le cellule T con una molteplicità di infezione di 3.0. Rompere delicatamente le rosette delle cellule T prima di aggiungere la quantità appropriata di lentivirus raggruppato per trasdurre 5 × 106 cellule T con un MOI di 3,0. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2.
    NOTA: Raggruppare il lentivirus da più produzioni in un'unica provetta prima di trasdurre le cellule T. Ciò garantisce che tutte le cellule T ricevano lo stesso trattamento. Inoltre, il lentivirus deve essere scongelato solo una volta.
  3. Giorno 2: In condizioni BSL-2+, scongelare una quantità sufficiente di lentivirus CRISPR per trasdurre le cellule T a un MOI di 0,3. Rompere delicatamente le rosette delle cellule T e risospendere le cellule T prima di aggiungere la quantità appropriata di lentivirus raggruppato per trasdurre 5 × 106 cellule T con un MOI di 0,3. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2.
    NOTA: Raggruppare il lentivirus da più produzioni in un'unica provetta prima di trasdurre le cellule T. Ciò garantisce che tutte le cellule T ricevano lo stesso trattamento.
  4. Giorni 3 - 5: Risospendere le celle CART per rompere le rosette e contare le cellule. Portare la concentrazione cellulare finale a 1 × 106 cellule/mL in MTC con 1 μg/mL di puromicina. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2.
  5. Giorno 6: Risospendere le cellule CART per rompere le rosette, rimuovere le perle CD3+/CD28+ attraverso la separazione magnetica e contare le cellule CART. Aggiungere la MTC con 1 μg/mL di puromicina per portare la concentrazione finale delle cellule a 1 × 106 cellule/mL e incubare le cellule a 37 °C, 5% di CO2. Determinare l'espressione di CAR con la citometria a flusso come descritto al punto 4.4.

7. Fase di selezione del gRNA dello screening CRISPR (Giorni 8 - 22)

  1. Giorno 8: Conservazione dei campioni per il sequenziamento di nuova generazione (NGS) e avvio della co-coltura.
    1. Lavare le celle CART 3 volte in MTC centrifugando i campioni a 300 × g per 5 minuti a 4 °C, aspirando il surnatante e risospendendo i campioni in 20 mL di MTC.
    2. Conta le celle CART.
    3. Conservare i campioni per NGS completando le seguenti operazioni:
      1. Aliquotare un numero sufficiente di cellule CART in una provetta conica da 50 mL per mantenere una rappresentazione di gRNA di 500 cellule per gRNA (ad esempio, aliquotare circa 33 × 106 cellule CART se si utilizza una libreria CRISPR con 65.383 gRNA). Centrifugare il campione a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
      2. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 2 mL. Lavare la provetta conica da 50 mL con 1 mL di PBS e trasferire il lavaggio nella provetta da microcentrifuga da 2 mL.
      3. Centrifugare i campioni a 500 × g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante. Conservare i pellet delle celle a -20 °C.
      4. Iniziare la co-coltura aggiungendo cellule CART alle cellule CD19+ JeKo-1 con un rapporto 1:1. Ad esempio, aggiungere 80 × 10celle 6 CART a 80 celle × 106 celle JeKo-1. Portare il volume totale della co-coltura a 160 ml con MTC. Conservare i campioni in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.
        NOTA: Si consiglia di iniziare con almeno 80 × 10celle 6 CART per mantenere la rappresentazione della libreria e avere abbastanza celle per conservare i campioni al giorno 15 e al giorno 22.
  2. Giorno 10: Per ristimolare le cellule CART, raccogliere le co-colture in provette coniche da 50 mL e centrifugare i campioni a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere ogni campione in 80 mL di MTC e aggiungere 80 × 106 cellule JeKo-1 in 80 mL di MTC. Conservare i campioni in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.
  3. Giorni 12 e 14: Ristimolare le cellule CART come al punto 7.2.
  4. Giorno 15: Conservare i campioni per NGS e ristimolare le cellule CART.
    1. Isolare le cellule CART dalla co-coltura contando prima le cellule e poi combinando un kit di selezione positiva per le cellule T CD4+ con un kit di selezione positiva per le cellule T CD8+ per isolare le cellule T dalle co-colture CART-JeKo-1. Conta le cellule T.
    2. Conservare i campioni per NGS aliquotando 33 × 10 celle6 CART in una provetta conica da 50 mL e centrifugando il campione a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere il campione in 1 mL di PBS e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 2 mL. Lavare la provetta conica da 50 mL con 1 mL di PBS e trasferire il lavaggio nella provetta da microcentrifuga da 2 mL. Centrifugare i campioni a 500 × g per 5 minuti a 4 °C; rimuovere il surnatante; e conservare i pellet delle celle a -20 °C.
    3. Impostare le co-colture per continuare il modello in vitro per l'esaurimento aggiungendo 80 × 106 cellule CART a 80 × 106 cellule JeKo-1. Quindi, portare il volume totale della co-coltura a 160 ml con MTC. Conservare i campioni in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.
  5. Giorni 17, 19 e 21: Ristimolare le cellule CART come al punto 7.2.
  6. Giorno 22: Conservare i campioni per NGS.
    1. Isolare le cellule CART dalla co-coltura contando prima le cellule. Quindi, combinare un kit di selezione positiva per le cellule T CD4+ con un kit di selezione positiva per le cellule T CD8+ per isolare le cellule T dalle co-colture CART-JeKo-1. Conta le cellule T.
    2. Per conservare i campioni per NGS, ripetere il passaggio 7.4.2.

8. Preparazione del DNA genomico per il sequenziamento di nuova generazione

NOTA: Per mantenere una copertura adeguata, il DNA genomico (gDNA) deve essere isolato da almeno 33 × 106 cellule CART. Inoltre, l'intero gDNA di 33 × 10cellule 6 CART deve essere preparato per il sequenziamento.

  1. Isolare il gDNA dai pellet cellulari congelati utilizzando un kit di isolamento del gDNA.
  2. Purificare il gDNA attraverso la precipitazione con etanolo.
    1. Preraffreddare 100% EtOH a -20 °C.
    2. Aliquot eluito di DNA in modo uniforme in diverse provette per microcentrifuga (200-250 μL). Aggiungere a ciascuna aliquota i seguenti volumi: due volumi di 100% EtOH (500 μl per 250 μl di aliquota o 400 μl per 200 μl); 0,1 volume di acetato di sodio 3 M (25 μl per 250 μl di aliquota o 20 μl per 200 μl); e 1 μL di glicogeno 20 mg/mL. Incubare i campioni per una notte a -20 °C.
    3. Il secondo giorno, centrifugare i campioni a 13.000 × g per 20 minuti per pellettare il DNA precipitato. Rimuovere il surnatante. Lavare i pellet con 1 mL di EtOH al 70% centrifugando a 7.500 × g per 10 min.
    4. Rimuovere completamente l'EtOH residuo. Lasciare asciugare il pellet per 30-45 minuti.
    5. Risospendere i pellet in 50 μL di acqua sterile.
  3. Preparare il gDNA per NGS.
    NOTA: I primer NGS per questa libreria CRISPR che amplificano i gRNA con sequenze di adattatori Illumina sono stati progettati in una precedente pubblicazione27. L'uso di un primer inverso diverso per ogni campione codificherà ogni campione e consentirà il raggruppamento dei campioni durante il sequenziamento.
    1. Preparare i campioni per la PCR con la seguente miscela di reazione (volume totale = 50 μl): master mix PCR ad alta fedeltà, 2x: 25 μl; DNA stampo aggregato, 0,5 μg: 1 μL; Primer diretto della libreria NGS, 10 μM: 1,25 μL; Primer inverso della libreria NGS, 10 μM: 1,25 μL; Acqua priva di DNasi: 21,5 μL.
    2. Eseguire la PCR con le seguenti condizioni cicliche: ciclo 1: denaturazione a 98 °C per 3 min; cicli 2-23: Denature 98 °C per 10 s, ricottura a 63 °C per 10 s, prolungamento a 72 °C per 25 s; ciclo 24: prolungare a 72 °C per 2 min.
    3. Raggruppare le reazioni PCR per ciascun campione e purificare il prodotto PCR con un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore.
    4. Eseguire 3 μg del prodotto PCR per ciascun campione su un gel di agarosio al 2% (p/v).
    5. Rimuovere il prodotto PCR (~260-270 bp) dal gel estraendo il DNA dal gel utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore. Conservare i campioni estratti a -20 °C.
    6. Eseguire il sequenziamento di nuova generazione (NGS) con i campioni. Punta a più di 500 letture per gRNA nella libreria.

9. Analisi dei risultati del sequenziamento

  1. Per analizzare NGS, utilizzare la piattaforma MAGeCK-VISPR28. Utilizzare le impostazioni standard per l'algoritmo MAGeCK-MLE (Maximum Likelihood Estimation). Per preparare i file di output per l'analisi:
    1. Eseguire FASTQC per valutare la qualità del file di sequenza31.
    2. Unisci i file di sequenziamento paired-end per ogni campione con bbmerge32.
    3. Analizza i campioni nella piattaforma MAGeCK-VISPR con l'algoritmo MAGeCK-MLE. Per l'analisi MAGeCK-MLE, normalizzare tutti i conteggi di gRNA nell'elenco di 1.000 gRNA non mirati.
    4. Valutare la qualità dei file di sequenziazione valutando il contenuto GC, la qualità di base, le letture di sequenziazione e le letture mappate.
    5. Valutare il successo della fase di pressione selettiva dello screening CRISPR valutando i cambiamenti nell'indice di Gini, il clustering dell'analisi delle componenti principali (PCA) e i percorsi associati all'elenco dei geni selezionati negativamente32.
    6. Interroga i risultati più importanti conducendo ricerche bibliografiche ed eseguendo analisi del percorso.

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Risultati

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Per interrogare i geni e i percorsi che possono essere modificati per migliorare l'attività delle cellule CART in modo imparziale, abbiamo progettato uno schermo di knockout CRISPR in vitro per l'intero genoma (Figura 1). Questo vaglio ha due fasi: una fase di produzione della cella CART e una fase di pressione selettiva. Nella fase di produzione delle cellule CART, almeno 110 × 106 cellule T vengono prima isolate da PBMC di donatori sani e attivate con perline CD3+<...

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Discussione

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L'editing genetico è diventato uno strumento potente sia per comprendere i meccanismi di resistenza alle terapie, sia per progettare nuove terapie cellulari CART per migliorare la longevità e l'attività delle cellule CART 16,17,26. Mentre alcune strategie di editing genetico hanno mostrato miglioramenti nell'attività delle cellule CART sia nei modelli preclinici che negli studi clinici, c'è anco...

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Dichiarazioni

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SSK è un inventore di brevetti nel campo dell'immunoterapia CAR concessi in licenza a Novartis (attraverso un accordo tra Mayo Clinic, University of Pennsylvania e Novartis), Humanigen (attraverso Mayo Clinic), Mettaforge (attraverso Mayo Clinic) e MustangBio (attraverso Mayo Clinic) e Chymal therapeutics (attraverso Mayo Clinic). CS, CMR e SSK sono inventori di brevetti concessi in licenza a Immix Biopharma. SSK riceve finanziamenti per la ricerca da Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc. e Lentigen. SSK ha partecipato a riunioni consultive con Kite/Gilead, Calibr, Luminary Therapeutics, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio e Novartis. SSK ha fatto parte del comitato di monitoraggio e sicurezza dei dati con Humanigen e Carisma. SSK ha licenziato un consulente per Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, BMS, Carisma e Humanigen. CMS e SSK sono inventori della proprietà intellettuale derivante da questo protocollo.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato in parte finanziato dal Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK), dal Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center (SSK), dal Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics (SSK), dal National Institutes of Health K12CA090628 (SSK) e dal R37CA266344-01 (SSK), dal Department of Defense grant CA201127 (SSK), dalla Predolin Foundation (SSK) e dalla Minnesota Partnership for Biotechnology and Medical Genomics (SSK). CMS è supportato dalla Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences. Lo schema dello schermo CRISPR (Figura 1) è stato creato con BioRender.com (Siegler, L. (2022) https://BioRender.com/k71r054).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cellule 293TATCCCRL-3216Cellule utilizzate per la produzione di lentivirus
Anticorpo Biotina ProteinL GenScriptM00097Anticorpo anti-catena kappa per il rilevamento CAR
Siero bovino AlbuminaMillipore SigmaA7906
Carbenicillina sale disodicoMillipore SigmaC1389-1GCarbenicillina antibiotico
CD4 Isolamento PerlineMiltenyi Biotec130-045-101 
Perle isolanti CD8Miltenyi Biotec130-045-201
CTS (sistemi di terapia cellulare) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoflexBeckman CoulterNC2279958
Acqua priva di DNasiInvitrogenAM9937
Mezzo dell'aquila modificata di Dulbecco (DMEM)Corning10-017-CV
tampone fosfato di DulbeccoGibco14190-144
EasySepSTEMCELL Technologies17951RFKit di isolamento negativo
Endura Electrocompetent Cells Biosearch Technologies60242-1Cellule elettrocompetenti con terreno di recupero
EtanoloMillipore SigmaE7023
Siero fetale bovino (FBS)Corning35-010-CV
GeCKO v2 CRISPR Knockout Pooled Library A AddGene1000000048CRISPR library plasmid
Gene Pulser II Bio-Rad165-2105Elettroporatore
GlicogenoMillipore Sigma10901393001
JeKo-1ATCCCRL-3006CD19+ cellule bersaglio 
Reagente per trasfezione Lipofectamine 3000ThermoFisher ScientificL3000075Kit di reagenti per trasfezione con un reagente per trasfezione (Lipofectamine 3000 Reagent) e un reagente neutro colipidico (p3000)
LIVE/DEAD AquaInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies7851Gradiente di densità medio
Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi KitThermoFisher Scientific12748412Kit di maxi-preparazione
NEBNext Mastermix PCR 2X ad alta fedeltàNew England BioLabsM0541SMastermix PCR ad alta fedeltà
Opti-MEM I Siero ridotto MediumGibco31985-070Siero ridotto medium
pCMVR8.74AddGene22036Plasmide di confezionamento lentivirale
Pennicillina-streptomicina-glutammina (100X)Life Technologies10378-016
pMD2.GAddGene12259involucro VSV-G che esprime
plasmideRicerca innovativaISERABHI
PuromicinaMillipore SigmaP8833
Kit di estrazione del gel QIAquick Kit di estrazioneQiagen28704Gek Kit
Qucik-DNA Midiprep Plus KitZymo ResearchD4075utilizzato per isolare il gDNA
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Separatore
cellulare automatizzatoRoswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI)Gibco21870092
SepMate-50STEMCELL Technologies85450Provetta di separazione a gradiente di densità
Acetato di sodioInvitrogenAM9740
Sodio azideFisher Scientific71448-16
Anticorpo streptavidina (PE)BioLegend405203Anticorpo secondario utilizzato per il rilevamento CAR
T100 TermociclatoreBio-Rad1861096
Ultracentrifuga (Optima XPN-80)BeckmanCoulterA99839
Sistemi di filtraggio sottovuoto, 0,22 &; mThermoFisher Scientific567-0020
Sistemi di filtraggio sottovuoto, 0,45 &; mThermoFisher Scientific165-0045
X-VIVO 15 Terreno di coltura per cellule ematopoietiche senza sieroLonza04-418QTerreno per cellule ematopoietiche
Kit di isolamento delle cellule T umane con Siero AB umano aggregato con il

Riferimenti

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