Qui, presentiamo un protocollo per la derivatizzazione di dispositivi medici con terapie proteiche coniugando terapie proteiche a una membrana di alcol polivinilico colata su dispositivi medici. La coniugazione di terapie a base di proteine consente una somministrazione localizzata e concentrata ed è un approccio conveniente che richiede quantità di farmaco molto inferiori per il dosaggio, riducendo al minimo gli effetti fuori bersaglio.
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Articolo metodologico
Convalida della coniugazione dell'agente terapeutico a dispositivi medici rivestiti di alcool polivinilico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le terapie a base di proteine sono spesso limitate dalla loro via di somministrazione e dall'incapacità di confinarle nel loro sito d'azione. Un approccio innovativo che abbiamo sviluppato consiste nel legare in modo covalente le terapie proteiche ai dispositivi medici, consentendo una somministrazione più localizzata e altamente concentrata di questi agenti al sito d'azione previsto. Questo studio mira a valutare se il peptide-2 simile al glucagone (GLP-2) può essere legato in modo covalente ai dispositivi del manicotto di espansione vaginale (VES) e del manicotto di espansione intestinale (IES) in quantità clinicamente rilevanti e misurabili.
I manicotti di espansione sono stati rivestiti con alcol polivinilico (PVA) e reticolati con glutaraldeide/vapore di acido solforico per creare una superficie chimicamente attiva in grado di legare terapie contenenti ammine come il GLP-2. Una curva standard è stata creata legando 250 μg, 100 μg, 50 μg, 25 μg e 0 μg di GLP-2 a pozzetti rivestiti di PVA di una piastra a 24 pozzetti. È stato creato uno standard ELISA utilizzando un anticorpo anti-GLP-2 di coniglio seguito da un anticorpo secondario contro la fosfatasi alcalina IgG di capra più un substrato micropozzetto blu di fosfatasi alcalina. La colorimetria (da giallo a blu a 620 nm) era proporzionale alla concentrazione di anticorpi legati al GLP-2, consentendo il calcolo della concentrazione legata di GLP-2 sui manicotti rivestiti di PVA. L'aggiunta di 50 μg di GLP-2 ai dispositivi IES/VES ha legato una media di 22,69 ± 9,32 μg/cm2 di GLP-2 con una superficie esterna IES/VES (9,425cm2), indicando che il 44% del GLP-2 aggiunto è stato immobilizzato sulle maniche IES/VES rivestite di PVA.
L'attuale dosaggio umano di GLP-2 è di 50 μg/Kg. Poiché ogni manicotto contiene 22 μg, questo è circa il 44% di una dose sistemica in un singolo dispositivo. Questa metodologia consente di aggiungere dosi notevolmente più basse di agenti terapeutici per ottenere lo stesso effetto della somministrazione sistemica del farmaco GLP-2, evitando anche effetti sistemici.
Introduzione
Le terapie a base di proteine come enzimi, anticorpi, citochine, ormoni e fattori di crescita si sono dimostrate altamente efficaci nel trattamento di diverse malattie1. Se miglioriamo la nostra comprensione di come fornire questi agenti terapeutici, potremmo far progredire in modo significativo la biotecnologia per l'applicazione di queste sostanze come medicinali/trattamenti medici1. L'efficacia delle terapie proteiche è limitata dalla loro biodistribuzione, dal costo e dagli effetti fuori bersaglio. Sono stati tentati diversi approcci per migliorare la farmacocinetica e la farmacodinamica delle terapie proteiche, tra cui la PEGilazione, la glicosilazione, la lipidazione e la fusione di altre proteine2. La "targetability" è un'altra preoccupazione perché la maggior parte delle attuali terapie proteiche ha più siti d'azione, con conseguenti effetti fuori bersaglio. In particolare, il targeting di questi farmaci nei siti desiderati potrebbe abbassare la dose terapeutica richiesta e ridurre gli effetti collaterali2. Se si potesse limitare la somministrazione del farmaco al sito d'azione previsto, potrebbe essere possibile migliorare radicalmente il trattamento, limitando al contempo gli effetti collaterali indesiderati "fuori bersaglio" di questi farmaci.
Attualmente vengono utilizzati diversi dispositivi medici che contengono terapie, come gli stent a rilascio di farmaco con un rivestimento antiproliferativo contenente clopidogrel, vincristina e vinblastina per aiutare a prevenire la restenosi e la necessità di ripetere la rivascolarizzazione dopo il cateterismo cardiaco3. Inoltre, sono stati creati stent ureterali biodegradabili a rilascio di farmaco contenenti paclitaxel, doxorubicina, gemcitabina e altri agenti antiproliferativi per aiutare a trattare il carcinoma uroteliale del tratto superiore4. Man mano che questi stent si degradano, i farmaci antitumorali vengono rilasciati localmente in modo controllato, prolungando la somministrazione del farmaco senza la necessità di dosaggi aggiuntivi4. Questa metodologia consente l'effetto a lungo termine dei farmaci antitumorali nel sito d'azione previsto, prevenendo al contempo la necessità di esposizione sistemica, limitando l'azione del farmaco sulle cellule non tumorali e riducendo la tossicità del farmaco. Inoltre, la natura biodegradabile dello stent può anche prevenire la necessità di una procedura di rimozione dello stent4.
La sindrome dell'intestino corto (SBS) è un'altra condizione in cui l'uso di terapie a base di proteine ha mostrato un miglioramento significativo nei pazienti5. La SBS può manifestarsi attraverso vari meccanismi, ma si traduce in una lunghezza intestinale inadeguata, causando malassorbimento e malnutrizione. Terapie, come gli analoghi del peptide 2 simile al glucagone (GLP-2), possono essere utilizzate prima di passare alla gestione chirurgica di questa condizione5. Il GLP-2 umano, un ormone peptidico nutriente sistemico, è prodotto nell'intestino tenue distale e nel colon dalle cellule endocrine di tipo L. Il GLP-2 induce la proliferazione delle cellule della cripta intestinale, promuove la riparazione della mucosa danneggiata, inibisce l'apoptosi delle cellule epiteliali intestinali e migliora l'apporto di sangue intestinale5. Gli analoghi del GLP-2, come teduglutide, sono stati approvati per i pazienti di età pari o superiore a 1 anno per il trattamento della SBS per aiutare ad aumentare l'adattamento intestinale naturale6. Naturalmente, l'adattamento intestinale può richiedere anni e si traduce in uno svuotamento gastrico ritardato per aumentare il tempo di assorbimento e in un aumento del diametro dovuto alla dilatazione intestinale per aumentare la superficie di assorbimento7. Gli analoghi del GLP-2 hanno la stessa attività farmacologica del GLP-2 naturale pur avendo una struttura più stabile, consentendo un'emivita più lunga e una maggiore affinità con i bersagli5. Attualmente, il costo annuale di teduglutide è di $ 295.000 e il dosaggio del paziente è di 0,05 mg / kg al giorno5. Gli effetti collaterali di teduglutide includono nausea, vomito, diarrea, dolore addominale, perdita di peso, polipi gastrointestinali e aumento della crescita dei tumori esistenti5.
In precedenza, il nostro laboratorio ha dimostrato che il dispiegamento di un manicotto di espansione intestinale (IES) (Figura 1) era in grado di produrre un allungamento immediato del 36,2% dell'intestino tenue ex vivo e un allungamento del 30,2% dell'intestino tenue dopo un mese di dispiegamento in vivo 6,8. Questo dispositivo potrebbe diventare una terapia per i pazienti affetti da SBS che potrebbe ridurre la dipendenza dalla nutrizione parenterale. La capacità di bioconiugare le terapie con il dispositivo IES potrebbe migliorare ulteriormente la capacità di enterogenesi di distrazione aggiungendo l'agonista della crescita della mucosa intestinale GLP-2 al dispositivo. Le membrane di alcol polivinilico (PVA) sono polimeri idrofili che possono essere preparati sciogliendo il PVA in acqua, colandolo su un supporto strutturale e quindi reticolando con la glutaraldeide utilizzando l'acido solforico come catalizzatore9. Queste nanoparticelle di idrogel hanno dimostrato di avere un potenziale come sistemi di somministrazione di farmaci attraverso la diffusione del farmaco, il rigonfiamento della matrice di idrogel e la reattività chimica del farmaco/matrice10. Il PVA è stato approvato dalla FDA per l'uso clinico nell'uomo grazie alla sua eccellente biocompatibilità e sicurezza11. La polimerizzazione del PVA dà luogo a gruppi terminali che consentono la bioconiugazione12.
I dispositivi IES/VES hanno una lunghezza di 3 cm con una superficie esterna di 9.425 cm2 in grado di fondere con membrane PVA. Queste membrane PVA possono essere bioconiugate con GLP-2 per consentire la somministrazione localizzata e concentrata di agenti terapeutici. Abbassando la dose richiesta del farmaco e bypassando la necessità di somministrazione sistemica, evitando effetti negativi fuori sede del trattamento. Questo può aiutare a mitigare il costo di questi farmaci costosi richiedendo un dosaggio inferiore e il rilascio ritardato del farmaco può ridurre la frequenza di dosaggio, riducendo ulteriormente i costi. Il rivestimento del dispositivo IES con GLP-2 potrebbe ridurre i dosaggi richiesti, far risparmiare denaro ai pazienti, evitare la somministrazione sistemica, prevenire gli effetti negativi del trattamento e mantenere una somministrazione continua del farmaco al sito target. Questo rapporto valuta la misura in cui una proteina terapeutica, come il GLP-2, può essere legata covalentemente a dispositivi medici come i dispositivi IES/VES in quantità fisiologicamente significative per fornire il beneficio locale di questi farmaci evitando effetti fuori bersaglio.
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Protocollo
NOTA: Le sezioni 1 e 2 vengono completate contemporaneamente. Il rivestimento con PVA e la reticolazione della membrana PVA devono essere eseguiti contemporaneamente sia per i manicotti di espansione che per la piastra a 24 pozzetti. Ciò consente loro di essere pronti allo stesso tempo a creare la curva standard con la piastra a 24 pozzetti per utilizzare l'assorbanza per calcolare la concentrazione di GLP-2 di ciascun manicotto.
1. Creazione di dispositivi IES e VES rivestiti GLP-2
- Preparare la soluzione di PVA al 5% aggiungendo 5 g di PVA in 100 ml di acqua deionizzata. Per aiutare a sciogliersi, prendi in considerazione l'idea di mescolare su una piastra. Quindi, preparare la soluzione di GLP-2 da 1 mg/mL aggiungendo 1 mg di GLP-2 in 1 mL di acqua deionizzata.
- Precontrarre i manicotti di dilatazione intestinale e i manicotti di dilatazione vaginale su una pipetta di vetro, stabilizzando le estremità con pipette di plastica tagliate per adattarsi perfettamente alla pipetta di vetro attorno ai manicotti precontratti.
- Dipingi le maniche precontratte con il PVA preconfezionato al 5% usando un pennello piccolo. Dopo aver dipinto una mano di PVA, lasciare asciugare le maniche a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti, quindi dipingere un'altra mano per un totale di 5 mani di PVA su ciascuna manica.
- Dopo che la5a mano si è asciugata, posizionare le maniche precontratte in un essiccatore sotto una cappa di sicurezza chimica per consentirne la reticolazione a RT. Avviare la reticolazione aggiungendo 3 mL di glutaraldeide al 25% e 3 mL di acido solforico al 94%-98% per separare i becher aperti nell'essiccatore per consentire ai vapori di reagire e reticolare le membrane PVA sulle maniche.
- Dopo aver reticolato i manicotti nella camera per 48 ore, estrarli dalla camera e lasciare evaporare la glutaraldeide dai manicotti per 15 minuti.
- Quindi, aggiungere 50 μl della soluzione di GLP-2 da 1 mg/mL pipettando accuratamente su ciascun manicotto. Lasciare asciugare per 30 minuti a RT prima di rimuovere i manicotti pretrattati dalla pipetta di vetro e aggiungere ciascun manicotto al rispettivo pozzetto sulla piastra a 24 pozzetti.
2. Creazione della piastra a 24 pozzetti rivestita GLP-2
- Per creare la curva standard di GLP-2 legata al PVA, pipettare 50 μl di PVA al 5% sul fondo di 18 dei pozzetti destinati all'uso di una piastra a 24 pozzetti. Lasciare 6 pozzetti vuoti per contenere i dispositivi IES e VES (3 per ogni tipo di dispositivo).
- Lasciare asciugare lo strato di PVA sulla piastra a 24 pozzetti per una notte in forno a 120 °C.
- Posizionare la piastra a 24 pozzetti in un essiccatore sotto una cappa di sicurezza chimica per consentire al PVA di reticolare per 48 ore a RT. Avviare la reticolazione aggiungendo 3 mL di glutaraldeide al 25% e 3 mL di acido solforico al 94%-98% per separare i becher aperti in modo che i vapori possano reagire all'interno della camera per reticolare il PVA sulla piastra a 24 pozzetti.
- Dopo la reticolazione per 48 ore, rimuovere la piastra a 24 pozzetti dalla camera e lasciare evaporare la glutaraldeide dalla piastra per 15 minuti.
- Quindi, creare un gradiente di concentrazione aggiungendo 250 μL, 100 μL, 50 μL, 25 μL e 0 μL di soluzione GLP-2 da 1 mg/mL nei pozzetti etichettati, creando la piastra a 24 pozzetti con 3 pozzetti per ogni concentrazione di GLP-2 (250 μg, 100 μg, 50 μg, 25 μg e 0 μg) e 3 pozzetti per ogni tipo di manicotto (IES e VES).
3. Creazione della curva standard e della concentrazione GLP-2 del manicotto
- Dopo che le rispettive diluizioni di GLP-2 sono state aggiunte ai pozzetti e le maniche rivestite di farmaco sono state aggiunte ai pozzetti, refrigerare la piastra per una notte a 4 °C per consentire il legame del farmaco.
- Il giorno successivo, aggiungere 2 ml di 1 mg/ml di latte in polvere in una soluzione bloccante l'acqua deionizzata in ciascun pozzetto per 1 ora. Dopo il blocco, lavare ogni pozzetto 3 volte con PBS per 5 minuti ogni lavaggio.
- Preparare la soluzione di anticorpi anti-GLP-2 di coniglio aggiungendo 40 μL di anticorpi anti-GLP-2 di coniglio in 50 mL di acqua deionizzata. Quindi, aggiungere 2 mL della soluzione di anticorpi GLP-2 di coniglio a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e conservare in frigorifero per una notte a 4 °C.
- Dopo l'incubazione degli anticorpi primari, lavarsi bene altre 3 volte con PBS per 5 minuti a ogni lavaggio. Preparare la fosfatasi alcalina IgG anti-coniglio prodotta in una soluzione di anticorpi secondari di capra aggiungendo 20 mL di anticorpi secondari in 40 mL di acqua deionizzata. Quindi, aggiungere 2 ml di soluzione di anticorpi secondari a ciascun pozzetto e lasciarlo riposare per 2 ore a RT.
- Aspirare la soluzione di anticorpi secondari e lavare ogni pozzetto con un altro lavaggio 3x PBS per 5 minuti ciascuno. Quindi, aggiungere il substrato del micropozzetto blu fosfatasi alcalina a ciascun pozzetto.
- Lasciare che la fosfatasi alcalina coniugata all'anticorpo secondario reagisca con il substrato per 20 minuti a RT. Man mano che la reazione procede, osserva che il colore della soluzione cambia da giallo a blu.
- Arrestare la reazione pipettando 200 μL di soluzione da ciascun pozzetto e inserirlo in una piastra da 96 pozzetti etichettata come la piastra da 24 pozzetti. Una volta che il reagente viene rimosso dalla piastra a 24 pozzetti con la membrana PVA coniugata all'enzima fosfatasi alcalina, la reazione si interrompe e il colore non cambia.
- Leggere la piastra a 96 pozzetti utilizzando un lettore di micropiastre ad assorbanza alla lunghezza d'onda di 620 nm per generare la curva standard e calcolare la concentrazione di GLP-2 sui manicotti rivestiti in PVA.
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Risultati
Questo protocollo descrive il rivestimento e la reticolazione dei dispositivi IES e VES con PVA per consentire la coniugazione di GLP-2. La Figura 2 mostra la curva standard generata per determinare la concentrazione di GLP-2 su ciascun dispositivo. La Figura 3 mostra la concentrazione di GLP-2 di ciascun dispositivo IES e VES e la concentrazione dei pozzetti utilizzati per la curva standard. I manicotti avevano una concentrazione media di GLP-2 di 22,69 ± 9,32 ...
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Discussione
Presentiamo qui una metodologia per legare terapie a base di proteine, come il GLP-2, a dispositivi medici rivestiti di PVA e reticolati. La concentrazione del GLP-2 legato è stata determinata mediante la creazione di una curva di concentrazione standard di GLP-2 su piastre a 24 pozzetti rivestite di PVA mediante l'aggiunta di anticorpi anti-GLP-2 di coniglio, fosfatasi alcalina IgG di capra e substrato di micropozzetti blu fosfatasi alcalina. L'anticorpo secondario coniugato a un enzima...
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Dichiarazioni
Jonathan Steven Alexander e Christen J. Boyer detengono il brevetto US10537659B2, dispositivi medici e metodi di attivazione dell'alcol polivinilico stampati in 3D (2017). Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata da R. Keith White, MD, tramite il Department of Surgery John C. McDonald Chair Fund, W. Reid Grimes, MD per il finanziamento tramite il Department of Surgery Whitney Boggs Endowed Professorship Fund e la sovvenzione LSU LIFT2, HSCS-2022-LIFT-002.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| IgG anti-coniglio (molecola intera)... Anticorpo perossidasi prodotto in capra | Sigma-Aldrich | A0545-1ML | |
| BluePhos Microwell Substrato Kit | Sera Care | 5120-0059 | |
| GenClone 25-107, 24 pozzetti per colture cellulari Piastre a fondo piatto, Trattato TC, 100 piastre/unità | Genesee Scientific | 25-107 | |
| GLP-2 Anticorpo monoclonale di coniglio ricombinante (3K3P5) | Invitrogen | MA5-42869 | |
| Peptide-2 simile al glucagone (GLP-2) (1-33), ratto | Echelon Biosciences | 195262-56-7 | |
| Glutaraldeide, soluzione acquosa al 25% | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| Nalgene Essiccatore in polipropilene con rubinetto | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
| Poly(alcol vinilico) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| Acido solforico (grado TraceMetal), Fisher Chemical | Fischer Scientific | A510-P212 |
Riferimenti
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- Jensen, B. E., Dávila, I., Zelikin, A. N. Poly(vinyl alcohol) physical hydrogels: Matrix-mediated drug delivery using spontaneously eroding substrate. J Phys Chem B. 120 (26), 5916-5926 (2016).
- Teduglutide for short bowel syndrome. Aust Prescr. 43 (2), 72-73 (2020).
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Ristampe e permessi
