Qui, presentiamo un protocollo per studiare l'interazione di macrofagi primari derivati da monociti umani con uno sferoide tumorale in una matrice di collagene I tridimensionale (3D), con la possibilità di confrontare l'impatto delle proprietà solubili e fisiche del microambiente sull'invasione cellulare.
Articolo metodologico
Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'interazione tra cellule immunitarie e tumorali e il loro rispettivo impatto sulle metastasi rappresenta un aspetto importante della ricerca sul cancro. Finora, sono disponibili solo pochi protocolli che consentono un'approssimazione in vitro della situazione in vivo . Qui, presentiamo un nuovo approccio per osservare l'impatto dei macrofagi umani sull'invasività delle cellule tumorali, utilizzando sferoidi tumorali di cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule H1299 incorporate in una matrice di collagene I tridimensionale (3D). Con questa configurazione di co-coltivazione, abbiamo testato l'impatto della deplezione di fattori regolatori nei macrofagi basata su piccoli RNA interferenti (siRNA) sull'invasione 3D delle cellule tumorali dallo sferoide tumorale rispetto ai controlli. Questo metodo consente di determinare diversi parametri, come l'area sferoidale o il numero di cellule tumorali invasive, e quindi di rilevare le differenze nell'invasione delle cellule tumorali. In questo articolo, presentiamo la rispettiva configurazione, discutiamo l'analisi successiva, nonché i vantaggi e le potenziali insidie di questo metodo.
Introduzione
I macrofagi sono una parte importante del sistema immunitario innato e rappresentano la prima linea di difesa in molte condizioni patologiche, come le infezioni o l'eliminazione dei detriti cellulari dopo le lesioni. Negli ultimi decenni, l'impatto delle cellule immunitarie sulla progressione del cancro è stato un aspetto di molti studi. Di conseguenza, è stato dimostrato che i macrofagi possono facilitare le metastasi associandosi ai tumori primari e diventando macrofagi associati al tumore (TAM)2. I macrofagi possono modificare il loro profilo di espressione quando esposti alle cellule tumorali, favorendo la fuga delle metastasi dal sistema immunitario3. Inoltre, è stato dimostrato che le cellule tumorali possono utilizzare i difetti della matrice extracellulare (ECM) generati dai macrofagi per sfuggire al tumore primario e che il loro comportamento è anche manipolato dall'assorbimento di fattori secreti, comprese le vescicole extracellulari (EV)4,5. Questa interazione di aspetti fisici e chimici richiede lo sviluppo di nuovi metodi per caratterizzare l'impatto delle cellule immunitarie sulla diffusione del tumore e sul microambiente circostante.
Sono stati sviluppati diversi approcci per studiare il comportamento delle cellule immunitarie nel contesto delle metastasi in vivo6. Tuttavia, come per tutti gli esperimenti, compresi gli animali, è necessaria una licenza per la sperimentazione animale e una struttura per animali; Questi approcci richiedono già molto sviluppo e preparazione. Inoltre, l'analisi è spesso complicata, soprattutto per quanto riguarda l'imaging di cellule vive, poiché non tutti i campioni sono accessibili per la maggior parte delle configurazioni microscopiche. Lo sviluppo di nuovi metodi per testare le ipotesi in condizioni di vitro qualificate è anche necessario e tempestivo, poiché la scienza e la società mirano a una ricerca senza animali per ridurre il numero di animali sacrificati.
In una recente pubblicazione7, abbiamo studiato l'impatto dei macrofagi umani primari sull'invasività delle cellule tumorali invasive da uno sferoide tumorale. A questo scopo, abbiamo stabilito un test di co-invasione macrofago-tumore sferoide basato sul collagene I. In questo contesto, ci siamo proposti di chiarire il ruolo delle vie di riciclo rapido della metalloproteinasi della matrice di tipo 1 di membrana (MT1-MMP) nei macrofagi. Abbiamo testato i macrofagi che sono stati impoveriti per la chinesina super processiva KIF16B, che abbiamo identificato come uno dei principali motori del riciclo MT1-MMP, e il loro impatto sulle capacità invasive delle cellule H1299-Green Fluorescent Protein (GFP) da uno sferoide solido. I macrofagi depleti di KIF16B mostrano livelli ridotti di MT1-MMP legato alla membrana sulla loro superficie, mentre le cellule H1299 stesse non sono state trattate.
Per quanto ne sappiamo, non è stato descritto alcun metodo simile che consenta l'imaging e l'analisi completa della co-invasione macrofagi-tumore-sferoide. Sebbene nella nostra recente pubblicazione7 ci siamo concentrati sull'analisi di cellule che migrano individualmente distanti dallo sferoide, il test consente molteplici ulteriori indagini come il numero di filamenti invasivi, le proteine coinvolte nell'interazione cellula tumorale-macrofago, la quantità di degradazione del collagene I o altre proprietà sferoidi come la lunghezza del suo perimetro.
Protocollo
Questo protocollo prevede l'uso di macrofagi umani primari derivati da campioni di sangue di donatori. Secondo le linee guida etiche del Centro medico universitario di Amburgo-Eppendorf, sono stati raccolti campioni di sangue e i donatori sono stati risarciti. L'ulteriore elaborazione dei campioni è stata eseguita seguendo le linee guida di sicurezza fornite (ad esempio, il trattamento di campioni non testati). Il lavoro con i macrofagi umani primari in questo studio è stato giudicato ineccepibile da Ärztekammer Hamburg, Germania.
1. Generazione di sferoidi tumorali H1299 in un approccio senza scaffold (3 giorni in anticipo)
- Coltivare le cellule tumorali in un incubatore a 37 °C con 5% di CO2 in fiasche di coltura cellulare da 25 cm2 (vedi Tabella dei materiali) con terreno di coltura delle cellule tumorali (terreno delle aquile modificato di Dulbecco [DMEM] + 1% penicillina-streptomicina [penna-streptomica] + 10% siero fetale bovino [FBS] + 0,1 mM di aminoacidi non essenziali + 2 mM di L-glutammina) fino all'80% di confluenza.
- Lavare una volta le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS) e staccarle aggiungendo 1 mL di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,25%, rosso fenolo) per 2 minuti. Arrestare la reazione enzimatica aggiungendo 2 mL di terreno di coltura delle cellule tumorali e controllare il distacco al microscopio ottico.
NOTA: È importante che le cellule tumorali siano separate e che non siano presenti cluster di cellule tumorali. - Trasferire la sospensione cellulare in una provetta di reazione da 15 mL e centrifugarla a 245 x g per 5 minuti. Successivamente, rimuovere la soluzione di tripsina mediante pipettaggio o utilizzando una pompa, lavare successivamente il pellet aggiungendo 5 mL di DPBS e centrifugarli nuovamente nelle stesse condizioni.
- Risospendere il pellet in 5 mL di terreno cellulare tumorale e contare le cellule, ad esempio con una camera di Neubauer. Trasferire 8.000 cellule H1299-GFP in una piastra a bassissima adesione a 96 pozzetti (vedere la Tabella dei materiali) in un volume finale di 25 μL di terreno cellulare tumorale.
- Incubare la camera per 3 giorni nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2. Controllare l'uniformità degli sferoidi al microscopio. Non prendere in considerazione sferoidi con una densità inferiore o singole cellule tumorali non attaccate per ulteriori esperimenti.
2. Preparazione di macrofagi umani primari da campioni di sangue di donatore
- Se i campioni di sangue del donatore non vengono utilizzati immediatamente per l'isolamento cellulare, conservarli a 4 °C, agitandoli.
- Trasferire 20 mL di sangue da una sacca per trasfusioni in una provetta di reazione da 50 mL.
- Successivamente, preparare una nuova provetta da 50 mL e aggiungere 15 mL di terreno di separazione linfocitaria (LSM).
- Aggiungere con cautela i 20 mL di sangue in ciascuna provetta contenente LSM senza mescolare e centrifugarla a 450 x g per 30 minuti a 4 °C.
- Nel frattempo, preparare una nuova provetta da 50 ml e aggiungere 10 ml di terreno freddo del Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640.
- Dopo la centrifugazione, trasferire la fase bianca densa ("buffy coat") all'interno della provetta contenente sangue nella provetta contenente RPMI preparata e aggiungere il volume a 50 mL con RPMI freddo.
- Centrifugare la sospensione a 450 x g per 10 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 10 mL di RPMI freddo.
- Centrifugare nuovamente la miscela a 450 x g per 10 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 50 mL di RPMI.
- Centrifugare nuovamente il campione a 450 x g per 10 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1,5 mL di tampone monocitario freddo (0,5% di albumina sierica umana + 5 mM EDTA in 25 mL di DPBS).
- Mettere la sospensione cellulare su ghiaccio, aggiungere 250 μL di microsfere anti-CD14 e incubare per 15 minuti su ghiaccio.
- Preparare una colonna di separazione mediante l'aggiunta di un filtro su un rack separatore magnetico e aggiungere 900 μl di tampone monocitario per l'equilibratura.
- Versare la sospensione cellulare sul filtro e lasciarla fluire in un tubo di scarico per gravità.
- Lavare la colonna, che contiene le cellule legate alle microsfere magnetiche, aggiungendo 1 mL di tampone monocitario.
- Preparare una provetta fresca da 50 mL contenente 20 mL di RPMI e riposizionare la provetta di scarto sotto la colonna.
- Aggiungere 3 mL di tampone per monociti alla colonna, rimuoverlo dal rack magnetico e applicare il timbro.
- Premere le cellule nella provetta da 50 mL preparata e riempirla fino a 30 mL di volume con RPMI.
- Contare le cellule (ad es. utilizzando una camera di conteggio Neubauer) al microscopio ottico e regolare il numero di cellule aggiungendo RPMI a 2 x 106 cellule/mL.
- Seminare 1 mL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una camera a 6 pozzetti e incubare la piastra per 2-4 ore a 37 °C e 5% di CO2.
- Controlla se le cellule hanno aderito correttamente e sostituisci l'RPMI con 1,5 mL di monomedium (20% di siero umano + 1% di pen-strep in RPMI).
- Cambiare il terreno dopo 24 ore di incubazione. In queste condizioni, i monociti si differenziano in macrofagi entro 6 giorni.
3. Preparazione dei macrofagi
- Al giorno dell'esperimento, staccare i macrofagi con una quantità di accutasi appropriata per le singole condizioni di coltura. Ad esempio, utilizzare 500 μL di accutasi se le cellule vengono seminate in un piatto a 6 pozzetti. Incubare le cellule per circa 40 minuti all'interno della soluzione, lavarle una volta con 2 mL di DPBS e contarle con una camera Neubauer.
- Per uno sferoide, diluire il numero desiderato di macrofagi in 40 μL di miscela di collagene I (2,5 mg/mL di collagene I di coda di ratto) e mescolarli facendo roteare brevemente la provetta di reazione. Negli esperimenti condotti, 200.000 cellule/mL hanno mostrato una differenza rilevabile sull'invasione delle cellule tumorali. Mantieni la miscela di collagene-cellule sul ghiaccio, poiché inizierà a polimerizzare rapidamente a temperatura ambiente (RT).
4. Impostazione del saggio di co-invasione
NOTA: A seconda del formato della camera di imaging, dello scopo dell'analisi o della rispettiva configurazione di imaging, potrebbe essere necessario trasferire lo sferoide tumorale dalla piastra a bassissima adesione e adattare i valori di collagene e terreno. I passaggi seguenti descrivono la configurazione di un campione in un vetrino μ a 15 pozzetti.
- Per prima cosa, lavare lo sferoide aggiungendo 300 μl di DPBS. Tagliare la punta di una punta per pipetta blu da 1 ml e riprendere lo sferoide con DPBS. Dopo che l'aspirazione dello sferoide si è depositato nella punta, spingere brevemente la pipetta sul fondo della camera di imaging per trasferire il tumore-sferoide mediante tensione superficiale.
NOTA: È importante notare che l'attrito sulle punte non modificate potrebbe disturbare l'integrità dello sferoide. - Rimuovere il più possibile i residui di DPBS trasferiti con lo sferoide mediante pipettaggio.
- Aggiungere rapidamente 40 μl di miscela di collagene I/macrofagi (vedere il passaggio 3.4) alla camera di imaging che contiene lo sferoide H1299-GFP.
- Trasferire la piastra in un incubatore cellulare e incubare la piastra per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2 in condizioni umide per polimerizzare completamente la miscela di collagene.
- Dopo la polimerizzazione, aggiungere con cautela 25 μL di terreno tumorale a ciascun pozzetto e incubare la piastra per 3 giorni nell'incubatore nelle condizioni precedentemente descritte. Se necessario, acquisire un'immagine del campione vivo con un microscopio a scansione laser nei punti temporali desiderati.
5. Fissazione e colorazione aggiuntive
- Per eseguire la colorazione in immunofluorescenza, fissare i macrofagi e gli sferoidi H1299-GFP all'interno della matrice di collagene I. Innanzitutto, rimuovere con cura il surnatante da ciascun campione con una pompa senza toccare la matrice.
NOTA: Per evitare la distruzione del campione, il surnatante può essere rimosso anche mediante pipettaggio manuale senza l'uso di una pompa. - Aggiungere 50 μl di formaldeide al 3,7% in DPBS in ciascun pozzetto e incubare i campioni per 5 minuti con ghiaccio. Successivamente, rimuovere la soluzione fissativa e aggiungere nuovamente 50 μl di soluzione di fissaggio fresca. Questo passaggio è importante per ottenere un livello di formaldeide più uniforme all'interno del pozzo. Incubare i campioni per una notte a 4 °C.
NOTA: A seconda della quantità di collagene che mescolo, i tempi di incubazione potrebbero estendersi a diverse ore. - Rimuovere il fissativo il giorno successivo e lavare i campioni rimuovendo ripetutamente almeno due volte il DPBS a seconda del volume della camera di imaging. Incubarli brevemente per 5 minuti con ghiaccio su uno shaker prima di rimuovere il DPBS mediante pipettaggio. I campioni sono ora pronti per la colorazione.
- Colorare i campioni aggiungendo una miscela 1:100 di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (1 mg/mL, per colorare i nuclei) e falloidina 568 (per colorare la F-actina) in DPBS per almeno 30 minuti e lavarli due volte con DPBS prima dell'imaging.
6. Imaging e analisi di diversi parametri di crescita tumorale
NOTA: I seguenti passaggi possono essere eseguiti sia per i campioni di imaging di cellule vive fissate.
- Per l'osservazione dello sferoide tumorale, utilizzare un microscopio a scansione laser invertito dotato di un obiettivo 10x che consente l'imaging di una pila z di circa il terzo inferiore dello sferoide.
NOTA: A causa dello spessore del campione, potrebbe essere vantaggioso anche un microscopio a 2 fotoni. Per un'identificazione ottimale delle singole cellule, potrebbero essere necessari una maggiore potenza laser e un tempo di esposizione. - Dopo l'acquisizione, combinare le pile mediante proiezione z utilizzando Fiji, che è il software ImageJ (Fiji). Inoltre, elaborare il canale risultante del segnale H1299-GFP applicando una soglia automatica (ad esempio, la soglia automatica di Huang) e rimuovere il rumore residuo rimuovendo le macchie dell'immagine a seconda della quantità di fondo e dell'intensità del segnale.
- Misura i parametri degli sferoidi usando le Fiji.
- Area: Misura la dimensione dello sferoide con lo strumento Bacchetta .
- Perimetro: includi il perimetro nelle impostazioni di misurazione.
- Diametro: Includi il diametro del Feret nelle impostazioni di misurazione.
- Circolarità: Includi i descrittori di forma nelle impostazioni di misurazione.
- Misura i parametri delle singole cellule tumorali utilizzando le Fiji.
- Misura il numero di cellule invasori.
- Scegli lo sferoide centrale con lo strumento Bacchetta ed elimina il segnale. Questo rimuoverà dall'analisi lo sferoide e tutti i segnali connessi delle cellule, che sono ancora attaccate allo sferoide.
- Successivamente, utilizzare lo strumento Analizza particelle o quantificare tutti i singoli segnali residui.
NOTA: Il risultato sarà il numero di cellule tumorali invasori. Inoltre, il risultato potrebbe anche mostrare l'area rappresentativa coperta dalle cellule tumorali ed essere interpretato come invasione collettiva o invasione di singole cellule, a seconda delle dimensioni dell'area. Per convalidare ulteriormente il numero di cellule tumorali invasori, è stato possibile posare una maschera delle particelle analizzate sopra il canale DAPI e contare i nuclei.
- Misura il numero di cellule invasori.
- Inoltre, valuta i risultati utilizzando un programma statistico come GraphPad Prism o Microsoft Excel.
NOTA: Questo protocollo ha dimostrato di essere robusto e flessibile. È stato utilizzato nel nostro laboratorio più di 50 volte, sempre con macrofagi umani primari provenienti da almeno 3 donatori, per tenere conto della variabilità del donatore. Nella sua forma attuale, il protocollo ha dimostrato di portare a un tasso di successo del 90-95%. Tuttavia, poiché la configurazione è complessa, anche i risultati variabili potrebbero essere un risultato, poiché l'interazione dei macrofagi per ogni sferoide è individuale. Pertanto, si suggerisce di eseguire l'esperimento almeno 3 volte con 5 sferoidi per ottenere un risultato statisticamente significativo.
Risultati
La Figura 1 mostra uno sferoide H1299-GFP ripreso nei rispettivi giorni di incubazione in una matrice di collagene I. Una rispettiva immagine in campo chiaro, scattata al giorno 0, mostra anche i macrofagi umani primari cocoltivati con lo sferoide. L'immagine rappresentativa registrata il giorno 3 dell'esperimento viene ingrandita dopo l'elaborazione. Sono indicati diversi parametri che possono essere analizzati, tra cui il numero di cellule invasori, i siti di invasione collettiva e il perimetro sferoidale. La tabella inclusa mostra i risultati ottenuti da questa immagine. Il numero di segnali rilevati corrisponde all'impressione visiva. Non sono visibili interruzioni dello sferoide centrale, indicando un'effettiva invasione di singole cellule tumorali piuttosto che cellule derivate da detriti sferoidi. I risultati di diversi sferoidi e condizioni possono ora essere confrontati tramite analisi statistiche.
Figura 1: Risultati rappresentativi. (Pannello superiore) Imaging sferoidale H1299-GFP al giorno 0, giorno 1, giorno 2 e giorno 3 di incubazione in una matrice di collagene I. (Pannello centrale sinistro) Un'immagine in campo chiaro dello sferoide che mostra i macrofagi umani primari cocoltivati. (Pannello centrale a destra) Un'immagine rappresentativa acquisita al giorno 3 ingrandita dopo l'elaborazione, che mostra i diversi parametri analizzabili (perimetro sferoidale in rosso; tracciato manualmente per una migliore visualizzazione). (Pannello inferiore) I risultati ottenuti dall'immagine nel pannello centrale a destra. Nota: i macrofagi non sono visibili, poiché è stato registrato solo il canale GFP per chiarire il comportamento delle cellule tumorali. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussione
L'invasione delle cellule tumorali rimane un argomento importante ma poco studiato nel contesto della co-invasione delle cellule immunitarie come i macrofagi. L'invasione collettiva e individuale delle cellule tumorali sono processi critici durante le metastasi e hanno dimostrato di ridurre il tasso di sopravvivenza dei pazienti oncologici a causa della molteplicità di infestazioni di diversi organi 8,9. Gli studi in vivo sono complessi e sono limitati ai laboratori con accesso alle strutture di stabulazione degli animali. Inoltre, è anche difficile controllare le condizioni in vivo o manipolare in modo specifico i singoli aspetti. Pertanto, la necessità di un sistema più accessibile rimane essenziale per rispondere alle domande di base nella prima linea di ricerca.
Con il metodo qui presentato, abbiamo sviluppato un modo in cui i) il comportamento delle cellule immunitarie e ii) delle cellule tumorali, iii) la crescita e lo sviluppo di uno sferoide solido e iv) l'impatto delle cellule nel microambiente tumorale circostante (TME) sui componenti della ECM possono essere ulteriormente analizzati. Può essere utilizzato per confrontare l'impatto dei macrofagi modificati (ad esempio, impoveriti per regolatori specifici dal trattamento con siRNA) sull'invasività delle singole cellule tumorali da uno sferoide solido. Al momento non è chiaro se il riarrangiamento fisico del TME o i fattori secreti rappresentino la causa principale del comportamento osservato delle cellule tumorali e deve essere analizzato in modo più dettagliato.
Inoltre, anche le cellule tumorali stesse potrebbero essere manipolate, ad esempio mediante trattamento con siRNA o knockout di specifici regolatori. Inoltre, l'analisi può essere migliorata confrontando il numero di nuclei contati all'interno del profilo cellulare identificato per consentire una determinazione più precisa delle cellule tumorali invasori.
Abbiamo utilizzato questo test per determinare l'impatto dei macrofagi nel TME sull'invasione delle cellule tumorali. Tuttavia, va anche notato che è probabile che le cellule tumorali influenzino l'attività dei macrofagi, probabilmente attraverso fattori secreti all'interno del terreno. Sarebbe quindi anche utile identificare i cambiamenti nei macrofagi, come lo stato di polarizzazione alterato (M1 vs. M2) mediante colorazione in immunofluorescenza utilizzando i rispettivi anticorpi. In passato, il confronto tra le cellule che crescono in monostrati e quelle coltivate in un ambiente 3D ha mostrato differenze significative nei loro profili di espressione10.
Inoltre, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) di sottopopolazioni di macrofagi e la loro integrazione nella procedura sperimentale potrebbero essere istruttivi. Infine, ma non meno importante, l'imaging più dettagliato delle aree di contatto in cui i macrofagi interagiscono con le cellule tumorali o con la superficie sferoidale tumorale potrebbe portare all'identificazione di ulteriori meccanismi rilevanti per l'invasione e l'interazione 3D.
Da notare che non può essere controllato completamente è il posizionamento preciso dello sferoide al centro del pozzetto dopo l'aggiunta della miscela di collagene. La quantità di collagene sotto lo sferoide è particolarmente difficile da regolare. In questo caso, sono stati stabiliti altri metodi per consentire un posizionamento preciso dello sferoide, ad esempio sopra stampi di agarosio con un numero di campioni più alto11. Tuttavia, poiché il rilascio di citochine è un meccanismo comune, tutti gli sferoidi all'interno di questo test multi-sferoide sono esposti a fattori secreti e il numero di cellule immunitarie che agiscono su un singolo sferoide è difficile da controllare.
Una limitazione fondamentale di questo protocollo è la capacità delle linee cellulari tumorali di formare sferoidi uniformi, quindi è applicabile solo a un sottoinsieme di linee cellulari. Ad esempio, le cellule del melanoma MeWo formano strutture 3D irregolari, simili a fogli, ma non sferoidi uniformi.
Va inoltre notato che il test è altamente adattabile, poiché molte delle sue caratteristiche possono essere modificate, come il materiale ECM, il numero di cellule o aggiungendo fattori specifici come le citochine al surnatante. Dovrebbe, quindi, essere altamente adatto per gli studi iniziali in vitro dell'interazione cellula tumorale/cellula immunitaria e può essere adattato alla specifica domanda di ricerca attualmente affrontata.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non esistono interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Andrea Mordhorst per l'eccellente supporto tecnico e la coltura cellulare e Martin Aepfelbacher per il continuo supporto. Il lavoro sull'invasione dei macrofagi nel laboratorio SL è supportato da Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC877/B13; LI925/13-1).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 15 &Angiogenesi a micro-vetrino | ibidi | 81506 | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Fluor 568 Falloidina | ThermoFisher Scientific | A12380 | |
| CD14 Microsfere | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| CO2 Incubatore | Legante | ||
| Collagene I Coda di Ratto | Corning | 354236 | |
| DAPI | AppliChem | ||
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
| DPBS | Anprotec MS01Y71003 | ||
| FBS | Bio& Cella | FBS. S 0613 | |
| Figi | NIH | ImageJ 2 Versione: 2.3.0 / 1.53s | |
| Formaldeide 37% | 252549-500ml | Linea | |
| H1299-GFP | |||
| Gibco | 25030-024 | ||
| Terreno di separazione dei linfociti (LSM) 1077 | PromoCell | C-44010 | |
| Colonne MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| aminoacidi non essenziali | Sigma-Aldrich | 11140050 | |
| Penna Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 81275-034 | |
| TC-Platte 96 pozzo, BIOFLOAT, R | SARSTEDT | 83,39,25,400 | |
| VORTEX-GENE 2 | Industrie scientifiche |
Riferimenti
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- Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).
- Wenzel, E. M., et al. Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding. Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).
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Ristampe e permessi
